LeicaSP8激光扫描共聚焦显微镜快速操作手册2013-5-13
徕卡激光测距仪使用说明书
徕卡激光测距仪使用说明书-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1徕卡激光测距仪使用说明书一、使用前的准备（一）电池的装入/更换打开仪器尾部的固定挡板。
向前推卡钮，向下将底座取下。
按住红色的卡钮推开电池盒盖。
安装或更换电池。
关闭电池盒盖，安装底座和卡扣。
当电池的电压过低时，显示屏上将持续闪烁显示电池的标志{B，21}。
此时应及时更换电池。
1、按照极性正确装入电池。
2、使用碱性电池（建议不要使用充电电池）。
3、当长时间不使用仪器时，请取出电池，以避免电池的腐蚀。
更换电池后，设置和储存的值都保持不变。
（二）多功能底底座固定挡板可以在下面的测量情况下使用：1、从边缘测量，将固定挡板拉出，直到听到卡入的声音。
2、从角落测量，将固定挡板拉出，直到听到卡入的声音，轻轻将固定挡板向右推，此时固定挡板完全展开。
仪器自带的传感器将辨认出固定挡板的位置，并将自动设置测量其准点。
（三）内置的望远镜瞄准器在仪器的右部有一个内置的望远镜瞄准器。
此望远镜瞄准器为远距离测量起到辅助的作用。
通过瞄准器上的十字丝可以精确地观察到测量目标。
在30米以上的测量距离，激光点会显示在十字线的正中。
而在30米以下的测量距离，激光点不在十字线中间。
（四）气泡一体化的水泡使仪器更容易调平。
（五）键盘1、开/测量键2、第二级菜单功能3、加+键4、计时（延迟测量）键5、等于[=]键6、面积/体积键7、储存键8、测量基准边键9、清除/关键10、菜单键11、照明键12、间接测量（勾股定律）键13、减-键14、BLUETOOTH（六）显示屏1、关于错误测量的信息2、激光启动3、周长4、最大跟踪测量值5、最小跟踪测量值6、测量基准边7、调出储存值8、储存常数9、主显示10、单位，包括乘方立方（2/3）11、顶的面积12、墙面积13、3个额外显示（如：测量中间值）14、BLUETOOTH蓝牙开/关15、第二级菜单功能开16、硬件故障17、间接测量-利用勾股定律18、间接测量-利用勾股定律-部分高度19、面积/体积20、带常数的测量21、电池充电量显示二、菜单功能（一）设置在菜单中可以改变设置，并将其长久保存，并在关机和更换电池后不改变。
Leica IP S 产品说明书
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Leica IP S
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目录
1. 重要信息 ............................................................................................................................................... 6
4. 仪器安装 .............................................................................................................................................24
2.1 安全说明 ...............................................................................................................................................................................11 2.2 警告 .........................................................................................................................................................................................12
徕卡激光扫描共聚焦显微镜SP8的使用、维护与常见问题剖析
徕卡激光扫描共聚焦显微镜SP8的使用、维护与常见问题剖析石春梅【摘要】本文以华中农业大学园艺植物教育部重点实验室细胞生物学实验平台现有的一套由德国徕卡公司生产的新型号TCS-SP8激光共聚焦扫描显微镜机组(文中简称SP8)为例,结合实际操作经验,从机组组成使用、软件的使用、使用中常见问题、用后维护及保养等方面进行了大量总结和探索,希望能够为初次使用仪器者及致力于该领域的科研工作者提供第一手直观详实易懂的操作规程.%In order to provide reference for the researchers and technologies on how to use the Laser scanning confocal microscope efficiently, taking a set of Laser confocal laser scanning microscope (the model is TCS-SP8) which was produced by Leica corporation in Germany as an example, a lot of suggestions and introdutctions about function, principle, structure, use of sofeware, instrumental management, experimental technology and analysis of common problems in use were disserted in this paper.【期刊名称】《激光生物学报》【年(卷),期】2017(026)006【总页数】7页(P570-576)【关键词】激光共聚焦显微镜;功能简介;常见问题【作者】石春梅【作者单位】华中农业大学园艺林学学院, 湖北武汉430070【正文语种】中文【中图分类】R318.51激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscopy，LSCM)是现今细胞生物学研究中不可缺的光影成像系统。
