激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用-17954讲解
简述激光共聚焦显微镜的工作原理
简述激光共聚焦显微镜的工作原理
激光共聚焦显微镜是一种高分辨率显微镜，它利用激光束的聚焦作用和荧光探针的发光特性，可以在细胞和组织水平上观察生物分子的动态过程。
下面我们来详细了解一下激光共聚焦显微镜的工作原理。
激光共聚焦显微镜的工作原理基于激光束的聚焦作用。
激光束通过透镜系统聚焦到样品表面上，形成一个非常小的光点。
这个光点的大小和形状可以通过调整透镜系统的参数来控制。
当激光束聚焦到样品表面上时，样品中的荧光探针会被激发发出荧光信号。
这个荧光信号会被激光束收集并聚焦到探测器上，形成一幅荧光图像。
激光共聚焦显微镜的另一个重要特点是它的光学切片能力。
由于激光束的聚焦作用，激光共聚焦显微镜可以在样品内部形成一个非常小的光点，这个光点可以在样品内部移动，形成一系列的荧光图像。
通过这些荧光图像，我们可以重建出样品内部的三维结构，实现光学切片的效果。
激光共聚焦显微镜的工作原理还包括荧光探针的选择和激发波长的选择。
不同的荧光探针有不同的发光特性，可以用来标记不同的生物分子。
激发波长的选择也非常重要，不同的荧光探针有不同的激发波长，选择合适的激发波长可以提高荧光信号的强度和分辨率。
激光共聚焦显微镜是一种高分辨率显微镜，它利用激光束的聚焦作
用和荧光探针的发光特性，可以在细胞和组织水平上观察生物分子的动态过程。
它的工作原理包括激光束的聚焦作用、荧光探针的选择和激发波长的选择等。
通过激光共聚焦显微镜，我们可以更加深入地了解生物分子的结构和功能，为生命科学研究提供有力的工具。
扫描共聚焦显微镜原理及应用
扫描共聚焦显微镜原理及应用共聚焦显微镜（Confocal Laser Scanning Microscope，CLSM）是一种高分辨率的显微镜技术，它基于共聚焦原理实现了3D成像和光学切片功能。
本文将详细介绍共聚焦显微镜的原理以及主要应用领域。
共聚焦原理：共聚焦显微镜利用一束激光聚焦在样本上的一个点，只有这个点的荧光被激发并产生信号。
聚焦的点通过镜片的调整可以在三个维度上移动，从而扫描整个样品。
通过在激发激光束和荧光检测光之间放置一个光阑（pinhole），可以选择性地接收只来自焦点附近的光信号，从而去除来自样本其他区域的光信号。
这样，只有聚焦点的荧光信号被接收，实现了光学切片和3D成像。
共聚焦显微镜的应用：1.生物医学研究：CLSM广泛用于生物医学研究中，可以观察和研究单个细胞的形态、结构和功能。
例如，可以观察细胞器的分布和运动，研究细胞内信号传导通路的活动，以及探究生物分子的相互作用和交换。
2.神经科学：共聚焦显微镜广泛应用于神经科学研究中，可以观察活体神经元的形态和连接方式，研究神经元之间的相互作用以及突触的形成和重塑过程。
通过使用荧光标记的分子，可以研究神经元的突触传递和神经递质释放过程等。
3.细胞生物学：CLSM可以研究细胞分裂、增殖和凋亡过程，观察细胞的内部结构和细胞器，以及细胞内的动态过程。
还可以研究细胞与其周围环境的相互作用，例如细胞表面蛋白的分布和聚集。
4.药物研发：共聚焦显微镜可以用于药物研发过程中的细胞活性和药效评估。
通过观察和分析细胞中的信号通路活性和细胞的生理反应，可以评估药物的效果和毒性。
5.材料科学：共聚焦显微镜可以用于材料表面和界面的观察，以及材料的纳米结构和形貌的研究。
它在材料科学领域有着广泛的应用，例如纳米颗粒的制备和性能评估，纳米材料的光学和电学性质的研究等。
总结：共聚焦显微镜作为一种高分辨率的显微镜技术，通过共聚焦原理实现了3D成像和光学切片功能。
它在生物医学、神经科学、细胞生物学、药物研发和材料科学等领域有着广泛的应用。
激光扫描共聚焦显微镜原理及应用
激光扫描共聚焦显微镜原理及应用激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope）是一种高分辨率的显微镜技术。
它结合了光学和计算机技术，通过使用激光扫描技术将样品的逐点扫描成像，可以获取到非常清晰的三维图像。
