苯乙烯类菁染料pH荧光探针在细胞荧光成像中的应用及细胞毒性检测
BODIPY类荧光染料的研究进展
（ 建 师 范大 学化 学与材料 学院 ，福 建 福
摘 要 ：Ｏ Ｉ （ Ｂ ＤＰ 氟化＠－ ｐ咯） Ｙ － ｔ 类荧光染料作为一类新兴的荧光染料 ， ￣ 因其 良 好的光物理性质， 在过去的二十年内得到广泛
的研 究。对 Ｂ Ｄ Ｐ Ｏ ＩＹ的中心 骨架 进行官能化 ， 可形 成一 系列衍 生物用 于环境 监测 和生物科 学等领域 研究 。文 章主要对 近年来 有关 Ｂ ＤＰ Ｏ ＩＹ的官能化及作为荧光探针 、 荧光标记 、 光敏剂的应用加 以综述 。
一
物、 环境等领域 中某些离子的痕量检测具有重要 意义。
２ ２ 改 善水 溶性 ．
针 对 改 善 Ｂ ＤＰ 类 染 料 水 溶 性 问 题 ， 常 是 引 入 可 电 离 Ｏ ＩＹ 通 的 亲 水 性 基 团 ， 羧 基 、 酸 基 、 酸 基 和 胺 基 等 ， 者 将 如 磷 磺 或
Ｂ ＤＰ Ｏ ＩＹ接枝到亲水性 的聚合物上 ， 如聚乙烯醇 、 聚核苷酸上 Ｊ 。 早在 １８ ， ｒ ｓ 课题组将 Ｂ Ｄ Ｐ ９ ５年 Ｗｏｉ ｅ Ｏ ＩＹ与氯磺 酸反 应 ， ２位 在
Ｔｅ ｓ Ｋｅ ｚｒ 在 １６ ｒｉ 和 ｒｕｅ ｂ ９８年 首 次 发 现 了 Ｂ ＤＰ 荧 光 染 Ｏ ＩＹ 料， 其结构式如 图 １ 所示 。
心骨架结构上 引入 带有特 异性 识别效 应的基 团 ， 如引入 ２ ２ 例 ， 联 吡啶基 团， 以实 现对 ｚ “ 的选择性 识别 』 可 ｎ 。这对实现 生
２ ４ 接上 溴 元素或 碘元 素 ．
光动力疗法是一种 非侵 入性 的肿瘤细 胞疗 法 ， 传统 的化 与 疗、 手术等治疗 方法相 比， 其优点是能够 选择性消 灭肿瘤 细胞而 不伤害其他 正常细胞 。在 Ｂ ＤＰ Ｏ ＩＹ的 ２ ６位 上接上溴 原子或者 ，
荧光探针的合成及自由基检测研究要点
荧光探针的合成及自由基检测研究摘要荧光分析法在生物化学、医学、工业和化学研究中的应用与日俱增，其原因在于荧光分析法具有高灵敏度的优点，且荧光现象具有有利的时间表度。
由于物质分子结构不同，其所吸收光的波长和发射的荧光波长也不同，利用这一特性可以定性鉴别物质。
荧光探针技术是一种利用探针化合物的光物理和光化学特性，在分子水平上研究某些体系的物理、化学过程和检测某种特殊环境材料的结构及物理性质的方法。
该技术不仅可用于对某些体系的稳态性质进行研究，而且还可对某些体系的快速动态过程如对某种新物种的产生和衰变等进行监测。
这种技术具备极高的灵敏性和极宽的动态时间响应范围的基本特点。
羟基自由基(HO·)和超氧阴离子自由基(O2-·)是生物体内活性氧代谢产生的物质，当体内蓄积过量自由基时，它能损伤细胞，进而引起慢性疾病及衰老效应。
因此，近些年来人们为了预防这类疾病的发生，自由基的研究已逐渐成为热点。
而快速、灵敏和实用的自由基检测方法就显得十分重要。
荧光探针检测自由基具有操作简便、响应迅速、选择性高等多种优点，我们将着重研究一类苯并噻唑结构荧光探针的合成及其对超氧阴离子自由基(O2-·)的检测。
关键词：荧光探针，苯并噻唑，超氧阴离子自由基，自由基检测SYNTHESIS OF FLUORESCENT PROBES AND DETECTION OF FREE RADICALSABSTRACTApplications of fluorescence analysis method in biochemistry, medicine, industry and chemical research grow with each passing day, the reason is that fluorescence analysis method has the advantages of high sensitivity, and the flurescence phenomenon has a favorable time characterization. Since the molecular structure of different materials, the absorption wavelength and fluorescence wavelength of the emitted light is different, this feature can be characterized using differential substances. Fluorescent probe technology is a method using photophysical and photochemical properties for researching some systems’physical and chemical process at