生物大分子分离纯化技术
生物大分子的分离纯化（透析、超滤、冷冻干燥）
生物大分子的分离纯化（透析、超滤、冷冻干燥）生物大分子的分离纯化（透析、超滤、冷冻干燥）2. 透析自Thomas Graham 1861年发明透析方法至今已有一百多年。
透析已成为生物化学实验室最简便最常用的分离纯化技术之一。
在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都要用到透析的技术。
透析只需要使用专用的半透膜即可完成。
通常是将半透膜制成袋状，将生物大分子样品溶液置入袋内，将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋内外两边的浓度达到平衡为止。
保留在透析袋内未透析出的样品溶液称为"保留液"，袋（膜）外的溶液称为"渗出液"或"透析液"。
透析的动力是扩散压，扩散压是由横跨膜两边的浓度梯度形成的。
透析的速度反比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶质在膜内外两边的浓度梯度，还正比于膜的面积和温度，通常是4℃透析，升高温度可加快透析速度。
透析膜可用动物膜和玻璃纸等，但用的最多的还是用纤维素制成的透析膜，目前常用的是美国Union Carbide （联合碳化物公司）和美国光谱医学公司生产的各种尺寸的透析管，截留分子量MwCO（即留在透析袋内的生物大分子的最小分子量，缩写为MwCO）通常为1万左右。
商品透析袋制成管状，其扁平宽度为23 mm～50 mm不等。
为防干裂，出厂时都用10％的甘油处理过，并含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，它们对蛋白质和其它生物活性物质有害，用前必须除去。
可先用50％乙醇煮沸1小时，再依次用50％乙醇、0.01 mol/L碳酸氢钠和0.001 mol/L EDTA溶液洗涤，最后用蒸馏水冲洗即可使用。
实验证明，50％乙醇处理对除去具有紫外吸收的杂质特别有效。
使用后的透析袋洗净后可存于4℃蒸馏水中，若长时间不用，可加少量NaN2，以防长菌。
生物大分子分离与纯化技术
生物大分子分离与纯化技术是生物学、生物医学和生物工程领域中非常重要的技术之一。
它可以用于提取和分离生物大分子，从而达到纯化的目的。
本文将着重探讨的原理、方法和应用。
一、原理在生物细胞中，不同的生物大分子有着不同的形态、结构和性质。
为了分离和纯化这些生物大分子，需要利用它们的理化性质差异。
例如，蛋白质可以通过电泳分离，根据电荷、分子量等差异分离出不同的成分；核酸则可以通过浓度梯度离心分离，根据密度差异分离出单独的成分。
还有一些生物大分子，如多肽、糖类、脂质等，可以通过其他特殊方法分离。
二、方法1. 柱层析法柱层析法是中常用的重要方法之一。
它利用固定相（柱子中的树脂）和流动相（洗脱缓冲液）之间的相互作用来分离和纯化生物大分子。
根据固定相和洗脱缓冲液的不同性质，可以选择不同的柱层析方法，例如离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析等。
2. 电泳法电泳法是基于生物大分子的电荷差异和分子量差异的原理，将不同的生物大分子分离并捕获的技术。
根据电泳介质、运行方式以及电场的不同条件，可以选择不同的电泳方法，如蛋白质电泳、DNA电泳、脂质电泳等。
3. 超滤法超滤法是利用微孔过滤膜的不同截留分子量，将生物大分子按照大小分离纯化的技术。
超滤法分为正压式和负压式，正压式是通过液体压力将生物大分子向膜孔内压缩，从而分离得到小分子；负压式是通过负压将大分子向膜孔内吸附，难以通过的是大分子。
4. 溶剂萃取法溶剂萃取法是将生物大分子从混合物中溶解到特定的有机溶剂中，然后通过反萃取、扩散等工艺，使它在不同相中转移、分离和纯化的方法。
5. 其他方法生物大分子的分离和纯化方法还有一些其他方法，例如磁性珠法、浓缩法、冷冻干燥法等。
三、应用在生物医学、生物工程、食品工业、环境保护和新能源开发等领域中有广泛的应用。
具体来说，1. 生物医学领域生物医学领域的应用主要是分离和纯化蛋白质和多肽类物质，如酶、抗体、激素、血浆蛋白等。
这些物质可以作为药物、诊断试剂、生物治疗的原材料等。
生物大分子分离纯化技术(159页)
亲和色谱法由于具有极高的生物特异性，分离目的物受到理 化性质相似的杂质干扰极少，能从比较复杂的组织抽提液或细菌 发酵液中一步提取分离出所需的物质，提纯倍数可达一百倍以上 。
