纺织生物助剂果胶酶酶活的测定方法
果胶酶的固定化及其活力测定
正文果胶酶的固定化及其活力测定一、目的：果胶酶（EC.3.2.1.15）广泛存在于植物界，参与果实的成熟及其它代谢过程。
在果品加工业中，果胶酶主要用于果汁的澄清和提高榨汁率。
果胶酶的固定化将有助于提高酶的利用率，同时还可减少外源物质对果制品的污染。
果胶酶需求量大，且多为一次性使用，既造成了很大的浪费，又大大提高了产品生产成本。
固定化果胶酶可以重复多次使用，能够减少果胶酶的使用量，节约生产成本。
通过本实验，了解载体的制备方法，掌握酶的固定化原理及方法。
二、原理：本实验固定化方法为共价结合法。
以壳聚糖为载体，通过戊二醛共价交联固定化果胶酶。
壳聚糖是从蟹、虾外壳中提取的一种氨基多糖（α-氨基-1.4-β-葡萄糖多聚物），对人和动物无毒副作用，是一种具有网状结构，机械性能好，化学性质稳定，耐热性好的酶固定化载体材料，特别是壳聚糖分子中含有游离的氨基，通过化学交联剂（如戊二醛）很容易与酶发生间接共价结合，使酶牢固地固定在壳聚糖分子上。
果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸,可用DNS法定量：3,5-二硝基水杨酸与醛糖共热能产生棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和含有呈色氨基化合物的反应液颜色深浅成正比，在540nm下测其吸光度，从而可计算出果胶酶活力。
三、试剂及仪器仪器：冷冻离心机分光光光度计比色皿（8只）摇床水浴箱混合振荡器天平瓷盘药匙剪刀(1把) 记号笔（1支）通风橱吸水纸具塞刻度试管（4支）三角瓶（2支）烧杯（100ml×3个）试管架（1个）试管（6支）量筒（100ml×1个）滴管（16个）离心管(5ml×2个,50ml×1个)移液管架(1个) 移液管(2ml×3个,5ml×1个) 注射器（1支）滴管(1个)吸耳球（1个）洗瓶（1个）玻棒（1个）烧杯(300 ml×5个)试剂：乙酸－乙酸钠缓冲液（0.2mol/L,pH5.0）磷酸缓冲液(0.1mol/L,pH7.0) 3,5－二硝基水杨酸氢氧化钠冰醋酸丙三醇戊二醛无水乙醇浓盐酸果胶酶果胶半乳糖醛酸壳聚糖蒸馏水若干桶四、方法步骤1 载体的制备1.1取壳聚糖4g加入180ml的3%的乙酸中，加20ml甘油搅拌溶解，制得壳聚糖溶液。
果胶酶活性测定方法
学科分类号（二级）180.61本科学生毕业论文题目基因工程菌-241脂肪酶酶学特性研究姓名王琼学号 074120308 院、系生命科学学院专业生物技术指导教师杨云娟职称（学历）讲师（硕士）基因工程菌-241脂肪酶酶学特性研究摘要：本文主要介绍如何研究脂肪酶酶学特性，它广泛应用于工业生产。
研究结果表明，脂肪酶的最适温度是45℃，温度的耐受时间是40min，最适PH 是7，PH的耐受时间是60min，最适底物浓度是20%，金属离子对酶活性有一定的影响，有的促进或者抑制酶活性，最后用一个正交试验来确定了脂肪酶的最佳工业条件。
关键词：脂肪酶；性质；酶学特性脂肪酶是一类具有多种催化功能的酶，可以催化三酰甘油酯及其他一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化及酯类的逆向合成反应，除此之外还表现出其他一些酶的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、胆固醇酯酶、酰肽水解酶活性等(Hara；Schmid)。
