激光扫描共聚焦显微镜图文讲解
共聚焦激光扫描荧光显微镜简介以及原理ppt课件
物镜
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谢谢！
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• 通过精细平面光切，形成生物样品不同平 面的精细图象，将一个连续的光切图象Z轴 重叠就可形成一个完整的三维图象
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• 切片的厚度受物镜的数值孔径和针孔直径 影响，比如60X，NA1.4的镜头当针孔设定 为1mm时，光学切片厚度为0.4微米。
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光电倍增管 扫瞄装置
共焦针孔
空气冷却氩激光器
488nm 520nm
双色镜：双色分光镜；反射短波长，透过长波长。 阻断滤镜：多为长通滤色镜；LP490
450nm 490nm
FITC
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荧光显微镜的不足:
1.无法实现对荧光,透射光的同时采集,无法实现多重 荧光的同时采集及共定位。 2.荧光散射光太强，造成实际分辨率的大大下降。 3.荧光漂白及对细胞组织的照射损伤。 4.无法对样品进行断层扫描,完成3D的工作。 5.滤镜对荧光信号衰减大,灵敏度—荧光强度不够。 6.可以观查活细胞或组织但细胞或组织内结构高度重 叠 7.只能在二维环境下观察。 8.样品不能太厚。 9.荧光的串绕无法回避。 10.放大倍率小。
Leica TCS SP-2 MP AOBS Confocal System
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• Nikon的 Eclipse C1 Plus
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• 1.性能卓越的平场复消色差TIRF物镜（ 60x ， 100x）， NA = 1.49.。这是当前数值孔径最 高的油浸物镜 • 2.四孔位针孔转盘：用电脑控制针孔的大小， 可在分辨率和光切厚度之间取得最佳平衡。 • 3.时间间隔可变的Time Lapse: 可以在拍摄过 程中不同的时间段采用不同的时间间隔。
共聚焦激光扫描PPT课件
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共聚焦显微镜的优点
减少由于光散射产生的图像模糊 增加有效分辨率 提高信噪比 厚标本的清楚细查 Z轴扫描 可以实现数字放大倍率的调节
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Wide-field microscopy
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Fluorescent Microscope
Objective
Arc Lamp
Excitation Diaphragm Excitation Filter
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基于共聚焦原理的皮肤在体三维成像技术
探测器 激光束
小孔
聚焦透镜 分光器
光学扫描 物镜
组织样品
Quarter Wave Plate 窗口
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色素痣
A
明亮的黑素细胞巢围绕真 皮乳头呈圆形或椭圆形分布， 细胞形态规则，大小及明亮度 均一。细胞间有间隔。
B
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对皮肤疾病的治疗与疗效评估需 要先进的皮肤诊断技术
Emission Filter
Emission Filter Emission Pinhole
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原理示意图
光源（激光） 二色镜。 物镜 样品 针孔 检测仪 共焦显微镜的最大优点是可以只 从一个平面收集光。 针孔同焦平面成对（即共焦）， 使得来自焦平面以外的光远离检 测仪。 激光扫描显微镜按顺序一点一点 地、一行一行地扫描样品，将象 素资料合成一个图象。通过移动 焦平面，单个图象（光限幅）可 以放在一起，形成可以以后进行 数字处理的三维栈。
Ocular
Emission Filter
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Confocal microscopy
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Confocal Principle
激光扫描共聚焦显微镜技术讲解
激光扫描共聚焦显微镜技术Laser Scanning Confocal Microscope——基础篇李治国细胞的内在生活显微镜的发展史没有显微镜就不可能有细胞学诞生。
1590年，荷兰眼镜制造商J 和Z.Janssen 父子制作了第一台复式显微镜。
1665年，英国人Robert Hook首次描述了植物细胞(木栓，命名为cella 。
1680年，荷兰人A.van Leeuwenhoek成为皇家学会会员，他一生中制作了200多台显微镜和400多个镜头，用设计较好的显微镜观察了许多动植物的活细胞与原生动物。
Made by A.van Leeuwenhoek (1632-1723.Magnification ranges at 50-275x.显微镜的最重要参数——分辨力显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨力（resolution ）有关。