the molecular level and detecting a particular structure and physical property of the special environment material. This technology not only can be used for steady-state nature of certain system, but also can monitore fast dynamic processes of a certain system such as the production and decay of a new species. This technology has the basic characteristics of a high degree of sensitivity and very wide dynamic range response time. Hydroxyl radical(HO-·)and superoxide anion radical(O2-·) is a substance produced in vivo metabolism of reactive oxygen species. When the body accumulates excess free radicals that will damage cells thereby causing chronic diseases and aging effects. Thus, in recent years people in order to prevent the occurrence of such diseases, the study of free radicals has become a hot spot. And fast, sensitive and practical method for the detection is very important. Using the fluorescent probes for the detection of free radicals is a simple, quick response, high selectivity variety of advantages. We will focus on the study of a classof synthetic fluorescent probes of benzothiazole structure and detection of superoxide anion radical.Key words：Fluorescent probes, Benzothiazole, Superoxide anion radical, Detection of free radicals目录1 绪论 (1)1.1 引言 (1)1.2 荧光 (1)1.2.1 荧光的产生 (1)1.2.2 荧光探针结构特点 (2)1.2.3 荧光探针传感机理 (3)1.2.4 常见荧光团 (3)1.2.5 荧光探针的性能 (5)1.2.6 影响荧光探针性能的因素 (5)1.2.7 荧光淬灭 (5)1.3 自由基 (6)1.3.1 自由基的间接检测技术 (6)1.3.2 自由基的直接检测技术 (7)1.4 研究现状 (8)1.4.1 超氧化物歧化酶(SOD)的检测 (8)1.4.2 2-(2-吡啶)-苯并噻唑啉荧光探针 (8)1.4.3 PF-1和PNF-1 (8)1.4.4 香草醛缩苯胺 (8)1.4.5 Hydroethidine类荧光探针 (9)1.4.6 二(2,4-二硝基苯磺酰基)二氟荧光素 (9)1.5 选题背景和意义 (10)1.6 课题研究内容 (10)2 荧光探针的合成 (11)2.1 引言 (11)2.2 还原文献 (11)2.3 新探针合成 (11)2.3.1 2-(4-二甲氨基苯)-苯并噻唑 (11)2.3.2 2-(4-氰基苯)-苯并噻唑 (12)2.3.3 2-(苯)-苯并噻唑 (12)2.3.4 2-(4-甲基苯)-苯并噻唑 (12)2.3.5 2-(4-硝基苯)-苯并噻唑 (13)2.3.6 2-(水杨醛)-苯并噻唑 (13)2.4 合成小结 (14)2.5 实验药品及规格 (14)2.6 实验仪器及型号 (15)3 实验结果与讨论 (16)3.1 引言 (16)3.2 荧光性能测试 (16)3.2.1 荧光性能待测溶液配制 (16)3.2.2 荧光性能测试结果 (16)3.2.3 测试谱图 (17)3.3 1H NMR数据 (21)3.3.1 2-(2-吡啶)-苯并噻唑 (21)3.3.2 2-(4-二甲氨基苯)-苯并噻唑 (22)3.3.3 2-(4-氰基苯)-苯并噻唑 (23)3.3.4 2-(苯)-苯并噻唑 (24)3.3.5 2-(4-甲基苯)-苯并噻唑 (25)3.3.6 2-(水杨醛)-苯并噻唑 (25)3.3.7 2-(2-噻吩)-苯并噻唑 (26)3.4 反应条件控制及处理 (27)3.5 结论与展望 (27)参考文献 (28)致谢 (30)译文及原文 (31)1 绪论1.1 引言荧光分析法在生物化学、医学、工业和化学研究中的应用与日俱增, 其原因在于荧光分析法具有高灵敏度的优点, 且荧光现象具有有利的时间表度。