脂肪酶不同活性的发挥依赖于反应体系的特点，如在油水界面促进酯水解，而在有机相中可以酶促合成和酯交换。
脂肪酶的性质研究主要包括最适温度与pH、温度与pH稳定性、底物特异性等几个方面。
迄今，已分离、纯化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性质，它们在分子量、最适pH、最适温度、pH和热稳定性、等电点和其他生化性质方面存在不同(Veeraragavan)等。
总体而言，微生物脂肪酶具有比动植物脂肪酶更广的作用pH、作用温度范围，高稳定性和活性，对底物有特异性(Schmid；Kazlauskas)等。
酶是一种活性蛋白质。
因此，一切对蛋白质活性有影响的因素都影响酶的活性。
酶与底物作用的活性，受温度、pH值、酶液浓度、底物浓度、酶的激活剂或抑制剂等许多因素的影响。
脂肪酶的催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大，早在1958年Sarda 和Desnnelv就发现了这一现象。
溶于水的酶作用于不溶于水的底物，反应是在2个彼此分离的完全不同的相的界面上进行。
分光光度计法测定果胶酶活力的方法研究
分光光度计法测定果胶酶活力的方法研究果胶酶是指分解果胶质的多种酶的总称，它可分为内切型和外切型两大类。
果胶酶广泛应用于果品的加工工业中，主要作用是果品榨汁时降低果浆泥的粘稠度，提高榨汁效率、出汁率、果汁澄清度和稳定性等。
果胶酶的活力对果品的加工品质影响很大，因此测定果胶酶的活力显得尤为重要。
测定酶活力的方法主要有还原法、色原底物法、粘度法等，其中还原法中的3，5一二硝基水杨酸比色法(简称DNS法)具有操作简便，对试剂、仪器等条件要求不高等优点。
该方法是利用果胶酶在一定温度、时间和条件下水解果胶，释放出还原性D一半乳糖醛酸，与3，5一二硝基水杨酸共热产生棕红色的氨基化合物，即发生显色反应。
在一定范围内，水解生成D一半乳糖醛酸的量与吸光度成正比，与果胶酶活力成正比，通过分光光度计测定吸光度，可以计算出果胶酶的活力。
该方法(又称分光光度计法)简单易行，但操作中影响因素较多，往往影响测定结果的准确性。
本研究就测定中各影响因素进行了优化实验，试图提出果胶酶活力测定的最佳技术参数。
1 材料与方法1．1 材料与仪器乙酸钠(CH3 C00Na·3H2O)、冰乙酸(CH3C00H)、氢氧化钠、无水亚硫酸钠、酒石酸钾钠(C 4H4KNaO6.4H2O)、苯酚以上试剂均为市售分析纯；3，5一二硝基水杨酸国药集团化学试剂有限公司；D一半乳糖醛酸97％，沃凯化学试剂有限公司；果胶、果胶酶天津利华酶制剂厂生产；实验用水均为去离子水。
TU一1810紫外分光光度计北京普析；电热恒温水浴锅上海宝磊。
1．2 实验方法1．2．1 试剂配制1．2．1．1 乙酸一乙酸钠缓冲溶液(pH4．8) 首先制备0．2mol／L 的乙酸溶液和0．2mol ／L 的乙酸钠溶液，然后将0．2mol／L 乙酸溶液410．0mL 与0．2mol／L 乙酸钠溶液59 0．0mL混合均匀，用酸度计测定。
1．2．1．2 DNS试剂(3g／L) 称取3．00g 3，5一二硝基水杨酸，溶解于500mL蒸馏水中，再逐步加入10．4gNaOH、9l、0g C4H4KNaO6.4H2O、2．5g苯酚和2．5g无水亚硫酸钠，温水浴(不超过4 8oC)中不断搅拌，直至溶液清澈透明。
果胶酶试剂盒说明书
果胶酶（pectinase）试剂盒说明书微量法100T/48S注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