Leica共聚焦操作快速流程
Leica共聚焦操作快速流程（电子版在电脑桌面）开机：1.接通3 个电源插座；2.打开控制器和电脑：按照①→ ②→ ③→ ④→ ⑤→ ⑥的序号依次开机；注意:系统开机时，显微镜的载物台会作初始化 xy 移动，请确保载物台周围没有障碍物！此时也不要放置样品；禁止用手转动物镜！！！关机：1.按照⑥→ ⑤→ ④→ ③→ ②→ ①的序号依次关机；2.拔掉3个电源插座；注意:先关电脑，再关仪器！关激光器后，等5分钟左右，等风扇停止后，再关电源！激光器的开关： ON 钥匙转到垂直位置OFF 钥匙转到水平位置软件快速操作：1.在桌面上，双击打开显微镜控制软件的图标“LAS AF ”：2.出现如下图标，直接点击“OK ”直接点击“ OK ”3.进入软件操作界面后，点击“Configuration ”（1），然后点击“Laser Config ”（2），再打开所需要的激光器开关“ON/OFF ”（3）；1324.点击“Acquire ”；点击“SEQ ”125.选择物镜；注意：禁止用手转动物镜！！！选择物镜6.有多个染料需要多个通道时，点击“+ ”增加通道；7.比如：选中“Seq. 1 ”后，打开405激光器；选择探测器PMT 1；选择染料DAPI；2 138. 然后选中“ Seq. 2 ”后 ， 打开488激光器 （不关Laser 405，激光强度调到0）；选择探测器PMT 2；选择染料Alexa 488； 如果需要DIC 图像，则打开探测器“PMT Trans ”；注意： 探测器探测激发波长的范围 不能 与激光线重合！【 没有特殊需求，不要用“HyD 3”探测器！！ 】123少用HyD3DIC激光强度为09.点击软件左下方的“Live”，进行图像预览；调节“Gain”增加探测器探测信号的灵敏度（一点蓝）；调节“Offset”去背景（一片绿）；注意： Gain值必须小于 800 ！！这里可以结合增加激光强度和Gain值来调荧光信号。
激光共聚焦显微镜操作指南说明书
激光共聚焦显微镜操作指南说明书激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope）是一种高分辨率、高对比度的显微镜，广泛应用于生物医学研究、材料科学等领域。
本操作指南将详细介绍激光共聚焦显微镜的操作流程和基本操作技巧，帮助用户正确、高效地使用该设备。
一、设备准备在开始使用激光共聚焦显微镜前，需要进行以下设备准备：1. 检查电源线和数据线是否连接正常，确保设备供电和数据传输正常；2. 检查激光源是否正常工作，激光功率是否稳定；3. 检查镜头和滤光片是否清洁，清除灰尘和污渍，确保成像质量；4. 准备适当的标本样品，并将其固定在载玻片上。
二、系统启动1. 确保设备处于待机状态，按下电源按钮，等待系统启动；2. 检查系统软件是否正常运行，若出现异常情况，及时联系维修人员进行处理；3. 检查镜头和滤光片的安装是否正确，确保成像时的光路通畅；4. 开启激光源，根据需要选择合适的激光波长和功率；5. 调节扫描镜和物镜的位置，使光线准确聚焦在样品上。
三、图像获取1. 打开激光共聚焦显微镜软件，并根据需要选择合适的成像模式；2. 调节激光功率和增益，确保图像的亮度和对比度适宜；3. 调节扫描镜的扫描速度，根据样品的要求选择合适的扫描速度；4. 调节焦距和聚焦位置，通过手动或自动对焦功能获取清晰的图像；5. 点击图像捕捉按钮，记录当前图像或录制图像序列。
四、图像处理和分析1. 通过激光共聚焦显微镜软件提供的图像处理功能，对图像进行调整和增强，以获得更好的观察效果；2. 根据需要，利用软件提供的计算和分析功能对图像进行进一步处理，如三维重建、光学切片等；3. 对图像进行定量分析时，选择合适的工具和算法，并按照要求设定参数；4. 记录和保存处理后的图像数据，以备后续分析和报告撰写使用。
五、设备关闭1. 停止图像采集和处理工作；2. 降低激光功率，关闭激光源；3. 将扫描镜和物镜返回初始位置，关闭设备；4. 断开电源和数据线，保持设备清洁干燥。
Leica TCS SP8 快速入门指南说明书
Leica TCS SP8 Quick Start GuideA message will appear asking whether you want to initialize the stage. InitializingLower the objective to the lowest position, remove specimen and clean all of the NOTE: Do not turn off scanner and/or CTR control box for the microscope before theThe LAS X software will open in the Acquire tab. There are 3 portions to this window: Scan Parameters Light Path ImageNOTE: Only turn on the laser(s) with the appropriate laser line(s) that will excite the fluorophores you are usingAlternatively, click on the ConfigurationLaser