分辨率是指区分开两个质点间的最小距离各种显微镜的分辨能力光学显微镜（light microscopy）0.2μm电子显微镜 (Electro microscopy 0.2nm扫描遂道显微镜 (scanning tunneling microscope 0.2nm以下 1932年，德国人M.Knoll 和E.A.F.Ruska 发明电镜，1940年，美、德制造出分辨力为0.2nm 的商品电镜。
1981年，瑞士人G.Binnig 和H.RoherI 在IBM 苏黎世实验中心（Zurich Research Center）发明了扫描隧道显微镜而与电镜发明者Ruska 同获1986年度的诺贝尔物理学奖。
常用的光学显微镜（light microscopy普通光学显微镜暗视野显微镜相差显微镜偏光显微镜微分干涉显微镜荧光显微镜激光共焦扫描显微镜普通光学显微镜原理普通光学显微镜原理图1. 构成：①照明系统②光学放大系统③机械装置2. 原理：经物镜形成倒立实像，经目镜放大成虚像。
激光扫描共聚焦显微镜(研究生)1ppt课件
Pathway415、 Pathway435 800系列
CARVⅡ C1 TCS-SP2 FV300
FV1000 尼Ul康tra（Vnieikwo™n）C1-plus
IN Cell Analyzer 3000
TauMap
LSM 510 SYSTEM LSM 510 PASCAL SYSTEM
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荧光光谱
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分隔发射的荧光
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Separation of fluorescence emissions by means of dichroic filters
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（四）计算机系统
控制硬件的软件功能：
①控制电动显微镜； ②选择激光波长，调节激光强度； ③拍摄2-5维图像； ④选择光谱拍摄范围，分辨率，激发光 挡片位置。
（10）、可即时或延时进行扫描
ROI(region of interesting，感兴趣区域） 实时（real time）显示
（11）、有线和帧方式的多重扫描功能
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（12）、在改变扫描分辨率及扫描速度等后，无 须很复杂地对仪器参数重新设置
（13）、有记忆功能
（14）、有专用的图象数据库 （15）、系统采用模块化设计，便于整个系统 的扩展和升级换代
有多种方式选择，支持盲法拆分，方便用户使用；
⑾具有专业的FRAP（荧光漂白），FRET（荧光能
量共振转移）软件包。 精选课件PPT
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三、激光扫描共聚焦显微镜的使用步骤
（一）样品制备
激光扫描共聚焦显微镜技术讲座 ppt课件
荧光探针的选择
合适的荧光探针是有效地进行实验并获取理想实 验结果的保障。
(1)现有仪器所采用的激光器 (2)荧光探针的光稳定性和光漂白性 (3)荧光的定性或定量
定性:单波长激发探针 定量:双波长激发比率探针 (4)荧光探针的特异性和毒性。 (5)荧光探针适用的pH
LSCM 的发展 1957年 提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，并获
得了美国的专利。
1967年 成功的应用共聚焦显微镜产生了一个光学横面。 1970年 牛津和阿姆斯特丹同时向科学界推荐了一种新型
的扫描共聚焦显微镜。
1984年 Bio-Rad公司推出了世界第一台共聚焦显微镜品。 1987年 White和Amos在英国《自然》杂志发表了“共聚焦
2、球差：
由主轴上某一物点向光学系
统发出的单色圆锥形光束，经该 光学系列折射后， 不能聚焦成 一点,使成像模糊不清,形成一弥 散光斑(俗称模糊圈)，则此光学 系统的成像误差称为球差。
3、色差： 由白色物点向光学系统发出一束
白光，经该光学系列折射后，组成该 束白光的红、橙、黄、绿、青、蓝、 紫等各色光，不能会聚于同一点，即 白色物点不能结成白色像点，而结成 一彩色像斑的成像误差，称为色差。
*
不同的荧光探针在不同标本的效果常有差
异，故除综合考虑以上因素以外，有条件者应进
行染料的筛选，以找出最适的荧光探针。
*
许多荧光探针是疏水性的，很难或不能进
入细胞，需使荧光探针与AM（乙酰羟甲基酯）
结合后变成不带电荷的亲脂性化合物方易于通过
质膜进入细胞，在细胞内荧光探针上的AM被非
特异性酯酶水解，去掉AM后的荧光探针不仅可
荧光共聚焦 激光扫描共聚焦ppt课件
18Biblioteka THANK YOU19
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只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动 到共焦平面上，样品的新层面又成像在显色器上。
分辨率：0.18μm
点照明，具有照明点和探测点，具有扫描系统，逐点扫描 成像
具有四个荧光通道，可同时探测多个被标记物，一个透射 光道，同时采集透射光图像（非共焦图像）
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弧灯 膜
目镜
孔
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02 应用