测定意义：果胶酶（pectinase）是一类分解果胶质酶类的总称，包括原果胶酶，果胶酯酶，多聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶四大类，广泛存在于植物果实和微生物中，主要用于食品、酿酒、环保、医药、纺织及日化用品行业。
测定原理：果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸，具有还原性醛基，与DNS试剂反应生成红棕色物质，在540nm有特征吸收峰，测定540nm 处吸光值变化可计算得果胶酶活性。
自备实验用品及仪器：天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅。
试剂组成和配制：提取液：液体100m L×1瓶，4℃保存。
试剂一：液体20m L×1瓶，4℃保存。
试剂二：粉剂×2瓶，4℃保存；临用前加入7.5mL试剂一，50℃加热溶解，用不完的试剂4℃保存一周。
试剂三：液体20m L×1瓶，4℃避光保存。
酶液提取：1．组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。
10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2．细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后10000g，4℃离心10min，取上清置于冰上待测。
3. 细胞培养液等：直接检测。
测定操作表：对照管测定管试剂二（µL）120 12050℃水浴温育5min样本（µL）30煮沸样本（µL）30混匀，50℃水浴反应30min试剂三（µL）150 150沸水浴5min，冰浴冷却终止反应，8000g，4℃，离心10min，蒸馏水调零，取上清于微量石英比色皿或96孔板测定540nm处吸光值A，△A=A测定管-A对照管。
饲用酶制剂的酶活检测方法及评定
饲用酶制剂的酶活检测方法及评定随着我国畜牧业的发展和生物工程技术的不断进步，酶制剂在饲料工业中的应用越来越多。
由于酶制剂能够消除饲料中的某些抗营养因子的负面作用，提高饲料消化率，改善动物生产性能，降低生产成本，因此日益受到饲料界的重视。
但是，由于酶制剂来源比较复杂、分子结构不明确，分离提纯困难等多种原因，使这类产品有国家标准的不多，即使有国标也存在一些问题。
给广大养殖用户和生产企业带来很大不便。
本文简单介绍一下常用的酶活测定方法及测定过程的影响因素，仅供广大饲料工作者提供参考。
1 酶制剂的定义及分类所谓的酶制剂就是通过产酶微生物发酵工程或含酶的动、植物组织提取技术生产加工而成，具有一种或多种底物清楚的酶催化活性，有助于改善动物对饲料营养成分的消化、吸收等，并有功效的生物学评定依据，符合安全性要求，作饲料添加剂用的酶制剂产品（NY/T 722-2003）。
工业上应用的酶制剂大多为水解酶，按作用底物的不同，可分为淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、植酸酶、木聚糖酶、果胶酶、葡聚糖酶、纤维素酶等。
按动物体内是否分泌，分为消化酶和非消化酶两大类。
消化酶指动物自身能够分泌的淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等，在幼龄动物或特殊生理阶段时，动物也存在消化酶分泌不足需要外源供给的情况。