早期分离提纯的方法，选择的原则一般是从低分辨能力到高分 辨能力，而且负荷量较大为合适。但随着许多新技术的建立，一 个特异性方法其分辨能力越高，便意味着提纯步骤的简化，提纯 步骤的减少，回收率越高，具有生理活性物质变性的危险性就越 少。
制备物均一性的鉴定
对一个新分离的物质是否纯，常用“均一性 ”表示，均一性即指所获得的制备物只具有一 种完全相同的成分。蛋白质均一性常用的几种 鉴定方法：
1.溶解度法： 2.电泳均一性的测定法： 3.高速离心沉淀法：
生物大分子的分离纯化技术(共34张PPT)
离心(3)
最大速度方法：
移动界面（Moving Boundary)超 速离心法
移动区带(Moving Zone)超速离心法
等密度方法(Isodensity)：
样品的类型、采集与保存 酶样品的准备
亲和色谱
琼脂糖的溴化氰活化法
6-氨基己酸－琼脂糖和,1,6-己二胺－琼脂糖
层析柱短 配基－与大分子间以氢键离子键或疏水相互作用结合
透析 微过滤 盐析 冷冻干燥 离心
透析
透析膜:
材料: 火棉胶(Collodion), 玻璃纸(Cellophane), 纤维素 (Cellulose)
纤维透析管的处理: 1%乙酸水溶液 1h, 碱性EDTA (1% Na2CO3, 1 mM EDTA) 煮1h, 纯水清洗,保存.
透析液:
离心(2)
(Relative centrifugal force)：
F=mω2r;
Fcf=(1.119×10-5)(rpm)2r
F摩擦=fv
F净=(Mp-Ms)ω2r-fv
沉淀速度与离心力的比率（单位离心场中颗粒的沉降速度 ）， 蛋白质\核酸\病毒等的沉降系数介于1×10-13到200×10-13秒的
紫外-可见吸收法 荧光检测法
电化学检测法
质谱法
高效毛细管电泳
电泳淌度 电渗流
淌度和迁移时间 分离效率 分离度
高效毛细管电泳分离模式
毛细管区带电泳
以1×10-13s 为一个单位,称为斯韦德贝格单位(Svedberg)，用S(大写)表示.
（Capillary Zone Electrophoresis, CZE) 纤维透析管的处理: 1%乙酸水溶液 1h, 碱性EDTA (1% Na2CO3, 1 mM EDTA) 煮1h, 纯水清洗,保存.
生物大分子的纯化与鉴定技术
生物大分子的纯化与鉴定技术生物大分子是生命体内最基本的组成元素之一，包括蛋白质、核酸、多糖和脂质等。
它们的结构和功能对于生物体的发育、代谢、传递遗传信息等方方面面都有着非常重要的作用。
因此，对它们进行纯化和鉴定是生物学和生命科学研究中不可或缺的重要步骤。
一、蛋白质的纯化与鉴定技术1. 活性层析技术活性层析是从混合样品中纯化蛋白质的一种常用技术。
它基于蛋白质与特定配体之间的互相作用，利用这种相互作用把想要纯化的蛋白质从混合物中分离出来。
这种方法不仅可以分离出单一种类的蛋白质，还可以根据蛋白质与配体的亲和性进行分层次纯化。
同时，利用不同的配体也能够分离出不同功能的酶，从而进一步扩大了对蛋白质的纯化范围。
2. 离子交换层析技术离子交换层析是一种基于蛋白质电荷的分离方法。
它利用固定在树脂表面上的离子，通过与蛋白质表面的离子相互作用，将蛋白质从混合物中分离出来。
这种方法常常用于分离带有不同电荷的蛋白质，以及酸性和碱性细胞因子等物质。
3. 尺寸排除层析技术尺寸排除层析技术是一种基于蛋白质大小的分离方法。
它通过让大分子在固定相中的孔隙中滞留时间长，从而将大分子和小分子分离出来。
这种方法通常用于分离相对分子质量较大的蛋白质，如重组蛋白、抗体等。
4. 逆相高效液相色谱技术逆相高效液相色谱是一种基于蛋白质亲水性的分离方法。
它利用逆相柱的反相作用，将亲水性较小的蛋白质从混合物中分离出来。
这种方法常常被用于提纯高表达体系中的蛋白质。
5. SDS-PAGE和Western Blotting技术SDS-PAGE是一种基于蛋白质质量和电荷的分离技术，通过在凝胶中加入SDS（十二烷基硫酸钠）和还原剂，可以使不同电荷和大小的蛋白质变得相同，从而进行准确的大小分离。
Western Blotting是一种检测蛋白质表达的方法，它利用特异性抗体将蛋白质分子分离出来，并将其转移到膜上，然后通过特异性抗体进一步检测目标蛋白质的表达量。
二、核酸的纯化与鉴定技术1. 常规离心技术常规离心技术是一种对复杂混合物进行分离和预纯化的方法，通过调整离心速度和离心时间，将不同大小和形状的细胞组分分离出来。
生物大分子纯化技术及其应用研究
生物大分子纯化技术及其应用研究生物大分子纯化技术是在分子生物学、生物化学、生物工程等领域中广泛应用的一种技术手段。
