实验35过氧化氢酶的活性测定

植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H2O2发生累积。

H2O2可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。

过氧化氢酶可以清除H2O2，是植物体内重要的酶促防御系统之一。

因此，植物组织中H2O2含量和过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。

本实验用分光光度法测定过氧化氢含量，利用高锰酸钾滴定法和紫外吸收法测定过氧化氢酶活性。

一、过氧化氢含量的测定
【原理】
H2O2与硫酸钛（或氯化钛）生成过氧化物—钛复合物黄色沉淀，可被H２SO4溶解后，在415nm波长下比色测定。

在一定范围内，其颜色深浅与H2O2浓度呈线性关系。

【仪器和用具】
研钵；移液管0.2ml×2支，5ml×1支；容量瓶10ml×7个，离心管5ml×8支；离心机；分光光度计。

【试剂】
100μmol/L H2O2丙酮试剂：取30%分析纯H2O2 57μl，溶于100ml，再稀释100倍；2mol/L 硫酸；5%（W/V）硫酸钛；丙酮；浓氨水。

【方法】
1.制作标准曲线：取10ml离心管7支，顺序编号，并按表40-1加入试剂。

待沉淀完全溶解后，将其小心转入10ml容量瓶中，并用蒸馏水少量多次冲洗离心管，将洗涤液合并后定容至10ml刻度，415nm波长下比色。

2.样品提取和测定：(1)称取新鲜植物组织2~5g（视H2O2含量多少而定），按材料与提取剂1∶1的比例加入4℃下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，转入离心管3000 r/min下离心10min，弃去残渣，上清液即为样品提取液。

(2)用移液管吸取样品提取液1ml，按表35-1加入5%硫酸钛和浓氨水，待沉淀形成后3000rpm/min离心10min，弃去上清液。

沉淀用丙酮反复洗涤3～5次，直到去除植物色素。

(3)向洗涤后的沉淀中加入2mol硫酸5ml，待完全溶解后，与标准曲线同样的方法定容并比色。

3.结果计算：
植物组织中H2O2含量(μmol/g Fw)=
式中 C —标准曲线上查得样品中H 2O 2浓度（μmol ）； V t —样品提取液总体积（ml ）； V 1—测定时用样品提取液体积（ml ）； FW —植物组织鲜重（g ）。

二、过氧化氢酶的活性测定——高锰酸钾滴定法
【原理】
过氧化氢酶（CA T ）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。

R(Fe +2)+H 2O 2==R(Fe +3+OH －
)
R(Fe +3OH －)2+H 2O 2==R(Fe +2)2+2H 2O+O 2
据此，可根据H 2O 2的消耗量或O 2的生成量测定该酶活力大小。

在反应系统中加入一定量（反应过量）的H 2O 2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的H 2O 2
5H 2O 2+2KMnO 4+4H 2SO 4
5O 2+2KHSO 4+8H 2O+2MnSO 4
即可求出消耗的H 2O 2的量。

【仪器和用具】
研钵；三角瓶50ml ×4；酸式滴定管（10ml ）；恒温水浴；容量瓶25ml ×1。

【试剂】
10% H 2SO 4；0.2mol/L 磷酸缓冲液pH7.8；
0.1mol/L 高锰酸钾标准液：称取KMnO 4（AR ）3.1605g ，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml ，用0.1mol/L 草酸溶液标定；
0.1mol/L H 2O 2：市售30% H 2O 2大约等于17.6mol/L ，取30% H 2O 2溶液5.68ml ，稀释至1000ml ，用标准0.1mol/ KMnO 4溶液（在酸性条件下）进行标定；
0.1mol/L 草酸：称取优级纯H 2C 2O 4·2H 2O 12.607g ，用蒸馏水溶解后，定容至1L 。

【方法】
1.酶液提取 取小麦叶片
2.5g 加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml 容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm 离心15min ，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。

2.取50ml 三角瓶4个（两个测定两个对照），测定瓶中加入酶液2.5ml ，对照瓶中加入煮死酶液2.5ml ，再加入2.5ml 0.1mol/L H 2O 2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min ，立即加入10% H 2SO 4 2.5ml 。

3.用0.1mol/L KMn Ｏ4标准溶液滴定H 2O 2，至出现粉红色（在30min 内不消失）为终点。

酶活性用每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示：
酶活(mgH2O2/gFW·min)=
式中A—对照KMnO4滴定毫升数；
B—酶反应后KMnO4滴定毫升数；
V T—酶液总量（ml）；
V1—反应所用酶液量（ml）;
W—样品鲜重（g）；
1.7—1ml 0.1mol/L的KMnO4相当于1.7mg H2O2。

【注意】
所用KMnO4溶液及H2O2溶液临用前要经过重新标定。

三、过氧化氢酶的活性测定——紫外吸收法
【原理】
H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。

根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。

【仪器与用具】
紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml容量瓶1个；0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支；10ml试管3支；恒温水浴；
【试剂】
0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）；
0.1mol/L H2O2（用0.1mol/L高锰酸钾标定）。

【方法】
1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。

混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。

5℃下保存备用。

2.测定：取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表40-2顺序加入试剂。

表40-2 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表
25℃预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。

以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。

过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=
式中A240= A S0－
A S0—加入煮死酶液的对照管吸光值；
A S1, A S2—样品管吸光值；
Vt—粗酶提取液总体积（ml）；
V1—测定用粗酶液体积（ml）；
FW—样品鲜重（g）；
0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位（u）；
t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。

【注意事项】
凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。

【思考题】
1.影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些?
2.过氧化氢酶与哪些生化过程有关?。