非消化酶是指动物自身不能够分泌或很少分泌，必须由外源供给的酶，这类酶能消化动物自身不能消化的物质或降解一些抗营养因子，主要有植酸酶、木聚糖酶、果胶酶、葡聚糖酶、纤维素酶等。
2 常见的酶活测定方法通常酶制剂活性的检测是采用实验室分析手段来进行评价，它可以用来筛选优质酶制剂、确定复合酶制剂的最佳组方及确定产品的最佳添加量等，酶制剂实验室评价技术是目前饲料厂家应用最为广泛的一种方法。
其操作相对简单，检测所用时间短，便于生产实践应用。
酶活测定结果虽不能完全反映酶的使用效果，但通过检测至少可以避免使用劣质的酶制剂。
我国饲料工业标准中已经确立了饲用植酸酶（GB/T 18634）、纤维素酶（NY/T912）、β—葡聚糖酶（NY/T 911）的测定方法。
果胶酶活性测定实验报告
一、实验设计实验序号实验三实验名称特定产物工业生产菌种发酵试验时间2010年13日-23日实验室基础生物2（121）一、实验目的1、掌握菌种选育、菌种发酵条件的优化和微生物酶制剂酶活测定的基本方法；2、了解酶学性质的研究.3、了解影响果胶酶对果汁澄清效果的各种因素二、实验与原理1、果胶酶概况（1）、果胶质：是高等植物细胞壁内及细胞壁间的结构性多糖，是一类高分子碳水化合物，它的存在往往给果蔬加工等工艺带来许多麻烦和损失。
（2）、果胶酶：是指能分解果胶质的多种酶的总称，广泛存在于高等植物和微生物中。
（3）、产生果胶酶的微生物：细菌、放线菌、酵母和霉菌，但目前商品果胶酶多数来自霉菌。
（4）、果胶酶的应用：主要是用于果胶的分解，在水果加工、葡萄酒生产、麻类脱胶和饲料等方面有着广泛的应用。
2、果胶酶的酶活测定方法（1）、粘度降低法：利用粘度计测量在一定温度、酶浓度和一定反应时间内，标准果胶溶液的粘度降低值。
（2）、脱胶作用时间法：以脱胶作用的时间来测定果胶酶的酶活力。
（3）、次亚碘酸法：用滴定法定量测定半乳糖醛酸的生成量，以表示果胶酶的活力。
（4）、还原糖法（DNS法）：根据果胶酶水解果胶生成半乳糖醛酸，后者是一种还原糖，与3，5 -二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系，可利用比色法在540nm进行测定。
3、微生物发酵生产产品受以下条件制约：（1）、培养基成分：C源、N源、无机盐、水和生长因子（2）、培养条件：温度、pH、溶解氧等（3）、附加条件：诱导物、表面活性剂等4、酶催化反应的进行受多种因素的影响：底物浓度、酶浓度、温度、pH、激活剂、抑制剂三、设备与材料（一）、培养基1、菌种筛选使用培养基（1）、基本培养基:果胶1% 、磷酸氢二钠0.5%、蛋白胨1%、pH4.5、琼脂2.0%。
（2）、分离培养基：果胶0.5%、磷酸氢二钠0.5%、琼脂2.0%、H4.5。
饲用酶制剂的酶活检测方法及评定
饲用酶制剂的酶活检测方法及评定随着我国畜牧业的发展和生物工程技术的不断进步，酶制剂在饲料工业中的应用越来越多。
由于酶制剂能够消除饲料中的某些抗营养因子的负面作用，提高饲料消化率，改善动物生产性能，降低生产成本，因此日益受到饲料界的重视。
但是，由于酶制剂来源比较复杂、分子结构不明确，分离提纯困难等多种原因，使这类产品有国家标准的不多，即使有国标也存在一些问题。
给广大养殖用户和生产企业带来很大不便。
本文简单介绍一下常用的酶活测定方法及测定过程的影响因素，仅供广大饲料工作者提供参考。
1 酶制剂的定义及分类所谓的酶制剂就是通过产酶微生物发酵工程或含酶的动、植物组织提取技术生产加工而成，具有一种或多种底物清楚的酶催化活性，有助于改善动物对饲料营养成分的消化、吸收等，并有功效的生物学评定依据，符合安全性要求，作饲料添加剂用的酶制剂产品（NY/T 722-2003）。
