_膜蛋白质组分析技术的研究进展

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膜蛋白在细胞中执行着一些非常重要的功 能 。 膜蛋白的 溶解性是膜 蛋白质组 分析面 临的主 要挑战 。 膜
蛋白溶解性的提高 , 使得经典的基于凝胶的蛋白质组策略和新兴的鸟枪蛋白 质组策略在膜蛋 白质组分 析中逐渐被 广泛应用 , 进而可以揭示膜蛋白的拓扑学特征和鉴定其翻译后修饰 , 为深入研究其重要的生物学功能积累数据 。 [ 关键词 ] [ 文章编号 ] 膜蛋白质组 ; 膜蛋白质类 ; 电泳 , 凝胶 , 双向 ; 光谱分析 , 质量 Q 753 [ 文献标识码 ] A 1000-5501( 2005) 06-0584 -04 [ 中图分类号 ]
1 基于凝胶的分析技术
二维凝胶电泳 ( 第一向 用固 相 p H 梯 度 IPG 胶 条 , 第二 向用 T r is 甘氨酸缓冲系统的 SDS-PAGE) 对可溶性 蛋白质具 有良好的分离能力 , 而不适合用于 疏水性蛋白质或膜蛋白的 分离 [ 4] 。很 多 疏 水 性 蛋 白 质 或 膜 蛋 白 不 能 在 等 电 聚 焦 ( I EF ) 的过程中按照 pH 梯 度被 分离开 , 主 要是 出于 两种原 因的溶解性问题 : 第 一 , 很 多疏水 性蛋白 质是不 溶于 含有非 离子去污剂或两性离子去污剂的 IEF 样品缓冲液中的 , 尤其 在低离子强度的情况下 ; 第二 , 即使它们被溶解 , 溶解的蛋白 质易在它们的 等电 点附 近发 生 沉淀。 Buna i等 [ 5] 建立 了一 种高度可重复 的凝 胶系 统来 提高 载样 能力 ; 改 进 了第 一向 IEF过程中 IPG 胶条重泡胀液的组成 , 并在第二 向用了 T ris [收稿日期 ] [基金项目 ] 2005- 03- 15 国家 863 计划资助项目 ( 2002AA 232021 )
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军事医学科学院院刊 2005年 12月 第 29卷 第 6 期 Bu ll A cad M ilM ed Sc, i D ec 2005 ; V o l 29 N o 6
, 张学敏, 魏开华
( 军事医学科学院国家生物医学分析中心 , 北京 [ 摘要 ] 100850)
tr ic ine缓冲系统的不连续 SDS-PAGE。这些 改进极大地 提高 了二维凝胶电泳分离 膜蛋白的能力。 很多方法的优化 集中于在 凝胶分 析前的 样品 制备和 用 有机溶剂 [ 6, 7] 或非 离子 去污剂 [ 8] 和两性 离子 去 污剂 [ 9] 提 高 膜蛋白的溶解性。 Babu 等 [ 10] 建立的 方法是 : 在溶 解分离 自 大鼠心室肌质 网富 集的微 粒体 膜蛋 白时 , 加入 了 DHPC ( 1 , 2-diheptanoyl sn-g ly ce ro -3 -phospha tidy l cho line) 作 为 去 污 剂 , 使对膜蛋白的溶 解能 力提高 了 95 % 。 DHPC 能与 更高浓 度 的变性剂 ( 7 mo l/L 尿素 , 2 m o l/L 硫 脲 ) 共溶 , 这 或许也 是它 对膜蛋白具有良好溶 解能力的一 个原因。另 外 , DHPC 分子 呈电中性 , 易于纯化 , 在 pH 4~ 10 范围内 非常 稳定 , 能够 提 高凝胶中大分子量蛋白的相对 丰度 , 这些性质都决定了 它是 一个非常适合的去污剂。用这种方法 , B abu 等 第 1 次用 2DPAGE 分离并鉴 定 出了 关 键 的 肌质 网 膜 蛋 白 SR C a ATP 酶。 其他方法 的改 进 集中 于蛋 白 质的 第 一 向分 离 ( IEF 过 程 ) 。因为膜蛋白在其等电点 附近变 得越来 越难溶 解 , 最简 单的方 法就是 取消 I EF 这 个 步 骤 , 用 一 维 凝 胶 进 行 分 离 [ 6, 11, 12] , 并结合质谱来鉴定。这种方 法的局限 性在于 一维 凝胶的每一个条带 中蛋白 质的复 杂性。通过 液相 色谱来 分 离或提高检测质量数 的准确度可以很容易地解决这个问题。 IEF 也可 以 用一 种 不 同 的 分 离策 略 来 替 代。 Schagger 等 [ 13, 14] 建立了另外一 种 2D-PAG E 体 系 , 这 种体系 的第一 向 使用天然的聚丙烯酰 胺凝胶电泳并加 入考马 斯亮蓝 G ( b lue nativ e PAGE ), 考马斯亮蓝 G 将其所带电荷 转移至膜蛋 白混 合物上 , 蛋白质是在完全未变性的条件下保持天然状态 进行 分离的 , 随后在 SDS 变性 条件 下进 行第 二向 分离。 这种 方 法适用于分析与线粒 体氧化 磷酸化 过程相 关的多 蛋白质 混 合物 ( 线粒体呼吸链混合物中 含有膜蛋 白 ) 。 D evreese 等 [ 15] 用类似的方法鉴 定并构 建了线粒 体蛋白 质表达 谱。 B rookes 等 [ 16] 用一维蓝色天然凝胶电泳来分离膜 蛋白混合物。 这种 方法独特的优势在于 它使膜 蛋白混 合物在 二维凝 胶上进 行 功能分析成为可能。 Bunai等 [ 17] 对这种方法做了 改进 , 使其 能分析枯草芽孢杆菌 的膜蛋白。