基于花菁类染料荧光探针测定pH的方法
花 菁 染 料 一 般 由两 个 Ｎ原 子 中心 构 成 ， 其 中 一个 Ｎ原 子带正电荷 ， 并 与 一个 含 奇 数 碳 原 子 的共 轭 链 相 连 ， 共轭链 上 的 碳 原 子 再 与 另一 个 Ｎ 中心 相 连 ， 形成 电荷 转 移 通 道 ， 人 们根据花菁结构的显著特征常称花菁为 “ 推 一拉 ” 烯烃， 这 是 一 种 阳离 子 亚 甲基 链 染 料 ．然 而 ，文 献 还 报 道 了另 一 种
中 图分 类 号 ： ０ ６ ２ ５ 文献标识码 ： 文章编号 ： ｌ ０ ０ ６ — ４ ３ ２ Ｘ（ ２ ０ １ ３ ） ０ ３ — ０ ０ ４ １ — ０ ４
０ 引 言
近年 来 ， 红 区 一近 红 外 花 菁 （ Ｃ ｙ ａ ｎ ｉ ｎ ｅ ） 染 料 引 起 人 们 很 大的兴趣【 ｌ Ｉ ， 因为这些化合物 的吸收及荧 光波长处 于红区或 近红外 区（ ５ ０ ｏ 一 ８ ０ ０ ｎ ｍ） ， 远 离 实 际 样 品 中天 然 有 机 分 子 的 吸收及 荧 光光谱 区 ，且 具有 摩 尔 吸收 系数 大 （ 通常 １ ０ ５ Ｍ ｃ ｍ ） 、 荧光量子产率 高等优点 ， 因而用于分析 测定则具
ｐ Ｈ是衡量溶 液酸碱性 的尺度， 在 医学 上， 人 体血液 的 ｐ Ｈ值通 常在 ７ ． ３ ５ ～ ７ ． ４ ５之间， 如果 发生 波动， 就是病理现象 ．
在 化 学 上 ，很 多 化 学 反 应 需 要 在 特 定 的 ｐ Ｈ下进行． 与其 他 的ｐ Ｈ测 定方法 相 比 （ 如 目视 比 色 法 、 电 化 学 传 感 器 法 、
共轭 亚 甲基链 完全 与花菁染 料相 同 的中性亚 甲基链 菁染 料， 叫降菁 （ Ｎ ｏ ｒ － ｃ ｙ ａ ｎ ｉ ｎ ｅ ） ， 其摩 尔吸收 系数小， 短波吸 收， 无 荧光 ， 两者结构 、 光谱特性的差别
1.3.2 荧光探针
荧光探针1 荧光探针所谓探针(probe )，在生物、化学学科中是指生物化学实验室中用于指示特定物质(如离子、生物小分子、核酸、蛋白质、细胞结构等)的性质或物理状态的一类标记分子，或者一些仪器的探测器。
目前所说的荧光探针通常是指生物分析与化学分析中用于荧光信号输出的各类标记物，它可以为人们提供待测生物分子在生物体内或体外的存在、表达、分布等各种信息，对于整个生物个体中物质代谢过程的研究具有重要意义。
基于荧光标记物的荧光分析法具有快速、简便、灵敏度高等优点，在分析化学、生命科学、医学等领域受到研究者的广泛关注。
然而对于大多数被分析物来说，其本身可能没有荧光或者荧光很弱，这就需要将一些发荧光的物质与其偶联，从而对其进行分析和示踪。
目前荧光探针根据荧光来源主要包括三大类：第一类是有机小分子染料;第二类是以绿色荧光蛋白为代表的荧光蛋白；第三类是荧光纳米材料。
1.1 有机小分子染料早在1871年，德国科学家Adolph V on Bayer就合成了荧光素，这是科学家首次合成荧光探针。
目前，基于有机小分子的荧光探针在分析化学、生命科学领域中己经得到广泛应用，可用于离子和小分子的检测、蛋白质的标记、细胞成像等。
常见的有机荧光探针包括荧光素类、罗丹明类、花菁类、香豆素类和稠环芳烃类染料等。
这些染料大多含有发射荧光基团(如拨基、氮氮双键、碳氢双键等)和助色基团(经基、伯胺基、仲氨基、酞胺基、醚键等)。
其中仅吲哚菁绿和荧光素两种荧光染料被美国食品和药品监督管理局(FDA)批准在人体中使用。
基于有机小分子探针的生化分析应用主要分为直接法和间接法。
直接法是指利用探针本身与靶标的相互作用，使其荧光发生变化(荧光减弱、荧光增强、荧光蓝移、荧光红移等)(图1.1）。
如Yin课题组运用BODIPY ( 4,4-difluoro-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene)作为原料，合成了可以快速高灵敏地响应铜离子的近红外荧光探针，且铜离子熄灭的荧光又能被重新加入的硫离子竞争得到恢复，因而构建了一个新颖的铜离子和硫离子逻辑门传感器；Li等以罗丹明B为原料，经过改性得到了高灵敏、专一性强且快速响应Fe3+的“off-on”型荧光探针。
常见的小分子荧光探针种类