激光扫描共聚焦显微镜的原理是基于共焦聚焦技术。
它使用一束激光光束照射在样品表面上，并收集激光光束的反射或荧光信号。
激光光束通过一个探测镜来聚焦在样品表面上的一个非常小的点上，该点称为焦点。
通过扫描样品，系统可以获取到完整的样品图像。
1.高分辨率：激光扫描共聚焦显微镜可以获得非常高的分辨率。
由于只有焦点附近的信息被收集，所以可以消除反射和散射带来的干扰，提高图像的清晰度和分辨率。
2.三维成像：激光扫描共聚焦显微镜可以进行多个焦面的扫描，从而获取到三维样品图像。
这使得可以观察样品的内部结构和深层次的信息。
3.高灵敏度：激光扫描共聚焦显微镜可以检测到样品的荧光信号。
这在生物医学领域中非常有用，可以用于观察细胞和组织中的荧光标记物。
4.实时观察：由于激光扫描共聚焦显微镜具有快速扫描和成像的能力，因此可以进行实时观察。
这对于研究动态过程和实时观察样品的变化非常有用。
在生物医学研究中，激光扫描共聚焦显微镜被广泛应用于观察和研究活细胞及组织的结构和功能。
它可以用于观察和研究细胞器的位置和运动、细胞的分裂过程、病理细胞的形态学变化等。
在材料科学研究中，激光扫描共聚焦显微镜可以用于观察和研究材料的结构和性质。
它可以帮助研究人员观察各种材料的微观结构、表面形貌以及材料中的缺陷和分子分布等。
在纳米技术研究中，激光扫描共聚焦显微镜可以用于观察和研究纳米材料的形态和结构。
它可以帮助研究人员观察纳米粒子的形状、大小和分布，研究纳米材料的组装过程和性质等。
总之，激光扫描共聚焦显微镜是一种非常强大并且在科学研究中得到广泛应用的显微镜技术。
它通过激光聚焦和扫描技术，可以获得高分辨率、三维成像和实时观察的样品图像，并且在生物医学研究、材料科学和纳米技术等领域有着重要的应用价值。
激光共聚焦显微镜原理及应用
场式照明（范围大）
载玻片 激发光束
点扫描（范围小）
场式显微镜的照明范围和照明深度都很大，而共聚焦显微 镜的照明则集中到焦平面的一个精确的焦点上。 标本的共聚焦图像是一种重建的图像，是从PMT采集的荧 光光子信号到电子装置之间的点到点的成像系统，而不是 从显微镜目镜直接观察到的实际图像。
可以对厚荧光标本（可以达到50μm或以上）进行精细的光
学切片，切片的厚度约为0.5到1.5 μm。 采集足够的光学切片，就能通过软件对其进行三维重建。
可以同时获取和显示多标记荧光。而且共聚焦显微镜可以
通过扫描单元内的滤光片转轮，采用不同程度的带通滤光 片，尽量减少多色荧光之间的波段叠加，（新型的共聚焦
传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像 都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光共聚焦显微 镜利用激光扫描束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面 上的每一点扫描，标本上的被照射点，在探测针孔处成像， 由探测针孔后的光电倍增管（PMT)，迅速在计算机监视器 屏幕上形成荧光图像。
共聚焦显微镜的优势
显微镜采用光栅加狭缝的方法可以随意调节发射荧光的波
段和带宽，因而可以更好的避免波段叠加），同时在激发 过程中可以采取顺序扫描方式，这样又避免了激发光对不 同荧光染料的交叉激发。
还可以在不改变物镜的情况下对标本进行放大扫描。
Confocal fluorescence images of a hacat cell (1 mm depth spacing)
PMT
检测器共焦针孔 离焦光线 发射荧光吸 收滤光片 聚焦光线 分光镜 物镜
激发滤光片
激光激 发光源
激发光线 光源共焦针孔 标本焦平面 标本
激光扫描共聚焦荧光显微镜的成像原理和基本结构 显微镜操作规程
激光扫描共聚焦荧光显微镜的成像原理和基本结构显微镜操作规程（激光扫描共聚焦荧光显微镜）是一种利用计算机、激光和图像处理技术获得生物样品三维数据、先进的分子细胞生物学的分析仪器。
紧要用于察看活细胞结构及特定分子、离子的生物学变化，定量分析，以及实时定量测定等。
成像原理接受点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器。