它是将生物大分子从生物基质中分离出来，去除杂质后得到纯度较高的大分子物质的一种方法。
这种技术不仅对于了解生物大分子的生理学、生化学和分子结构有重要意义，而且对于开发新型制药和其他生物医学应用具有很高的应用价值。
本文将探讨生物大分子纯化技术的发展现状和应用研究方向。
一、生物大分子的纯化技术发展历史生物大分子纯化技术是在分子生物学和生物化学等领域中得到了广泛的应用，其研究起源于20世纪50年代，当时的纯化技术主要是以离心、层析和电泳为主。
由于单一的技术手段操作简单，但难以实现高纯度纯化，横向纯化品种不足，成品得率低等问题，使得生物大分子得到的纯产品存在一定程度的质量偏差，实际应用受到了限制。
60年代后期，分子生物学和生物化学领域中的技术手段得到了很大的发展，生物大分子纯化技术也得到了很大的发展，使得生物大分子的纯化得到了更高的纯度、更多的纯化品种、更快的速度、更多的自动化和更少的处理步骤。
二、生物大分子纯化技术的原理生物大分子纯化技术的原理是将某种化合物或生物大分子从整个体系中分离出来。
分离原料的性质和目标化合物的性质是选择分离方法的决定性基础。
生物大分子纯化技术通常采用两步骤：第一步为预处理，第二步为精确分离。
预处理主要是处理生物材料、细胞和组织等的常规分离方法。
精确分离主要由柱层析、电泳和过滤等技术完成。
三、生物大分子纯化技术的技术手段现代生物大分子纯化技术包括离心、电泳、层析、凝胶过滤、超滤、免疫学分析、电喷雾质谱分析、表面等离子体质谱分析等技术手段。
其中，层析技术的发展为人类提供了一种快速、有效的纯化方法，不仅可以对杂质污染进行选择，而且可以对分子量相似的大分子进行鉴定和分离。
随着现代技术的发展，对于生物大分子的研究尤为关注的是鉴定和分离分子间作用；生物大分子的结构和功能；基因表达和调控；分子诊断和治疗等领域的研究。
生物大分子的分离纯化
生物大分子的分离纯化生物大分子的分离纯化是指对生物大分子，如蛋白质、核酸、多肽以及其他生物高分子的理化分离，以获得所需的高级别的纯度和净化标准的过程。
此外，功能地也可以应用于提取细胞和细胞组织特定的成分。
一般来说，分离纯化同表征大分子是以不同的方式实现的。
对于蛋白质，离心分离是一种常用的技术，这是一种使用立体速度分离不同物质的有效方法。
因为蛋白质它们有不同的表面电荷和大小，因此它们在加速度下受到不同的力，从而能够受到力，从而使不同的类型的蛋白质分离开来，产生分离纯化的产物。
此外，层析技术也可以用于对蛋白质进行分离纯化。
这个过程使用一种特定的介质，该介质被用于环境或两种环境之间的运动原理，通过独特的该介质通道，根据不同的冶金电荷，使得蛋白质分离到不同的有效产品中。
另外，还有其他许多特定技术可以用于生物大分子的分离纯化，比如电泳和柱层析技术。
这两种技术都是基于维持生物大分子的不同状态（流变或电泳）的原理，这种状态可以使不同的成分分离开来，从而获取高纯度的成分。
这两种技术的精确度取决于集成柱的大小和类型，以及实现特定的湿度和电荷的原理。
当讨论以上技术以外的技术时，分离和精制并不是只有蛋白质才有，尽管在蛋白质的技术中可能是最常见的，但核酸、多肽和其他有机分子也可以用这些技术进行分离和精制。
有几种不同的方法可以用于高级分离现象，其中一些是像柱层析、集成离子交换以及沉淀法，这些技术被广泛应用于生物大分子的分离和纯化。
总的来说，生物大分子的分离纯化是一种复杂的过程，需要仔细挑选一种或多种分离纯化技术，以实现所需的纯度要求的目的。
选择的技术必须适合特定的大分子和纯度要求，以实现最佳效果。
生物分子的分离和纯化技术
生物分子的分离和纯化技术生物分子的分离和纯化是生命科学研究中不可或缺的一环，也是许多生物医学应用和生产工艺的核心。
分子的分离和纯化技术包括多种方法，其基本原理是利用不同的物理和化学性质，将混合系统中的各个分子分离开来。
生物分子的分离和纯化技术通常是从含有目标分子的组织或细胞裂解液中开始的。
通常，该液体首先要通过离心等手段除去细胞碎片、核酸、脂质和其他杂质。
接下来，可以利用不同的分离和纯化技术分离和纯化目标分子。
下面将介绍几种通用的分子分离和纯化技术。
1.凝胶过滤chromatography凝胶过滤chromatography是一种分子分离技术，通常用于分离分子量不同时的生物大分子。
凝胶过滤chromatography基于分子体积的大小，通过孔径大小选择分子的峰值通过孔径大小选择分子的峰值。
较大分子通常沿着填充体的较周折的路径流过，而较小分子则会进入较细的分子而停留在其中。