常见的小分子荧光探针种类1.引言1.1 概述小分子荧光探针是一类被广泛应用于生物领域的化学工具，通过其具有的荧光性质，可以用于生物成像、药物传递、疾病诊断等方面。
小分子荧光探针具有分子结构简单、稳定性好、探测灵敏度高等特点，在生物学研究中起着重要的作用。
小分子荧光探针的种类繁多，根据其不同的结构和功能特点，可以分为许多不同的类别。
常见的小分子荧光探针包括有机荧光探针、金属配合物荧光探针、聚合物荧光探针等。
有机荧光探针是指由有机化合物构成的荧光探针，其分子结构多样，可以通过调整结构来实现特定的探测目标。
常见的有机荧光探针包括荧光染料、荧光蛋白等。
荧光染料具有较强的荧光强度和良好的化学稳定性，可以用于细胞成像、生物传感等领域。
荧光蛋白是一类来源于特定生物体的蛋白质，其具有自身天然的荧光性质，可以通过基因工程技术进行改造和调整，广泛应用于生物研究中。
金属配合物荧光探针是指由金属离子与配体形成的荧光探针，其具有较强的荧光性能和较长的寿命。
金属配合物荧光探针具有选择性较高的特点，可以用于特定金属离子的探测和诊断。
常见的金属配合物荧光探针包括铜离子、锌离子、铁离子等的配合物。
聚合物荧光探针是指由高分子聚合物构成的荧光探针，其具有较好的溶解性和稳定性。
聚合物荧光探针可以通过调整聚合物的结构和链长来实现特定的探测需求。
常见的聚合物荧光探针包括聚合物分子探针、聚合物纳米探针等。
总之，常见的小分子荧光探针种类繁多，具有不同的结构和功能特点，可以根据具体的研究需求选择适合的荧光探针进行应用。
这些小分子荧光探针为生物学研究提供了有力的工具，有助于深入理解生命的基本过程和疾病的发生机制。
未来，随着技术的不断发展和突破，相信小分子荧光探针在生物领域的应用会得到更广泛的推广和应用。
1.2文章结构1.2 文章结构本文主要围绕"常见的小分子荧光探针种类"展开讨论。
文章分为引言、正文和结论三个部分。
在引言部分，将进行概述、文章结构和目的的介绍。
关于荧光探针综述的推文
关于荧光探针综述的推文荧光探针是一种能够发出荧光信号的化学物质，广泛应用于生物医学研究、药物研发、环境监测等领域。
本文将全面、详细、完整地探讨荧光探针的相关内容。
具体内容如下：一、荧光探针的定义在科学研究和实践中，荧光探针指的是那些能够通过吸收外部光能并发出荧光信号的化合物。
荧光探针通常包括一个荧光基团和一个靶向分子，通过针对特定分子或环境的结构改变而改变荧光特性。
荧光探针在生物、化学、材料等领域具有广泛的应用前景。
二、荧光探针的种类根据应用领域和工作原理，荧光探针可以分为多种类型。
以下是几种常见的荧光探针类型：2.1 荧光标记物荧光标记物是一种将荧光探针与其他生物分子（如蛋白质、核酸等）结合起来，以实现对这些分子的检测和定位的工具。
荧光标记物的使用使得生物分子的研究更加便捷、准确，并且可以实时观察其在细胞和组织中的位置和行为。
2.2pH指示剂pH指示剂是一种能够通过改变荧光特性来反映溶液pH值的荧光探针。
pH指示剂的应用非常广泛，包括生物体内外环境的监测、生物体内pH调控的研究等。
2.3 金属离子探针金属离子探针是一类能够高效选择性地与金属离子结合并发出荧光信号的荧光探针。
金属离子在生物体内扮演着重要的角色，而金属离子探针的应用可以帮助研究人员更好地了解金属离子在生物过程中的功能和机制。
生物分子传感器是一种能够检测细胞内特定生物分子的浓度和动态变化的荧光探针。
生物分子传感器的应用对于研究细胞过程以及药物研发具有重要意义，可以帮助研究人员更好地了解生物分子的功能和相互作用。
三、荧光探针的设计原则荧光探针的设计与合成并非易事，需要考虑多个因素。
以下是一些常用的荧光探针设计原则：3.1 高荧光量子产率好的荧光探针应该具有高荧光量子产率，即在吸收光能后能够高效地发出荧光信号。
这可以通过合理设计荧光基团以及控制荧光探针的分子结构来实现。
3.2 选择性荧光探针应该具有高选择性，即只与目标分子或环境产生特异性相互作用。
DAPI和Hoechst-PI染料
DAPIDAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用于荧光显微镜观测。
因为DAPI可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的染色。
DAPI介绍在荧光显微镜观察下，DAPI染剂是利用紫外光波长的光线激发。
当DAPI与双股DNA 结合时，最大吸收波长为358nm，最大发射波长为461nm，其发散光的波长范围含盖了蓝色至青绿色。
DAPI也可以和RNA结合，但产生的荧光强度不及与DNA结合的结果，其发散光的波长范围约在500nm左右。
DAPI的发散光为蓝色，且DAPI和绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)或Texas Red染剂(红色荧光染剂)的发散波长，仅有少部分重叠，研究员可以善用这项特性在单一的样品上进行多重荧光染色。