Control WindowSave and Load the customized settingsAlternatively , click on the ControlPanel Icon in the Beam Path SettingsWindow as a short cut to the USBControl Panel WindowObjectives equipped on the microscopeEmission spectrum from a lambda scan can be added to the dye database.Many manufacturer’s will also provide the data for fluorophores that can added to Another great resource is the Leica FluoScout/fluoscout/1. Click On to activatethe lasers 2. Adjust the laser intensity of the appropriate laserline(s) by moving theslider up or by directlyentering the level (startlow as a suggestion).4. Use Autoselect to select the beam splitter3. Select the appropriate objective6. Select the appropriate emission spectrum (if available) from thedye data base to use as a guide8. Define the of emission to be collected with the sliders 5. Click On to activate theappropriate detector(s)7.Select the PseudocolourSelect the dye from the databaseUseaddThe following settings are mode for image acquisition when clicking Apply:•Selection of the laser lines•Selection of the detectors•Setting for the detection range•Assignment of the fluorescent dyes to the respective detectors•Assignment of the appropriate colour look-up table(LUT)for therespective fluorescent dyes\All other settings for image acquisition are made as usualspecimens.Click on the disketteicon to save a setting4.Set the light path configuration forthe new scan5.Repeat if necessaryNOTE: Sequential scan settings can be saved and loaded as an alternative.Acquisition Modes:Select the appropriate••••Z Stack(xyz)1.2.3.4.5.current stage posistionMerge Images for automatic stitching and smoothing of seams after acquisition is complete. Both the single images and merged images are added toOpen the ROI Configuration window by clicking on the “+”. Check on/off the laser line(s) 3.To adjust the laser intensity for the“background”, turn on Set Background and then adjust the laser intensity sliders.4. Adjust Gain of detector5.For DIC, adjust Bias of theobjective prism if necessaryRight Click on an imageAdditional Information -Spectral (SP)Detection System This particular system has 3separate internal detectors for confocal imaging;2PMTs and 1HyDThe Leica TCS SP8does not use emission filters to define the wavelengths of emission collected,but rather utilizes a prism-based approach.The wavelengths of emission are dispersed across the entire visible spectrum and each detector has a set of gates that are positioned and width adjusted to collect the desired