分光器将荧光直接送到探测器。
光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。
两者的几何尺寸一致，约100—200nm；相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。
这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。
以激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，终在屏幕上聚合成清楚的整个焦平面的共聚焦图像。
每一幅焦平面图像实际上是标本的光学横切面，这个光学横切面总是有确定厚度的，又称为光学薄片。
由于焦点处的光强宏大于非焦点处的光强，而且非焦平面光被针孔滤去，因此共聚焦系统的景深貌似为零，沿Z轴方向的扫描可以实现光学断层扫描，形成待察看样品聚焦光斑处二维的光学切片。
把X—Y平面（焦平面）扫描与Z轴（光轴）扫描相结合，通过累加连续层次的二维图像，经过专门的计算机软件处理，可以获得样品的三维图像。
即检测针孔和光源针孔始终聚焦于同一点，使聚焦平面以外被激发的荧光不能进入检测针孔。
激光共聚焦的工作原理简单表达就是它接受激光为光源，在传统荧光显微镜成像的基础上，附加了激光扫描装置和共轭聚焦装置，通过计算机掌控来进行数字化图像采集和处理的系统。
基本结构（激光扫描共聚焦显微镜系统）紧要包括扫描模块、激光光源、荧光显微镜、数字信号处理器、计算机以及图像输出设备等。
激光共聚焦显微镜系统的原理和应用
激光共聚焦显微镜系统的原理和应用激光扫描共聚焦显微镜是二十世纪80年代发展起来的一项具有划时代的高科技产品，它是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，把光学成像的分辨率提高了30%--40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察诸如Ca2+ 、PH值，膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学，分子生物学，神经科学，药理学，遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。
激光共聚焦成像系统能够用于观察各种染色、非染色和荧光标记的组织和细胞等，观察研究组织切片，细胞活体的生长发育特征，研究测定细胞内物质运输和能量转换。
能够进行活体细胞中离子和PH值变化研究（RATIO），神经递质研究，微分干涉及荧光的断层扫描，多重荧光的断层扫描及重叠，荧光光谱分析荧光各项指标定量分析荧光样品的时间延迟扫描及动态构件组织与细胞的三维动态结构构件，荧光共振能量的转移的分析，荧光原位杂交研究（FISH），细胞骨架研究，基因定位研究，原位实时PCR产物分析，荧光漂白恢复研究（FRAP），胞间通讯研究，蛋白质间研究，膜电位与膜流动性等研究，完成图像分析和三维重建等分析。
一.激光共聚焦显微镜系统应用领域：涉及医学、动植物科研、生物化学、细菌学、细胞生物学、组织胚胎、食品科学、遗传、药理、生理、光学、病理、植物学、神经科学、海洋生物学、材料学、电子科学、力学、石油地质学、矿产学。
二.基本原理传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面的每一点扫描，标本上的被照射点，在探测针孔处成像，由探测针孔后的光点倍增管（PMT）或冷电耦器件（cCCD）逐点或逐线接收，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。
照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面，克服了普通显微镜图像模糊的缺点。
激光共聚焦扫描显微镜使用原理讲解