工业上应用的酶制剂大多为水解酶，按作用底物的不同，可分为淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、植酸酶、木聚糖酶、果胶酶、葡聚糖酶、纤维素酶等。
按动物体内是否分泌，分为消化酶和非消化酶两大类。
消化酶指动物自身能够分泌的淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等，在幼龄动物或特殊生理阶段时，动物也存在消化酶分泌不足需要外源供给的情况。
非消化酶是指动物自身不能够分泌或很少分泌，必须由外源供给的酶，这类酶能消化动物自身不能消化的物质或降解一些抗营养因子，主要有植酸酶、木聚糖酶、果胶酶、葡聚糖酶、纤维素酶等。
2 常见的酶活测定方法通常酶制剂活性的检测是采用实验室分析手段来进行评价，它可以用来筛选优质酶制剂、确定复合酶制剂的最佳组方及确定产品的最佳添加量等，酶制剂实验室评价技术是目前饲料厂家应用最为广泛的一种方法。
其操作相对简单，检测所用时间短，便于生产实践应用。
酶活测定结果虽不能完全反映酶的使用效果，但通过检测至少可以避免使用劣质的酶制剂。
我国饲料工业标准中已经确立了饲用植酸酶（GB/T 18634）、纤维素酶（NY/T912）、β—葡聚糖酶（NY/T 911）的测定方法。
果胶酶应用基理及活性检测方法
果胶酶应用基理及活性检测方法果胶酶应用基理及活性检测方法2013-1-23 16:57:21随着人们对健康环保纺织品需求的增加以及各国政府对环境保护强制力度的加大,在纺织印染行业中一种新型的纺织助剂———生物酶制剂的应用逐渐发展起来。
目前,一种基于果胶酶的新型纺织生物助剂正在应用推广中,它主要用于棉、麻的前处理工艺。
由于纺织企业多数对果胶酶的生物特性不甚了解,在工艺应用过程中缺乏相应的检测手段,使其推广受到限制。
酶活力(活性)是衡量酶生物活性及含量的重要指标,因此,建立适用于纺织行业的果胶酶酶活检测方法,是十分迫切和必要的。
2果胶酶的酶促作用机理果胶酶是一类复合酶,是指分解果胶质的多种酶的总称。
我们测定的酶活值通常是这一类复合酶协同作用的综合结果。
果胶酶可分为两大类:解聚酶和果胶酯酶。
解聚酶主要是通过水解作用和反式消去作用,切断果胶和果胶酶分子α-1,4糖苷键,将果胶分子降解为小分子。
果胶酯酶的作用是使果胶分子中的甲酯水解,最后形成果胶酸。
催化的反应物。
通常,酶制剂的活力是以Ｕ/ｇ酶制剂(或Ｕ/ｍＬ酶制剂)表示,把酶制剂的量和活力联系在一起,称为“比活力”。
在特定条件下,通过测定单位量的某种酶制剂在单位时间内催化足够量底物生成反应产物的量,即可测出此酶制剂的比活力。
根据酶促反应动力学的米氏学说,从酶被底物饱和的现象出发,按照“稳态平衡”假说的设想,可推导出如下公式:产物生成速率=ｋ3[总酶][底物]/([底物]+ｋｍ)(1)式中:[总酶]———酶的总浓度(ｍｏｌ/ｍＬ);[底物]———底物浓度(ｍｏｌ/ｍＬ);ｋ3———在酶促反应的第二步,形成最终产物的速率常数;ｋｍ———米氏常数(ｍｏｌ/ｍＬ),其值是当酶反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度。
要估计[总酶],首先要固定所有可控制的独立变量,如ｐＨ值、温度等。
当[底物]>>Ｋｍ时,底物对反应速率的影响可忽略(酶饱和),酶促反应达到最大反应速率Ｖｍａｘ,其结果是:产物生成速率=ｋ3[总酶]=Ｖｍａｘ=ＵＵ就成为总酶量的一种测量。