DAPI能快速进入活细胞中与DNA结合，因此DAPI对生物体而言，也被视为一种毒性物质与致癌物。
使用过程中应注意操作与抛弃的处理程序。
中文名：4，6-联脒-2-苯基吲哚(?)英文名：4',6-diamidino-2-phenylindole，2-(4-amidinophenyl)-1H -indole-6-carboxamidine，DAPI dihydrochloride分子式：C16H15N5分子量：277.324CAS number：28718-90-3光谱性质：DAPI的最大激发波长为340nm，最大发射波长为488nm与双链DNA结合时最大吸收/最大发射为358 nm/461 nm；与RNA结合时，最大发射移动到400 nm左右。
DAPI染色原理：DAPI 为一种荧光染料，可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光，和EB相比，对双链DNA的染色灵敏度要高很多倍。
BODIPY类荧光染料的研究进展.
第40卷第7期2012年4月广州化工Guangzhou Chemical Industry Vol．40No．7April．2012BODIPY 类荧光染料的研究进展洪雪华,生瑜(福建师范大学化学与材料学院,福建福州350007摘要:BODIPY (氟化硼二吡咯类荧光染料作为一类新兴的荧光染料,因其良好的光物理性质,在过去的二十年内得到广泛的研究。
对BODIPY 的中心骨架进行官能化,可形成一系列衍生物用于环境监测和生物科学等领域研究。
文章主要对近年来有关BODIPY 的官能化及作为荧光探针、荧光标记、光敏剂的应用加以综述。
关键词:BODIPY ;官能化;荧光探针;荧光标记;光敏剂中图分类号:O626．13文献标识码:A文章编号:1001－9677(201207－0065－05作者简介:洪雪华(1986－,女,硕士研究生,研究方向:功能高分子材料。
通讯作者:生瑜(1966－,男,研究员,博士,研究方向:高分子功能改性。
Progress on the BODIPY Fluorescent DyesHONG Xue －hua ,SHENG Yu(College of Chemistry and Materials Science ,Fujian Normal University ,Fujian Fuzhou 350007,ChinaAbstract :As a new fluorescent dye ,dipyrromethene boron difuoride (BODIPY was investigated intensively over the last two decades due to their excellent photophysical properties．Functionalization of the BODIPY core would form a series ofderivatives ,which can be used in the fields of environmental monitoring and biological sciences ,etc．Functionalization method of BODIPY dyes and their used as fluorescence probes ,fluorescence labels and photosensitizer in recent years were reviewed．Key words :BODIPY ;functionalization ;fluorescence probe ;fluorescence labeling ;photosensitizer荧光分析法具有灵敏度高、选择性高、方法简便快捷、试样用量少等优点,已经被广泛的应用于生物、化学、医药、卫生、农业、环境保护等领域中。
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苯乙烯类菁染料pH荧光探针在细胞荧光成像中的应用及细胞毒性检测黄丽霞;刘香;崔丹婷;许乙凯;游文玮;严轶琛;路新卫;刘瑞源【摘要】目的：制备一种苯乙烯类菁染料用于细胞活体荧光成像。
方法将1,1,2-三甲基-1氢-苯并吲哚和4-吡啶苯甲醛反应得到苯乙烯类菁探针，考察pH对苯乙烯类菁探针荧光性能的影响，检测探针对细胞活性的影响，最后将苯乙烯类菁探针作为探针应用于活细胞成像。
结果制备的苯乙烯类菁探针在中性和碱性条件下显示绿色荧光，在酸性条件下荧光发生由绿色变成橙色。
该探针用于细胞活体成像荧光信号清晰可见。
结论研制出了一种用pH敏感的苯乙烯类菁探针，该探针表现出了较好的细胞穿透性和细胞活体成像性能。