1．激光共聚焦扫描显微镜的基本原理？与普通显微镜的区别？1.原理：激光共聚焦扫描显微镜利用激光束经光源前方的照明针孔（激发针孔）形成点光源，在物镜焦平面上形成一个轮廓分明的小点，激发出的荧光经原来的入射光路直接反向回到分光镜，并将荧光直接送到探测器前方的探测针孔（共聚焦针孔），通过探测针孔时先聚焦，由探测针孔后的光电倍增管逐点接收，在计算机屏幕上形成清晰的荧光图像。
照明针孔和探测针孔相对于物镜焦平面是共轭（共焦）的，即光点通过一系列的透镜，最终可同时焦聚于照明针孔和探测针孔。
这样，标本上的被照射点发射的荧光在探测针孔处成像，而来自该点以外的任何发射荧光均被探测针孔阻挡。
2.区别：共聚焦显微镜与普通显微镜相比有许多独特的优点，包括：可以控制焦深、照明强度、降低非焦平面光线的噪音干扰，从一定厚度标本中获取光学切片，即显微CT。
最核心的优点是降低噪音干扰：对于物镜焦平面的焦点处发出的光在针孔处可以得到很好地会聚，可以全部通过针孔探测器接收，而在焦平面上下位置发出的光在针孔处会产生直径很大的光斑，对比针孔的直径大小，则只有极少部分的光可以透过针孔被探测器接收。
而随着距离物镜焦平面的的距离越大，杂散光在探测针孔处的弥散斑就越大，能透过针孔的能量就越少，探测器上产生的信号就越小，这样就能有效防止杂质信号。
2．钙指示剂的类别和优缺点：1. 生物发光蛋白优点：不需要荧光激发系统，光毒性小。
缺点：不能通透细胞膜，对技术要求高，效率较低，需要较多的指示剂。
2. 荧光蛋白指示剂优点:比值测定，荧光信号强。
缺点：染料的信号可变度小，对PH值变化敏感。
3. Fura2（比值型）优点：避免实验设备、细胞类型、实验个体的差异，数据具有高度可比性。
缺点：紫外激发，一定的自发荧光，损害细胞的能量代谢。
4. Fluo3（非比值型）优点：激发，自发荧光小，对细胞的损害较小。
缺点：数据直接为荧光强度值，容易受染料浓度、细胞动态变化等因素的影响。
激光共聚焦扫描显微镜原理功能
激光共聚焦扫描显微镜原理功能激光共聚焦扫描显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，简称LSCM）是一种高分辨率的显微镜，通过激光光源和共聚焦扫描技术可以实现对样品的三维成像。
该显微镜原理独特，功能丰富，下面将详细介绍。
首先，让我们了解一下激光共聚焦扫描显微镜的工作原理。
激光共聚焦扫描显微镜的激光光源可以产生高能量、单色和高单频的激光束，然后通过一系列光学元件将激光聚焦到一个微细尖端，形成一个极小的焦点。
这个焦点可以对样品进行扫描，通过激光与样品之间的相互作用，得到一系列的反射或荧光信号。
这些信号经过光学系统的分光探测器进行收集与分析，可以获得高分辨率的图像。
1.高分辨率成像：激光共聚焦扫描显微镜的光学系统可以聚焦到亚米级尺寸的焦点，并收集样品表面或内部的成像信号。
相比传统的荧光显微镜具有更高的分辨率。
2.三维成像：激光共聚焦扫描显微镜可以通过扫描激光焦点在样品内部的位置，获取样品的三维信息。
可以使用自动扫描系统，将激光在X、Y、Z三个方向的位置进行扫描，实现高质量的三维成像。
3.荧光探测：激光共聚焦扫描显微镜常用于生物医学等领域的研究，可以通过荧光标记的样品来观察样品的分子组成和生物过程。
荧光探测技术可以提供对细胞和组织结构的高分辨率成像。
4.实时观察：由于激光共聚焦扫描显微镜可以实现高速扫描和数据采集，可以实时观察样品的动态变化。
这使得该技术在生物学和材料科学研究中非常有用。
5.光谱分析：激光共聚焦扫描显微镜可以使用多种光谱探测器来进行荧光信号的分析。
可以通过收集不同波长的荧光信号，获得样品中的各种分子或物质的信息。
6.激光刺激：激光共聚焦扫描显微镜也可以进行激光刺激实验。
通过选择合适的激光波长和功率，可以在细胞或样品的特定区域进行局部刺激。
这对于研究细胞生理和功能是非常重要的。
总之，激光共聚焦扫描显微镜具有高分辨率成像、三维成像、荧光探测、实时观察、光谱分析和激光刺激等功能。
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激光扫描共聚焦显微镜的原理和应用
Tina(2007-10-23 09:40:17
一、激光扫描共聚焦显微镜的原理