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1引言随着人们对健康环保纺织品需求的增加以及各国政府对环境保护强制力度的加大,在纺织印染行业中一种新型的纺织助剂———生物酶制剂的应用逐渐发展起来。
目前,一种基于果胶酶的新型纺织生物助剂正在应用推广中,它主要用于棉、麻的前处理工艺。
由于纺织企业多数对果胶酶的生物特性不甚了解,在工艺应用过程中缺乏相应的检测手段,使其推广受到限制。
酶活力(活性)是衡量酶生物活性及含量的重要指标,因此,建立适用于纺织行业的果胶酶酶活检测方法,是十分迫切和必要的。
2果胶酶的酶促作用机理果胶酶是一类复合酶,是指分解果胶质的多种酶的总称。
我们测定的酶活值通常是这一类复合酶协同作用的综合结果。
果胶酶可分为两大类:解聚酶和果胶酯酶。
解聚酶主要是通过水解作用和反式消去作用,切断果胶和果胶酶分子α-1,4糖苷键,将果胶分子降解为小分子。
果胶酯酶的作用是使果胶分子中的甲酯水解,最后形成果胶酸。
果胶质主要是由Ｄ-半乳糖醛酸以α-1,4糖苷键连接形成的直链状聚合物。
部分Ｄ-半乳糖醛酸上的羧基被甲醇酯化、形成甲酯,或被一种或多种碱部分或全部中和。
果胶质在植物的细胞组织中起着“粘合”作用,在棉纤维的初生胞壁中,果胶质含量约占9%,而麻纤维则更高。
通过果胶酶的作用,将果胶质降解为小分子物质,从纤维中游离出来,可使与其粘合在一起的其它杂质(如蜡质、蛋白质、灰份等)与纤维素彻底分开,达到棉精炼或麻脱胶的目的。
对于纺织行业,需要的是将果胶催化水解成可游离出纤维的、小分子物质的果胶酶活性(力),因此,主要测定解聚酶的活力。
解聚酶对果胶分子的酶促催化作用表现为,每切断一个果胶分子的α-1,4糖苷键,就会形成一个还原性醛基。
通过测定这些还原性醛基生成的量,即可判定解聚酶的酶活力。
3测定酶活力(性)的基本原理酶作为一种生物催化剂,其酶活力值是与其催化效率及有效(即有生物活性)酶的含量相关的。
酶活力是酶在单位时间内将底物转化为反应产物的能力,以Ｕ(ｍｏｌ/时间)表示,底物即是酶催化的反应物。
通常,酶制剂的活力是以Ｕ/ｇ酶制剂(或Ｕ/ｍＬ酶制剂)表示,把酶制剂的量和活力联系在一起,称为“比活力”。
在特定条件下,通过测定单位量的某种酶制剂在单位时间内催化足够量底物生成反应产物的量,即可测出此酶制剂的比活力。
根据酶促反应动力学的米氏学说,从酶被底物饱和的现象出发,按照“稳态平衡”假说的设想,可推导出如下公式:产物生成速率=ｋ3[总酶][底物]/([底物]+ｋｍ)(1)式中: [总酶]———酶的总浓度(ｍｏｌ/ｍＬ);[底物]———底物浓度(ｍｏｌ/ｍＬ);ｋ3———在酶促反应的第二步,形成最终产物的速率常数;ｋｍ———米氏常数(ｍｏｌ/ｍＬ),其值是当酶反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度。
要估计[总酶],首先要固定所有可控制的独立变量,如ｐＨ值、温度等。
当[底物]>>Ｋｍ时,底物对反应速率的影响可忽略(酶饱和),酶促反应达到最大反应速率Ｖｍａｘ,其结果是:产物生成速率=ｋ3[总酶]=Ｖｍａｘ=ＵＵ就成为总酶量的一种测量。
因此,可以通过测定Ｕ来反映酶制剂中有效酶蛋白的含量。
4果胶酶酶活的测定方法概述和比较测定果胶酶酶活的方法有很多,但基本上都是利用酶促分解果胶产生的粘度下降或生成的还原性醛基来测定果胶酶酶活。
这些方法概括起来主要有粘度降低法、滴定法和分光光度法3种。