%Objective To prepare a pH fluorescence probe based on styrylcyanine dyes for live cell imaging. Methods The Probe 1 was prepared by reaction of 4-pyridinecarboxaldehyde with 1,1,2-trimethylbenz[e]indole. The influence of pH on the fluorescent properties was examined, and the cell viability was examined using cell counting kit-8. The Probe 1 was used as a pH fluorescence probe in living cell. Results Probe 1 emitted green fluorescence under neutral and basic conditions but orange fluorescence under acid condition. Probe 1 selectively stained the cytoplasmic regions of living cells without significantly affecting the cell viability. Conclusion The pH-sensitive fluorescent probe prepared based on styrylcyanine possesses good ability of cell membrane permeation for live cell fluorescent imaging.【期刊名称】《南方医科大学学报》【年(卷),期】2014(000)011【总页数】4页(P1642-1645)【关键词】苯乙烯类菁;pH荧光探针;细胞成像;细胞毒性【作者】黄丽霞;刘香;崔丹婷;许乙凯;游文玮;严轶琛;路新卫;刘瑞源【作者单位】南方医科大学南方医院影像中心，广东广州 510515;南方医科大学南方医院影像中心，广东广州 510515;南方医科大学南方医院影像中心，广东广州 510515;南方医科大学南方医院影像中心，广东广州 510515;南方医科大学药学院，广东广州 510515;南方医科大学药学院，广东广州 510515;南方医科大学药学院，广东广州 510515;南方医科大学药学院，广东广州 510515【正文语种】中文Abstract：ObjectiveTo prepare a pH fluorescence probe based on styrylcyanine dyes for live cell imaging.MethodsThe Probe 1 was prepared by reaction of 4-pyridinecarboxaldehyde with 1,1,2-trimethylbenz[e]indole.The influence of pH on the fluorescent properties was examined,and the cell viability was examined using cell counting kit-8.The Probe 1 was used as a pH fluorescence probe in livingcell.ResultsProbe 1 emitted green fluorescence under neutral and basic conditions but orange fluorescence under acid condition.Probe 1 selectively stained the cytoplasmic regions of living cells without significantly affecting the cell viability.ConclusionThe pH-sensitivefluorescent probe prepared based on styrylcyanine possesses good ability of cell membrane permeation for live cell fluorescent imaging.Key words：styrylcyanine;pH fluorescent probe;cell imaging;cytotoxicity细胞内pH在细胞增生和凋亡，酶催化活性，离子转运及肌肉收缩等过程中扮演着重要角色［1］。
一般情况下细胞内存在两个较宽的pH范围：pH=6.8～7.4，如细胞质，pH=4.5～6.0，即所谓的酸性细胞器，如溶酶体［2］。