wavelengths.PMTHyD Emission from the specimen is dispersed by a prismSliders are adjusted to determine the wavelengths of the emission collected in each of the detection channels EMISSION123Vacuum accelerationover 8.5 kVGaAsP photocathodeElectron bombardmentgainAvalanche gain,~ 0.5 kV HyD Detector Incident photonAmplification overcascade of dynodesgain, ~ 1250V photocathode Incident photon AnodePhotomultiplierTube (PMT)The Hybrid Detectors (HyD)are a new type of detector for laser scanning confocal microscopy available only with the TCS SP8.The HyDs very efficiently detect and amplify the signal from the specimen.This is due to the unique design of the HyD,which which includes a combination of the GaAsP photocathode (45%QE)and the fast,noise-free avalanche amplification rather than the slow and relatively noisy step-wise amplification through a series of dynodes with a standard PMT and a GaAsP-PMT.NOTE:A GaAsP-PMT (often referred to as a GaAsP detector)is not the same as a HyD.For more information:/science-lab/sensors-for-true-confocal-scanning//science-lab/detectors-for-sensitive-detection-hyd//science-lab/step-by-step-guide-to-hybrid-detection-and-photon-counting/Additional Information --Types of DetectorsBrightR with the HyD detectorEnhance dynamic range further -capture both very bright structures and not so amplifies dim structures more than bright onesRetains dynamic information in bright structuresSingle image rather than multiple as with HDR▪Optimize the pixel size to for optimal resolution by adjusting thezoom and format (#pixels) of the image Requires a sampling frequency of at least 2x-3x the highest spatial frequency to accurately preserve the spatial resolution in the resulting Optimal # of pixels –2-3x the resolution limitOptimizing Pixel Format (Resolution)Since the PSF for confocal is ~30%smaller due to the pinhole and thefollowing formula applies。
Leica TCS SPE共聚焦显微镜操作规程(1)
Living up to Life
4. 通过显微镜侧面的“INT”按钮进行 光强调节
5. 按“TL/IL”转至荧光观察，通过前 面板按钮 选择 适宜的 滤块，见下 图，样品观察完毕后按 Shutter 键 阻断荧光光路以保护样品
共聚焦——设置采图条件
1. 按顺时针方向打开激光电源 2. 在Beam Path下调用已存的采图参数， 或重新进行光路设置： 1) 选择合适的激光谱线 2) 调节激光输出功率 3) 选择合适的分光镜 4) 选择合适的接收范围 (可拖动黑色滑块或双 击后输入接收波长范围) 5) 选择适宜的伪彩 6) 调节PMT Gain值 (检测器灵敏度) 和PMT Offset值 (背景值)
Living up to Life
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共聚焦——三维层切
1. 单击 Live进行预览，调至合适的 焦平面，再调节激光强度、接收 范围、PMT Gain和Offset等参数 2. 单击Set Plane记录焦平面位置
Living up to Life
3. 继续预览，改变 z 轴层面以确定 层切的起点和终点，红色表示已 设定
Living up to Life
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共聚焦——波长扫描