本文分别选取一种较典型的测定方法加以介绍。
4.1粘度降低法4.1.1原理果胶溶于水后形成粘稠状溶液,其粘度和溶解度与其聚合和酯化程度有关。
可以利用果胶的这种性质,测其酶活力。
即在一定温度、酶浓度下和一定反应时间内,测定标准果胶溶液粘度的降低率。
4.1.2操作方法浴中保温10ｍｉｎ后,加入1ｍＬ酶液,继续保温,在不同时间分别测定反应混合液流出粘度计小球的时间。
对照实验采用经热处理已失活的酶液。
4.1.3计算粘度下降百分数可用下式表示:粘度下降(%)=100(Ｔｏ-Ｔ)/(Ｔｏ-Ｔα)(2)式中:Ｔ、Ｔｏ和Ｔα分别为反应混合液、对照混合液和缓冲液的流出时间(ｓ)。
酶溶液要预先稀释,使粘度降低范围在20%～80%。
在此范围内,酶浓度对数与粘度降低率成正比。
以酶作用时间为横坐标、粘度下降百分数为纵坐标做标准曲线,在图中查出粘度下降50%时对应酶的作用时间(Ｔ1/2)。
在上述条件下,引起粘度下降50%的酶量为10个果胶酶活力单位,即酶活单位=10/(Ｔ1/2/3600)。
4.2滴定法4.2.1原理果胶酶彻底水解果胶,生成半乳糖醛酸;半乳糖醛酸可与碘(过量)反应。
反应后剩余的碘可用硫代硫酸钠溶液滴定,据此可得出酶解反应产生的半乳糖醛酸的量。
以生成半乳糖醛酸的量衡量果胶酶的活力。
4.2.2测定方法取1%果胶溶液10ｍＬ,加入到5ｍＬ酶液和5ｍＬ水,调ｐＨ至3.5,在50℃水浴中保持2ｈ,取出加热煮沸。
冷却后,取5ｍＬ反应液移入碘量瓶中,加1Ｍ碳酸钠溶液1ｍＬ,0.1Ｎ碘液5ｍＬ,摇匀,加塞,于室温下放置20ｍｉｎ,加2Ｎ硫酸2ｍＬ,用0.05Ｎ硫代硫酸钠滴定至淡黄色,加0.5%淀粉指示剂1ｍＬ,继续滴定至蓝色消失为止。
记录所消耗的硫代硫酸钠毫升数Ａ。
空白试验用10ｍＬ果胶溶液、10ｍＬ水,不加酶液,不经保温,直接取此混合物5ｍＬ于100ｍＬ三角瓶中用于滴定,记录消耗的硫代硫酸钠毫升数Ｂ。
4.2.3计算在上述条件下,1ｈ酶促转化果胶、生成1ｍｇ当量游离半乳糖醛酸所需的酶量定为一个酶活单位。
每毫升酶液的活力单位=(Ｂ-Ａ)Ｎ×0.51×20.(5×2×5)(3)式中: Ｎ———硫代硫酸钠的当量浓度;0.51———1ｍｇ当量硫代硫酸钠相当于0.51ｍｇ当量的半乳糖醛酸;20———分解果胶反应液的总体积数;5、2、5———分别表示反应中加入酶液的毫升数、反应时间、滴定时所取反应液的毫升数。
4.3分光光度法4.3.1原理果胶酶分解果胶,产生带有还原性醛基的还原糖(以半乳糖醛酸计),一些显色剂可与其发生显色反应。
根据颜色深浅的不同,可以通过分光光度计测定果胶酶酶活值的大小。
本文以最常用的ＤＮＳ比色法介绍此检测方法,其显色剂为3,5-二硝基水杨酸。
4.3.2操作方法取0.5%果胶溶液0.5ｍＬ加入到0.5ｍＬ酶液中,摇匀。
在50℃水浴中准确反应0.5ｈ,取出后,迅速在沸水浴中加热5ｍｉｎ,冷却。
取0.5ｍＬ反应液移入加有0.5ｍＬＤＮＳ试剂的试管,加4ｍＬ蒸馏水,摇匀,在沸水浴中加热5ｍｉｎ,迅速冷却。
用分光光度计在540ｎｍ处测其吸光度值。
参比液配制:加热灭活5ｍｉｎ的0.5ｍＬ的稀释酶液与0.5ｍＬ0.5%果胶溶液充分混合。
4.3.3计算采用标准曲线法,配制一系列已知浓度的标准葡萄糖溶液,在540ｎｍ处测定吸光度(Ａ),以葡萄糖浓度(Ｃ)为横坐标、吸光度(Ａ)为纵光标作Ａ.Ｃ标准曲线(参见5.2节图2)。
由标准曲线可得公式:Ａ=斜率×Ｃ(ｍｇ葡萄糖/ｍＬ)(4)未知试液测定吸光度值Ａ后,可通过上式求得Ｃ(ｍｇ葡萄糖/ｍＬ)。