传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共焦显微镜(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM采用点光源照射样本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点，该点被照射后发出的荧光被物镜搜集，并沿原照射光路回送到由双色镜构成的分光器。
分光器将荧光直接送到探测器。
光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。
照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点被挡在探测针孔之外不能成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学切面，避免了非焦平面上杂散光线的干扰，克服了普通显微镜图像模糊的缺点，因此能得到整个焦平面上清晰的共聚焦图像。
原理图
二、激光扫描共聚焦显微镜组成特点
LSCM由显微镜光学系统，激光光源，扫描装置和检测系统构成，整套仪器由计算机控制，各部件之间的操作切换都可在计算机操作平台界面中方便灵活地进行。
显微镜是LSCM的主要组件，它关系到系统的成像质量。
通常有倒置和正置两种形式，前者在切片、活细胞检测等生物医学应用中使用更广泛。
三、激光扫描共聚焦显微镜的应用
一）细胞的三维重建
普通荧光显微镜分辨率低，显示的图像结构为多层面的图像叠加，结构不够清晰。
LSCM 能以0.1μm的步距沿轴向对细胞进行分层扫描，得到一组光学切片，经A/D转换后作为二维数组贮存。
这些数组通过计算机进行不同的三维重建算法，可作单色或双色图像处理，组合成细胞真实的三维结构。
旋转不同角度可观察各侧面的表面形态，也可从不同的断面观察细胞内部结构，测量细胞的长宽高、体积和断层面积等形态学参数。
通过模拟荧光处理算法，可以产生在不同照明角度形成的阴影效果，突出立体感。
通过角度旋转和细胞位置变化可产生三维动画效果。
LSCM 的三维重建广泛用于各类细胞骨架和形态学分析、染色体分析、细胞程序化死亡的观察、细胞内细胞质和细胞器的结构变化的分析和探测等方面。
二）静态结构检测：原位鉴定细胞或组织内生物大分子、观察细胞及亚细胞形态结构
1.细胞原位检测核酸
用于细胞核定位及其形态学观察、检测细胞内DNA的复制及断裂情况以及染色体定位观察。
2.原位检测蛋白质、抗体及其他分子
原位检测蛋白质、抗体及其他分子
免疫荧光标记技术
检测荧光蛋白
3.检测细胞凋亡
检测细胞凋亡不同时期细胞形态、细胞凋亡相关蛋白
4.细胞器观察及测定
探针可以直接跨过死细胞或活细胞膜，选择性地与特定细胞器结合
5.检测细胞融合
6.观察细胞骨架结构
7.观察细胞间缝隙连接通讯
8.检测细胞内脂肪
尼罗红检测动物组织中或体外培养细胞内脂滴含量
三）动态观察：活体细胞或组织功能的实时动态检测
1.实时定量测定细胞内钙的变化
钙离子浓度测定和比率成像
2.测定细胞内PH变化
同一种探针BCECF，分别用不同激发峰激发得到的荧光比例，探究PH变化
3.检测膜电位的变化
JC-1低电位下单体存在，发绿色荧光；高电位下J-聚集体，发红色荧光，随电位增加，红色荧光也增加
4.检测细胞内活性氧物种的产生
5.药物筛选
❖检测药物等跨膜进入组织或细胞过程及定位
❖对药物、病毒、细菌等荧光标记，检测是否进入、位置含量、动态过程
6.检测荧光共振能量转移-FRET
GFP和YFP，BFP和GFP等研究大分子间的相互作用
7．囊泡运输研究
利用胞吞/胞吐探针FM4-64，结合激光共聚焦、电镜、TIRF，检测囊泡的运动过程，探讨BFA对胞吞/胞吐过程的影响。
8.检测荧光漂白恢复
将待测细胞用荧光物质标记，淬灭；低强度激光扫描成箱，非淬灭分子移动，直接反映荧光标记物质及其结合物的运动，因此可用来研究缝隙连接通讯的快慢.
综上所述，激光扫描共焦显微镜由于其高分辨率、高灵敏度、高放大率等特点，在细胞水平上可作多种功能测量和分析，成为分析细胞学的一项重要研究手段。
随着LSCM设备和应用技术的不断完善，它在生物医学和生命科学领域里将起到更重要的作用。