1. 选择xyλ模式 2. 单击Live进行预览，调至合适的焦平 面，再调节激光强度、接收范围、 PMT Gain和Offset等参数 3. 停止预览 4. 设定接收总范围的起点和终点 5. 设定接收带宽 (默认值为10nm) 6. 设定 采集帧数 ，或接收带宽的 步进 值 7. 适当增加激光强度并提高PMT Gain 值，单击Start按键进行波长扫描
5. 根据图像调节激光强度、接收范 围、PMT Gain及Offset等参数 6. 如对图像满意，单击Live停止预览 7. 如有必要，单击 Save 保存当前参 数，便于以后调用
Leica激光共聚焦显微镜 操作规程
潍坊医学院医学研究实验中心仪器简明操作规程汇编
激光共聚焦显微镜简明操作规程
1. 启动
开启UPS电源，依次开启右侧手柄上的三个开关，从左至右顺序开启，最后开启激光钥匙。
2. 开启软件
电脑进入操作系统界面后，双击电脑桌面启动共聚焦操作软件。
3. 自检
点击对话框的“OK”键进行自检，结束后进入软件界面
4. 开启激光管
点击屏幕上方的“configuration”按钮进入配置界面→点击左边
按钮→打开所需激光（OFF →ON ），Argon激光还需拖动右方滑块以调节输出功率
5. 设置参数
6. 放置样品进行观察。
7. 观察结束保持数据。
8.关机，做好记录。
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Leica激光扫描共聚焦显微镜快速操作手册制作：徕卡显微系统（上海）贸易有限公司2013年3月目录：1 系统的组成系统组成 (3)光路示意图 (4)2 系统的使用2.1 开机顺序 (5)2.2 软件界面简介 (7)2.3 在显微镜下观察样品 (8)2.4 采集共聚焦图像 (9)2.5 XYZ三维扫描（Z-Stack） (11)2.6 时间序列扫描（Timeseries or xyt Scan） (15)2.7 波长扫描（xyλScan） (16)2.8 HyD检测器 (17)2.9 图像的保存及输出 (18)2.10 关机 (20)3 系统的维护 (21)Leica SP8 系统组成图1可见波长激光或白激光15UVIS, HIVIS或VISIR的光路镀膜2声光调制器（AOTF）16扫描视场旋转镜（Abbe-Konig 旋转）* 3红外激光（IR）* 17在NND位置上的反射光检测器（RLD）* 4电光调制器18物镜（可提供各种选择）*5紫外激光* 19在NND位置上的透射光检测器（TLD）* 6 AOTF或直接调制器（DMOD）20正方型针孔7STED 激光* 21Fluorifier盘*8Setlight监控二极管22X1出口接口*9AOBS, 及其他选配件23外置检测器*10用于FRAP的光束增强镜* 24色散棱镜11红外激光耦合25分开的荧光光谱12与CS2紫外光路耦合的紫外激光26最多5个光电倍增管或4个HyD检测器13STED激光耦合*选配组件14全视野扫描镜及串行高速扫描镜选件2系统的使用2.1 开机顺序 （硬件标号请参考前面的系统组成图）（1）因为FSU 和CSU 硬件的电源控制 ）不同，请分别按照如下步骤开机：FSU系统CSU 系统依次打开“PC Microscope”、“Scanner Power ”、“Laser Power ”三个按钮，将“Laser Emission ”上的激光开关钥匙旋至“On-1注意：显微镜控制器的开关 一般是常开的，在打开“PC Microscope ”按钮后指示灯应该点亮，如果不亮，请打开其开关。
先按电脑主机上的电源按钮启动电脑，再打开显微镜控制器 的开关，然后依次打开 “Scanner Power ”、“Laser Power ”两个按钮，将“Laser Emission ”上的激光开关钥匙旋至“On-1（2）打开荧光激发光源（按绿色的Power 按钮，如右图）光源亮度调节旋钮 光闸 Power 按钮（3）电脑进入操作系统界面后，双击电脑桌面“LAS AF”图标启动共聚焦操作软件。
（4）进入配置选择界面后，在“Configuration”下拉菜单中选择需要的配置；（其中带有“simulator”字样的为模拟方式，该方式不控制显微镜硬件，不能拍摄图像，适合处理数据）“Microscope”菜单中选择显微镜型号；（图中“Resonant”选项为快扫功能，可按需要打开或关闭，只有配备了快扫功能的系统才会显示该选项），点击“OK”，系统继续启动。
（5）在“Initialize Stage”提示界面选择是否初始化载物台（如果选择“No”，则Tile scan、Mark&Find和Matrix功能不能使用）。
注意：如果配置的是手动载物台，则不会跳出该提示界面。
（6）系统自检完后，进入LAS AF操作界面，点击界面最上方“Configuration”按钮进入配置界面→点击左边“Laser Config”按钮→打开所需激光（OFF→ON），Argon激光还需拖动右方滑块以调节激光输出功率2.2软件界面简介功能界面切换：参数设定（Configration）、扫描取图（Acquire）、图像处理（Process）、定量测量（Quantify）工具和文件管理界面切换：Experiments界面下显示当前拍摄和打开的图片，Acquisition下显示的是当前功能界面的功能按钮和参数拍摄参数：包括图像像素Format、扫描速度speed、图像放大Zoom factor、视野旋转Rotation等。
三维扫描工具组，用于设定和显示三维扫描的Z轴范围，及其他辅助设定光路显示及设置区域，从上向下直观显示了从激发到荧光检测的光路细节和关键设置图像显示窗口预设光路选择按钮激光控制栏分光镜选择按钮物镜选择按钮预览按钮，可用于开始和停止预览拍摄图像按钮叠加图像显示按钮，在使用两个或以上数量通道拍摄多色图像时，用于显示所有通道叠加后的图像界面缩放调节滑块，左右拖动可以调节界面项目的显示比例界面调整栏，左右拖动可调整光路设置区域与图形显示窗口的范围2.3在显微镜下观察样品2.3.1选择物镜：可通过显微镜主机右侧的物镜转换按钮，或软件中的“Objectives”按钮进行选择（如下图）。