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Phe
红树植物秋茄
与GC-MS检测浓度相符
Pyr
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黑麦草
洋葱
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北京化工 大学
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A surfactant template-assisted strategy for synthesis of ZIF-8 hollow nanospheres
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(a) Preparation process for HCPT@ZIF-8 hollow nanospheres. (b,c) CLSM of HCPT@ZIF-8 hollow nanospheres (scale bar 1 μm). (d,e) SEM of HCPT@ZIF-8 hollow nanospheres (scale bar 1 μm; scale bar 100 nm).
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荧光显微镜
• 利用一定波长的光使样品受到激发，产生不同颜色的荧光，以用来观察和 分辨样品中某些化学成分和细胞组分的一种显微镜。
• 自发荧光：组织，细胞不经荧光色素染色，在紫外光照射下，某些成分所 呈现的荧光。
• 继发性荧光：组织，细胞经荧光色素染色，由于荧光色素和组织细胞内的 某种成分结合后而呈现的荧光。
激光扫描共聚焦显微镜图文讲解
激光扫描共聚焦显微镜吴旭2008.10.14高级显微镜原理正置、倒置显微镜细胞遗传工作站活细胞工作站激光显微分离系统激光共聚焦显微镜概述激光扫描共聚焦显微镜（Laser scanning confocalmicroscope ，LSCM ）生物医学领域的主要应用通过一种或者多种荧光探针标记后，可对固定的组织或活体样本进行亚细胞水平结构功能研究高空间分辨率、非介入无损伤连续光学切片、三维图像、实时动态等细胞结构和功能的分析检测……Conventional fluorescence microscope Confocal microscope历史1957年，Marvin Minsky提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，获得了美国的专利。
1967年，Egger 和Petran 成功地应用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面。
1977年，Sheppard 和Wilson 首次描述了光与被照明物体的原子之间的非线性关系和激光扫描器的拉曼光谱学。
1984年，Biorad 为公司推出了世界第一台商品化的共聚焦显微镜，型号为SOM-100，扫描方式为台阶式扫描。
1986年MRC-500型改进为光束扫描，用作生物荧光显微镜的共聚焦系统。
Confocal microscopy comes of ageJG White & WB Amos. Nature 328, 183 -184 (09 July 1987Zeiss 、Leica 、Meridian 、OlympusZeiss LSM510 激光扫描共聚焦显微镜Zeiss LSM510 META 激光扫描共聚焦显微镜Zeiss LSM510 META 激光扫描共聚焦显微镜Nikon A1R 激光扫描共聚焦显微镜Prairie UltimaIV 活体双光子显微镜国家光电实验室（武汉）自制随机定位双光子显微镜Leica TCS SP5 激光共聚焦扫描显微镜基本原理相差、DIC 常用荧光标记共聚焦原理Two ways to obtain contrast in light microscopy. The stained portions of the cell in(A reduce the amplitude of light waves of particular wavelengths passing through them.A colored image of the cell is thereby obtained that is visible in the ordinary way. Light passing through the unstained, living cell (B undergoes very little change in amplitude, and the structural details cannot be seen even if the image is highly magnified. The phase of the light, however, is altered by its passage through the cell, and small phase differences can be made visible by exploiting interference effects using a phase-contrast or a differential-interference-contrast microscope.D. Phase-contrast or adifferential-interference-contrast microscopeFour types of light microscopy. (A The image of a fibroblast in culture obtained by the simple transmission of light through the cell, atechnique known as bright-field microscopy.The other images were obtained by techniques discussed in the text: (B phase-contrast microscopy, (C Nomarski differential-interference-contrast microscopy, and (D dark-field microscopy.