由于这种技术可以清除大小不同的杂质，使样品更纯净并且不受影响。
它也可以用于分离游离的生物大分子，例如酶和蛋白质。
2.离子交换chromatography离子交换chromatography是一种电静力分离技术，通常用于分离带有相反电荷的生物大分子。
离子交换chromatography基于非共享原子、阴离子和阳离子之间的吸引力或排斥引力原理。
通过这种方式，样品中的阴离子分子可以被吸附到阳离子交换树脂中，而阳离子分子可以被吸附到阴离子交换树脂中。
这种技术通常用于纯化蛋白质和其他biomolecules3.氢氧化铝亲和chromatography氢氧化铝亲和chromatography是一种结合亲和原理的分离和纯化技术。
它是基于分子间的较强吸附相互作用，通常用于分离含有电中性、疏水基团或氢氧基团的蛋白质。
它列为具有很小结合物的可逆性和如外部pH和ionic强度等变量的影响，它是一种比较简单的结合方法。
4.亲和chromatographyС在纯化生物大分子中最常用的方法之一是使用亲和chromatography。
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2.1 生化分析样品的准备与预处理
生化样品极其复杂，首先应对所关心的待测物 处于生物体的哪一个部位所获得原始的样品，并 对实际分析之前应进行怎样的处理必须有所了解。
R-SH+R-SH→R-S-S-R
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对巯基氧化的防止： 1. EDTA络合金属离子(非金属酶) 2. 加入含巯基试剂，如巯基乙醇、2,3-二巯基丙醇、
巯基葡萄糖酸、谷胱甘肽、半胱氨酸等
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对蛋白质酶解的防止：
蛋白水解酶来自活细胞的内部，哺乳动物将其 包装在溶酶体中，而在微生物中．它们则存在于 质膜和细胞壁之间。在用细胞匀浆法制备酶提取 物时会发生蛋白水解酶的释放，所以对其活性要 进行抑制。根据蛋白水解酶的类型可以选用不同 的抑制剂。
生化物质分离的特殊性：
要求：分离方法简便，选择性好，效率高，保持 生化物质的分子结构和构型，分离方法尽量不影 响生化物质的生物活性。
由于生化物质一般都很脆弱，易受化学、物理因 素影响而变性，因而分离过程常要求在低温、洁 净、温和的条件下进行。
本章所提到的生物大分子主要是指蛋白质、酶 及核酸。
1
本章主要的内容包括：
3
2.1.1 样品的类型、采集及保存
样品的类型 生化及临床分析的样品对象非常广泛，分布于
动物或人体的每一个部位。它们可以是内源性的 化合物或外源性的化合物。样品的基质可以是简 单的血样、尿样，也可以是比较复杂的粪便以至 整个组织。这些基质非常复杂，常常由多相组成， 如血浆和血细胞及多种分子量大小不同的化合物。 被分析对象的稳定性也变化极大，有只能稳定存 在几分钟、对蛋白酶极为敏感的肽类，也有几乎 是完全稳定的药物的代谢物。
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血样有全血、血浆和血清之分。7 Nhomakorabea2．组织样品 组织样品通常采自肝、肌肉、肺、骨髓或肠。这
类组织是代谢活性的，因此采样后几秒之内要在液 氮中或其它冷却剂中冷冻。
液氮
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样品的保存 一般来说，任何生物样品采集后都应立即进行分
析。但由于种种原因，这往往是不可能的。样品也 许需要运送到实验室，也许完成一个研究需要所有 的样品同时测定。任何在法律上有效的分析必须注 明保存日期及保存条件等。
生理样品中酶的绝对浓度的测定从原理上讲是很简 单的，分析时的主要问题是纯的酶标样的获得。
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酶在天然界中总是存在于很复杂的混合物中， 通常一种细胞中可能含有成百上千种酶，为了了解 和分析一个复杂生理样品，如亚细胞器、细胞或整 个组织中的酶，就必须将酶放在一个尽可能简单的 体系中进行研究。通过对单一酶的研究可以获得酶 对哪些底物具有特异性、反应的动力学参数及酶作 用方式。所有这些数据对于研究酶在复杂体系中的 功能是非常重要的。在许多医学及工业应用方 面．是否具有纯的酶制剂非常关键。