在上述条件下,每小时内每毫升果胶酶酶促转化果胶生成1ｍｇ当量还原糖(以半乳糖醛酸计)所需的酶量定义为一个酶活单位。
即:果胶酶活(ｍｇ半乳糖醛酸/ｍＬ·ｈ)=酶液稀释倍数×Ｃ(ｍｇ葡萄糖/ｍＬ)×2×194/180 (5)式中: 194/180———葡萄糖换算成半乳糖醛酸的量;2———测定中稀酶液被0.5%果胶溶液稀释的倍数。
4.43种方法的比较将粘度降低法用来测定果胶酶的复合酶活力比较准确,但操作过程也相对复杂,且测定灵敏度不高。
滴定法设备使用简单,测试重现行好,准确度高,但测定时间长,过程较繁琐,试剂用量较大。
而分光光度法测定的灵敏度、准确度均高,重现性好,试剂用量少,尤其是操作省时、简便。
对于上述3种测定方法,根据纺织行业的特点,笔者认为分光光度法更适于纺织工作者应用。
下面重点探讨ＤＮＳ比色法在实际应用中的一些具体问题。
5应用ＤＮＳ比色法测定果胶酶酶活5.1果胶溶液的配制以及酶液的稀释果胶溶液的配制浓度以及酶液的稀释倍数是相互联系的两个数据,它们的确定对酶活测定结果的正确性起着关键作用。
通过完成以下试验,可以确定有关参数条件。
5.1.1材料与方法5.1.1.1仪器与试剂ＵＶ—9200分光光度计;果胶(Ｓｉｇｍａ)、果胶酶制剂(ＮＯＶＯ)、3,5-二硝基水杨酸、巴比妥酸、巴比妥钠。
5.1.1.2溶液配制ＤＮＳ试剂:将6.3ｇ3,5-二硝基水杨酸、262ｍＬ2ｍｏｌ/ＬＮａＯＨ加到500ｍＬ含182ｇ酒石酸钠的热水溶液中,再加5ｇ苯酚及5ｇ亚硫酸钠,待溶解、冷却后,加蒸馏水定容至1000ｍＬ,贮于棕色瓶中,一周后即可使用。
5.1.1.3配制巴比妥缓冲液(ｐＨ=8.6)称取 1.84ｇ巴比妥酸,置于56～60℃水中溶化,然后加入10.3ｇ巴比妥钠,加蒸馏水定容至1000ｍＬ。
5.1.1.4配制0.5%果胶溶液准确称取0.5ｇ果胶于烧杯中,用巴比妥缓冲液(ｐＨ=8.6)溶解、稀释定容至100ｍＬ。
5.1.2制作果胶酶稀释倍数与吸光度关系曲线分别按表1的稀释倍数用蒸馏水稀释果胶酶,将稀释酶液按4.3.2测定吸光度值,以果胶酶稀释倍数的倒数为横坐标,吸光度(Ａ)为纵坐标作关系曲线(见图1)。
5.1.3结果与讨论由公式(4)、(5)可得出,在酶活相同的情况下,吸光度与酶液稀释倍数的倒数应呈正比例关系。
图1为试验测得的果胶酶稀释倍数的倒数与其酶活力吸光度值关系曲线,从中可看出果胶酶的稀释倍数过低或过高都会偏离正比的线性关系,尤其在稀释倍数过低的情况下。
原因可能有以下两点:①根据米氏学说,底物浓度应保持足够大到使酶饱和,达到最大反应速率,酶活值与酶浓度才能成正比。
过高的酶液浓度可能使底物浓度相对不足,而不能满足这种正比关系。
②根据朗伯-比耳定律,吸光度与浓度间只在一定范围内有较好的正比关系,酶促反应产生的高浓度产物与ＤＮＳ的络合物颜色过深,会超过这一范围产生较大误差。
稀释倍数过高时吸光度值也偏离朗伯-比耳定律,但仍满足底物使酶饱和的条件,因此产生的偏差相对小得多。
果胶溶液的配制一定要有足够大的量,但过大的果胶浓度又会使溶液粘度加大,增加操作的误差。
经过反复试验,在反应30ｍｉｎ条件下确定0.5%的果胶浓度,效果最好。
将表1的最高稀释倍数和最低稀释倍数的吸光度值删除,对其它数据进行回归分析,得到曲线的回归方程为:Ａ=820.72Ｃ(Ｒ2=0.9943)。
表明其线性相关度很好,说明当酶制剂稀释液的吸光度值在0.2～0.4范围内时,其酶活值有很高的准确度。
用自产的粗酶液进行了同样的试验,也得到相同结果,因此,可以确定果胶溶液浓度为0.5%,控制酶液稀释倍数使吸光度值在0.2～0.4范围内。