常用荧光探针Proteins Nucleic Acids DNA Ions pH Sensitive Indicators Oxidation States Specific Organelles荧光显微镜原理明场：透射荧光：落射落射的优点：物镜的聚光镜作用使视场均匀，发射光强度高。
激光扫描共聚焦显微镜教学课件
缺点
昂贵
激光扫描共聚焦显微镜的价格相对 较高，不是所有的实验室都能够负
担得起。
需要专业操作
使用该显微镜需要一定的专业知识 和技能，对操作者的要求较高。
样本制备要求高
由于该显微镜对样本的厚度和折射 率等参数敏感，因此需要精心制备 样本。
维护成本高
激光扫描共聚焦显微镜的维护成本 也相对较高，需要定期检查和保养 。
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激光扫描共聚焦显微镜的 优缺点
优点
高分辨率
激光扫描共聚焦显微镜利用激光束进行 扫描，可以实现比传统显微镜更高的分 辨率。
灵敏度高
由于激光束的强度高，该显微镜对样本 的灵敏度也相应提高，可以检测到较弱 的荧光信号。
减少光损伤
共聚焦技术只对焦点处的样本进行照明 ，有效减少了光损伤。
三维成像
激光扫描共聚焦显微镜可以采集样本的 三维图像。
仪器清洁
清洁显微镜的透镜和其他部件，以确保观察的清晰度和准确 性。
图像获取
参数设置
在获取图像前，需要设置激光扫描共聚焦显微镜的参数，如扫描速度、扫描分辨 率、激光波长等。
图像获取
通过激光扫描共聚焦显微镜获取细胞样本的图像。
数据分析
对获取的图像进行处理，以提 高其清晰度和对比度。
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数据测量
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图像处理
显微镜控制和分析软件。
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基于图形用户界面，方便用户进行样本观察、图像获
取和数据分析。
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支持多种组织样本类型，包括免疫荧光、荧光原位杂
交等。
Definiens Developer
一种基于规则和智能图像分析软 件，用于构建细胞和组织图像分
析流程。
提供强大的图像处理和分析工具 ，包括图像预处理、特征提取、
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激光扫描共聚焦显微镜
吴旭
2008.10.14
高级显微镜原理
正置、倒置显微镜
细胞遗传工作站
活细胞工作站
激光显微分离系统激光共聚焦显微镜
概述
激光扫描共聚焦显微镜
（Laser scanning confocalmicroscope ，LSCM ）生物医学领域的主要应用
通过一种或者多种荧光探针标记后，可对固定的组织或活体样本进行亚细胞水平结构功能研究
高空间分辨率、非介入无损伤连续光学切片、三维图像、实时动态等细胞结构和功能的分析检测……
Conventional fluorescence microscope Confocal microscope
历史
1957年，Marvin Minsky提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，获得了美国的专利。
1967年，Egger 和Petran 成功地应用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面。
1977年，Sheppard 和Wilson 首次描述了光与被照明物体的原子之间的非线性关系和激光扫描器的拉曼光谱学。
1984年，Biorad 为公司推出了世界第一台商品化的共聚焦显微镜，型号为SOM-100，扫描方式为台阶式扫描。
1986年MRC-500型改进为光束扫描，用作生物荧光显微镜的共聚焦系统。
Confocal microscopy comes of ageJG White & WB Amos. Nature 328, 183 -184 (09 July 1987
Zeiss 、Leica 、Meridian 、Olympus
Zeiss LSM510 激光扫描共聚焦显微镜
Zeiss LSM510 META 激光扫描共聚焦显微镜
Zeiss LSM510 META 激光扫描共聚焦显微镜
Nikon A1R 激光扫描共聚焦显微镜
Prairie UltimaIV 活体双光子显微镜
国家光电实验室（武汉）自制随机定位双光子显微镜
Leica TCS SP5 激光共聚焦扫描显微镜
基本原理相差、DIC 常用荧光标记共聚焦原理
Two ways to obtain contrast in light microscopy. The stained portions of the cell in
(A reduce the amplitude of light waves of particular wavelengths passing through them.