细胞功能紊乱，癌症，老年痴呆症等疾病会导致细胞内pH值偏离正常值［3］。
因此检测细胞内pH变化对研究细胞的生理和病理过程具有重要作用。
近年来发展起来的生物荧光成像技术具有快速无损伤，直观，灵敏度高等特点，已广泛用于监控细胞内pH的变化［4-5］。
菁染料由于具有优良的光学性能，作为荧光探针广泛应用于生物检测和成像中［6-7］。
在水溶液中，吲哚N原子上没有取代基的菁染料可以产生质子化和去质子作用，这种作用改变菁染料的荧光性能而被用于pH荧光检测［8-9］，但未见用于活细胞荧光成像的报道。
苯乙烯类吲哚菁染料具有良好的光稳定性、合适的水溶性及很好的细胞膜通透性,而且在细胞内具有较强的荧光［10］。
这类染料的合成非常简单，收率高。
为此，本文设计合成基于苯乙烯类菁染料的荧光探针，检测pH对其荧光性能的影响，并成功地将其用应用于活细胞荧光成像。
1.1 材料和仪器布鲁克DMX 400 MHz核磁共振仪；岛津FTIR-8100红外光谱仪（KBr压片）；元素分析仪；PTI2C2700 Felix荧光分光光度计（美国PTI公司）。
1 ,1 ,2 -三甲基-1氢-苯并吲哚（百灵威试剂，AR）；4-吡啶苯甲醛（百灵威试剂，AR）；三氟乙酸（百灵威试剂，AR）；N,N-二甲基甲酰胺（DMF），四氢呋喃（THF），无水乙醇，乙酸乙酯和正己烷（金华大试剂，AR）。
试剂均未经进一步纯化而直接使用。
实验用水为二次去离子水。
人宫颈癌细胞株HeLa由南方医院中心实验平台提供；1640培养液和胎牛血清（FBS）购于Hyclone公司，MTT试剂和二甲基亚砜（DMSO）购于Sigma公司。
培养液体积分数为10%的胎牛血清，1%青霉素和链霉素的1640培养基，37℃恒温培养。
1.2 探针的合成在100 ml烧瓶中，加入1,1,2-三甲基-1氢-苯并吲哚（2.09 g，10 mmol），4-吡啶苯甲醛（1.07 g，10 mmol），50 ml无水乙醇和1滴哌啶，加热回流24 h。
旋蒸除去乙醇。
残余物用二氯甲烷作洗脱剂经硅胶柱层析分离纯化，重结晶得到黄色固体1.91 g，收率64%。
1H NMR （400 MHz,DMSO）δ（ppm）=8.65（d,J=4.7,2H）,8.19 （d,J=8.4,1H）,8.04（d,J=8.2,1H）,7.97（d,J=8.5,1H）, 7.82（dd,J=13.2,7.7,4H）,7.69（s,1H）,7.67-7.60（m,1H）,7.52（t,J=7.5,1H）,1.65（s,6H）。
13C NMR（101 MHz,DMSO）δ=184.29,150.74,150.20,143.00,139.83,134.40,132.20,129.46,129.05,128.04,126.75,124.89,123.59,123.05,121.72,120.18,54.22,21.85.IR（v-1,LiBr）:3050,2973,2927,2836,1595,1545,1502,1461,1415,1217,970,823,744.MS（MALDI-TOF）: C21H18N2 m/z 298.1470 for［M］+Na+.321.1362. Elemental Analysis:Calcd C,84.53;H,6.08;N,9.39. Found C,85.04;H,6.11;N,8.85.1.3 荧光检测配制300 mol/L探针的DMSO溶液，备用。
取0.1 ml探针DMSO溶液于10 ml 容量瓶中，加入不同pH水溶液1 ml后，双蒸水稀释至10 ml，检测荧光强度。
测量荧光强度时，激发波长为384 nm，狭缝宽度为1.0 nm/ 1.0 nm。
1.4 细胞培养和成像取对数生长期的HeLa细胞接种于置有6孔板中,培养过夜，换用含有6 mol/ml探针1的1640培养液继续培养HeLa细胞4 h后，采用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗6孔板3次，置于倒置荧光显微镜（IX71倒置显微镜，奥林巴斯）下观察。
探针的激发光为510～550 nm的绿光波段。
1.5 MTT法检测细胞生长活性将HeLa细胞以每孔6×103个细胞接种于96孔板，培养过夜，换用含有探针终浓度分别为1～10 mol/ml的培养液，每孔200 L继续培养24 h后，吸弃上清液，每孔加入10 L MTT试剂（5 mg/ml，用PBS配制），继续培养4 h。
弃去培养液，每孔加入150 L DMSO，置于细胞摇床中10 min，至蓝色颗粒完全溶解，转移至酶标仪（ELX800全自动酶标仪，美国宝特仪器有限公司）490 nm处测定各孔吸光度值，以含有细胞的培养液和MTT为对照组，以只加等量的培养液和MTT 为空白孔。
按照此公式计算细胞存活率：细胞存活率（%）=（实验孔吸光度值-空白孔吸光度值）/（对照孔吸光度值-空白孔吸光度值）×100%。