他们的研究结果表明 , 改进 后的方法比普通的 IPG-D alt方 法能检测到更多的膜蛋白。 对于等电点在碱 性端 ( pI 8~ 14) 的膜蛋白来 说 , 目 前的 IEF 系统 不能 有效分 离。 M acfa rlane[ 18] 和 H arting er 等 [ 19] 曾 建立了一种对 蛋白质 等电 点范围 不敏 感的 不连 续酸 性 2DPAGE 体系 , 这种体系 的第 一向 中使 用了 阳离 子去 污剂 16BAC( benzy ld i m e thyl n-hexadecy la mm onium ch lo ride) , 第 二 向 使用了 T ris 甘 氨酸 缓冲系 统的 SDS-PAG E。 D reger 等 [ 20] 用 这种方法鉴定 了核 膜上的 148 个 蛋白 质。 Buna i等 [ 17] 对 这 种方 法做 了 改进 后 , 将 16-BAC /T r is -tric ine SDS-PAGE 用 于 pI8~ 14 细菌膜蛋白的分离。 普通的胶内酶切方法应用 于膜蛋白的局限性在于 : 用具 有专一酶切位点的胰蛋白酶酶 解产生肽段的大小和疏水性 ; 很难 获 得 较 高 的 序 列 覆 盖 率。因 为 膜 蛋 白 的 跨 膜 节 段 ( trans me m brane segment , T M S) 或者不易于 蛋白水解 酶接近 , 或者缺少蛋白水解 酶作用 的特异 位点。这些 困难 有时可 以 用结合蛋白 酶降 解和 化学 降解 2 种 方法 来加 以 克服。 V an
585 M on tfort等 [ 21, 22] 先用 胰蛋白酶降解 , 随后用溴 化氢降 解结合 的方法来降解蛋白质。与单用这 2 种方法的效果相比 , 疏水 性膜结构域的序列覆盖率增加了 1 倍 , 而可溶性结 构域的覆 盖率仍是相同的。 膜上酶切 的方法 [ 5] 是 先将被分 离的蛋 白质在一个不连续的缓冲系统中电转 印到 PVDF 膜上 , 然后 在 80% 的乙腈溶液中用赖氨酰 肽链内 切酶 L ysC 进行 酶切 , 这种方法更加适合于酶切膜蛋白。 通过比较枯草芽孢杆 菌中整 体膜蛋白 跨膜 节段 的理论 预测数量和实际 鉴定的 数量 [ 23] , 可知 1D或 2D-PAGE 适合 于分析含有 1 个或 2 个跨膜节段的膜蛋白 , 而对 含有 4 个以 上跨膜节段的膜蛋白 的分析就 有些困 难了。没 有任 何一种 策略能够为所有的膜蛋白样品提供一种整体的解决方 案 , 对 于每一种富含膜蛋白的 样品的 实验条 件都得有 针对 性的优 化。
[作者简介 ] 何家田 ( 1974- ) , 男 , 主管药师 , 在读硕士生。 * 通讯 联系人 , Te: l 010 -86533042, 010-66931434 ; E -m ai:l w hx @ p roteom ics . com. cn
军事医学科学院院刊
2005年 12月 第 29卷 第 6期
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of m e mbrane prote ins is the ir low solub ility , effective enhancement of wh ich m akes gradua lly ex tensive application of classi ca lly gel based and the latest sho tgun proteom ic strateg ies to membrane pro teom ic analysis . Furthe r mo re , the characteriza tion of m e mbrane pro te in topo logy and its po st - translationa lm odification through these ana lyses can prov ide ind ispensab le ins ights in to b io log ica l functions of m e m brane prote ins . [ K ey words] me m brane proteo m ics ; me m brane prote ins ; e lec trophoresis , g e, l two -d i m ensiona; l spec trum analysis , m ass 理论上 , 这些技术可 整体平 移用于膜 蛋白质 组研 究 , 但膜蛋 白的溶解性是限制这 些技术应 用的瓶 颈。膜蛋 白质 组分析 技术的进展主要集中于提高膜蛋白的溶解性 , 以利用这些技 术进行分析。 top-down 技术还未应用 到膜蛋白 的分析 中 , 因 此 , 本文重点总结基于凝 胶的经 典的蛋 白质组学 方法和 鸟 枪 策略在膜蛋白质组研究中的进展 。
P rogress in analytical technology in m embrane proteom ics
H E J ia-T ian, WANG H ongX ia , ZHANG X ueM in, WE I K aiH ua