载体蛋白选择条件： 1. 与酶之间无相互作用； 2. 分子量与酶的分子量差至少1~2倍，以便必要时
可以很方便地用排阻色谱将二者分离。
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一些特殊的反应会使催化活性部位的活性丧 失一些。在纯化过程中一些辅助因子的失去会使 酶的活性丧失，为此可以在纯化缓冲液中加入辅 助因子。
催化活性部位氨基酸残基的共价化学修饰很 常见，最易被修饰的氨基酸为半胱氨酸。
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酶活性的保持 要获得生理样品酶功能研究的可靠数据必须对
酶进行纯化。在整个纯化过程中如何保持酶的活 性是最关键的，细胞内酶在分离纯化过程中能抗 各种环境对酶活性的影响。但当酶从天然的保护 环境中释放出来后，它对每一步纯化步骤都很敏 感，细胞膜酶对溶解尤其敏感。
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可溶性蛋白质不论是存在于细胞质的还是细胞 器内的，其蛋白质浓度从100 mg/ml 到高达400 mg/ml (线粒体基质内)。体系中存在各种天然的还 原剂(如谷胱甘肽)使蛋白质保持高的还原电位。其 它稳定剂也存在，如不同的底物及产物。在蛋白 质纯化过程中组织被破坏，蛋白质从它们的保护 环境中释放出来．被限制在不同部位的蛋白水解 酶也同时被释放出来。所以要对所关心的酶进行 保护，以防止其被氧化、水解或不可逆变性。
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样品的采集 对于给定的样品。采集处理速度与样品的代谢
活性与它们的化学和生化稳定性密切相关。
尿液中各种样品的浓度一般认为可稳定几小时。 组织样品一般需要快速冷冻以防止发生变化，采 样者应该有相应的样品采集及保存的设备。
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1. 血样 成人平均含6L的血液、其中约55％的血浆和
45％的细胞。血样的采集一般采取清晨空腹采 血，以避免饮食、运动、情绪等对血液成分的 影响。动物一般采取禁食12～16h后采血，一 般生化检验所需的血液标本采取静脉抽血。
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样品的初步处理
尽管许多化合物在全血浆中更为稳定，但另一 些，如氨基酸则应保存在不含蛋白质的溶液中。 许多样品分析之前都要求除去蛋白质，用于去除 蛋白质的各种沉淀方法的比较见表：
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常用蛋白质沉淀方法的比较
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2.1.2 酶样品的准备
酶是一种具有催化活性的蛋白质，它的催化活性 是其特征参数。任何分离纯化步骤都应考虑酶的生物 活性的保持问题。
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生物体液中许多成分保存在室温或4℃下时，由于 沉淀、蒸发、氧化或细菌的进攻等原因，其浓度会发 生变化。对于血清样品，若对其中的钠或血清白蛋白 进行分析，当样品保存在-20℃时，20天内不会发生 明显的变化。有些成分在保存期间确实可以发生明显 的变化，如儿茶酚胺，因此必须保存于－20或－70℃ 下，必要时可以加一些抗氧化剂或酶抑制剂。让血浆 或血清与红血球接触时，由于酶活性的改变成被分析 对象在细胞内外分布的变化会使分析结果发生变化。 所以、一般要快速分离成单一的相。
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通过控制纯化过程中的pH、温度及有机溶剂的 使用可以防止酶的变性。所使用缓冲溶液的pH应 控制在6-8之间，并保持合适的离子强度使其可以 防止酶变性。将纯化过程的温度降低至15-25℃可 以使许多降解过程减慢3-5倍。
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酶在稀溶液中由于对器皿壁或色谱填料的吸 附会引起变性。吸附使酶的四级结构解离而失 去活性，这种变性可以通过加入载体蛋白来阻 止。比较常用的载体蛋白有牛血清白蛋白，或 商品化的结构简单、分子量已知的合成蛋白。