A colored image of the cell is thereby obtained that is visible in the ordinary way. Light passing through the unstained, living cell (
B undergoes very little change in amplitude, and the structural details cannot be seen even if the image is highly magnified. The phase of the light, however, is altered by its passage through the cell, and small phase differences can be made visible by exploiting interference effects
using a phase-contrast or a differential-interference-contrast microscope.
D. Phase-contrast or a
differential-interference-
contrast microscope
Four types of light microscopy. (A The image of a fibroblast in culture obtained by the simple transmission of light through the cell, atechnique known as bright-field microscopy.The other images were obtained by techniques discussed in the text: (B phase-contrast microscopy, (C Nomarski differential-interference-contrast microscopy, and (D dark-field microscopy.
常用荧光探针
Proteins Nucleic Acids DNA Ions pH Sensitive Indicators Oxidation States Specific Organelles
荧光显微镜原理
明场：透射荧光：落射
落射的优点：
物镜的聚光镜作用使视场均匀，发射光强度高。
激发光损失小，荧光
效应高。
共聚焦原理
由于pinhole 的存在，使得部分杂散光（虚线部分）没有被PMT 探测器探测到，从而提高了成像效果。
通过对样品在x-y 方向上的逐点扫描，可以形成二维图像。
如果调解焦平面在z 方向的位置，连续扫描多个不同z 位置的二维图像，则可以形成一个3D 图像，3D
的重建需要软件的支持。
The unique scanning module is thecore of the LSM 510 META.
It contains motorized collimators, scanning mirrors,individually adjustable and positionablepinholes, and highly sensitive detectors including the META detector.
All these components are
arranged to ensure optimum specimen illumination and efficient collection of reflected or emitted light. A highly efficient optical grating provides an innovative way of separating the fluorescence emissions in the META detector.
The grating projects the entire fluorescence spectrum onto the 32 channels of the META detector. Thus, the spectral signature is acquired for each pixel of the scanned image and subsequently can be used for the
digital separation into component dyes.
分光镜组件结构
共聚焦构成
•光学显微镜
•激光光源
•扫描模块（包括共聚焦光路通道和针孔、扫描镜）•光检测器•计算机系统（数据采集、处理、转换应用）•图形输出设备
LCSM 照片，蓝色为细胞核，绿色为微管图像相关概念
RGB
三基色
图像数据位
亮度
对比度
饱和
分辩率
怎样得到样品图像
样品的标记物有合适的激发波长和发射波长荧光下观察选择合适的图象设置激光扫描的通道参数
设置图象的属性
调节每一个通道的亮度、对比度、清晰度、背景亮度
启动
共聚焦和CCD 照片的比较更大的动态范围
高灵敏度
图像背景的消除
灵活的拍照区域选择 ZOOM 功能
伪彩色
环境要求高
多通道图象合成
时间序列
Ca 离子成像
FRAP ：Fluorescence Redistribution After Photo bleaching
FRAP 是用来测定活细胞的动力学参数，借助于高强度脉冲激光来照射细胞某一区域，造成该区域荧光分子的光粹灭，该区域周围的非粹灭荧光分子会以一定的速率向受照射区域扩散，这个扩散速率可通过低强度激光扫描探测, 因而可得到活细胞的动力学参数。
LSCM 可以控制光粹灭作用，实时监测分子扩散率和恢复速率，反映细胞结构和活动机制。
广泛用于研究细胞骨架构成，核膜结构跨膜大分子迁移率，细胞间通讯等领域。
荧光漂白恢复（FRAP ）
实用文档
人卵细胞的局部光漂白
FRAP 研究ER-GFP 的核转位文案大全。