（在显微镜设置软件Leica AF Hardware Configurator 中可设定最下方的红圈中的按钮为干/油镜转换，在干/油镜之间切换时需要先按一下此按钮才能完成转换）2.3.2明场观察：将样品置于载物台上，按显微（因镜左侧的TL/IL按钮打开明场光路（如右图）显微镜所处状态不同，有时候需要按两次才能打开），在明场条件下选择合适的视野。
通过调焦按钮或旋钮调节至合适的z轴平面，通过显微镜主机左侧的“INT”功能键调节光强。
如果是电动载物台，需通过遥控手轮调节载物台的运动以选择合适的视野（如下图）。
2.3.3按显微镜前面板的荧光滤块选择按钮切换至荧光观察光路（如右图所示），其上的标注与荧光颜色的对应关系为：I3 -绿色，N2.1--红色，A—蓝色，有些配置的显微镜按钮对应的荧光颜色可能会有所不同，请以实际情况为准。
再按荧光光闸按钮（SHUTTER）打开荧光，进行样品的荧光观察。
2.3.4观察完毕后，按显微镜前面板上的“SHUTTER”按钮以保护样品2.4采集共聚焦图像2.4.1光路设置：调用已有的设置：选择“Load/Save singlesetting”下拉菜单中已有的设置，激光波长及其输出功率、分光镜、检测波长范围、检测器gain 及offset都会自动设置，包含几种最常用的荧光染料。
选择某一设置后，可按样品的实际情况对参数进行优化（如后述），并以新的名称保存。
（如右图）修改已有设置：可改变所选激光、调节激光输出功率、改变分光镜、改变所选PMT、调节PMT 检测范围、调节PMT 的gain 或offset等。
如下图。
建立新的设置：也可从零开始建立新的设置。
选择所需激光及其功率、适宜的分光镜、检测器及检测波长范围。
分光镜选择原则：根据所用激光波长来选择合适的分光镜。
○1405激光选择Substrate；○2其他可见波长的激光根据其波长选择分光镜，如488激光可选择DD488/552、TD488/552/638分光镜。
○3RT 15/85分光镜所有波长激光都可用，但是会损失85%的激光能量和15%的荧光能量，一般在进行光谱扫描的时候选用。
Sequential Scan:若染料的发射光谱有重叠，为减少串色，成像时每种染料要单独激发，或者说，每次只用一种激发光激发，并只检测一种染料。
可用Sequential Scan来实现。
（如右图）激活SequentialScan功能，可在下面的Seq中分别设置各个染料的激发和检测光路。
2.4.2选择扫描模式默认模式为xyz 扫描，是最常用的扫描模式，可用于xy 扫描和z 轴层切（xyz 扫描）。
还可在下拉菜单中选择由x，y，z，t （时间）以及λ（波长）组合而成的多维扫描模式，如xzy，xyt，xyλ，xyzt，xyzλ，xyzλt 等。
2.4.3设置扫描参数包括分辨率（format）、扫描速度（speed）、针孔大小（pinhole）、线平均（line average）、面平均（frame average）、累加（accumulation）及放大倍数（Zoom）等。
（如右图）分辨率：默认值为512×512。
也可选择更低或更高分辨率。
分辨率越高，所获取的图像文件越大，采图所需时间也越长。
扫描速度：默认值为400Hz。
活细胞或运动的样品成像可能需要更快的速度。
可选择双向扫描（Bidirectional X）来达到更高速度，这时可能需要进行相位校准（Phase correction）。
针孔大小：默认值为1AU。
如果增大针孔直径，可增加信号强度，但是所获取图像的共聚焦效果会降低，光切厚度也会随之增加。
平均：用于降低背景噪音。
分为线平均（Line average）和面平均（Frame average），可在下拉菜单中选择平均的次数。
累加：仅用于荧光非常弱的样品2.4.4预览图像点击软件Acquire界面左下方的“Live”按钮以预览图像（下图），图像将显示在右侧的显示屏上。
预览开始后，“Live”按钮变为“Stop”，点击“Stop”按钮可停止预览。
注意：一旦预览开始，激光开始照射样品，为减少对样品的伤害，应快速操作，尽量减少预览的时间。
建议：点击Live按钮之前，可调节format至512×512，speed至600Hz 以获得较快的刷新频率。
预览应达到以下目的：○1找到最适合观察的焦平面；○2使图像亮度动态范围达到最佳。
可通过调节控制面板的“Z Position”旋钮找到最适合观察的焦平面（如下图）；或者调节遥控手轮或显微镜镜体上的调焦旋钮（见第8页图）。
图像亮度动态范围可通过调节激光输出功率（见第9页图）、Smart Gain和Smart Offset（见上图）。
参数的调整原则：（1）Smart Gain的调节：增大则信号和噪音都增强，减小则信号和噪音均减小。
一般情况下，Gain值的正常范围为500—1000；（2）Smart Offset的调节：可扣除背景噪音，但标本信号也有一定程度的扣除。
原则上，在保证图像质量的前提下，Digital Offset值越接近于0越好；（3）另外，对于每个通道，需要灵活调节激光的强度：激光强度越高，则信号越强，同时标本更容易被漂白或淬灭。
当PMT gain值高于800或HyD gain值大于100%时荧光图片亮度还是不够时，可以考虑适当增加激光强度。
在做活细胞或者光切时，应尽量减少激光强度，原则上，在保证图像质量的前提下，激光强度越低越好。
图像亮度动态范围的判断方法：理想的荧光图像中应该只有少数像素点达到饱和，可通过位于图像左侧的LUT按钮进行观察。
LUT 按钮（下图红圈）可在LUT（即指定的荧光颜色，也称伪彩）、“Glow Over Under （GlowOU）”和灰度图三档之间切换。
在GlowOU 模式中，灰度值达到饱和的像素点显示为蓝色，而灰度值为0的像素点显示为绿色。