核酸-蛋白质互作
简述核酸和蛋白质代谢的相互关系
简述核酸和蛋白质代谢的相互关系全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：核酸是细胞内的一种重要有机物质，它由核苷酸构成，是构成核酸的基本单元。
核酸分为DNA（脱氧核糖核酸）和RNA（核糖核酸）两种。
核酸在细胞内具有非常重要的功能，它们可以携带遗传信息，参与蛋白质的合成，调控细胞的生长和分化等过程。
蛋白质则是细胞内最重要的有机物质之一，是生命体内各种生物学功能和生命活动不可或缺的组成部分。
蛋白质合成是一个复杂的生物化学过程，需要核酸的介入才能完成。
在细胞内，RNA起着传递DNA信息的作用，RNA通过转录过程将DNA上的遗传信息转换成RNA信息，然后RNA将这些信息传递给细胞内的核蛋白合成机器，进而合成蛋白质。
核酸代谢和蛋白质代谢是密切相关的，两者之间存在着相互关系。
在细胞内，核酸和蛋白质代谢之间的相互关系主要体现在以下几个方面：核酸还可以调控蛋白质的合成。
在细胞内，存在着一些特殊类型的RNA，如miRNA和siRNA等，它们能够通过靶向特定基因的mRNA，抑制或促进这些基因的表达，从而影响蛋白质的合成。
这种核酸介导的蛋白质合成调控，使得核酸和蛋白质代谢之间形成了一种复杂的调控网络。
核酸代谢和蛋白质代谢还存在着其他相互关系。
核酸可以通过调节细胞内mRNA的降解速率，影响蛋白质的合成水平；而蛋白质也可以参与核酸的合成和修复过程。
这些相互关系构成了细胞内核酸和蛋白质代谢的相互调节机制，维持了细胞内生物学功能的正常运行。
第二篇示例：核酸和蛋白质是生物体内两种重要的生物大分子，它们在生物体内的代谢过程中密不可分。
核酸是生物体内的遗传物质，负责信息的传递和储存，而蛋白质则是生物体内的最重要的功能分子，承担着多种生物过程中的功能。
核酸和蛋白质之间通过一系列生物化学反应相互转化，相互影响，共同维持着生物体内的代谢平衡和生物功能的正常进行。
核酸的合成过程称为核酸代谢，蛋白质的合成过程称为蛋白质代谢。
核酸和蛋白质的代谢密切相关，二者之间的相互关系主要体现在以下几个方面：核酸和蛋白质的合成过程相互依赖。
高一生物核酸蛋白质知识点
高一生物核酸蛋白质知识点核酸和蛋白质是生物体中非常重要的分子，承担着许多生命活动的重要功能。
在高一生物学的学习中，我们需要深入了解核酸和蛋白质的知识点，以便更好地理解生物的组成和功能。
本文将就核酸的结构和功能、蛋白质的结构和功能以及两者之间的关系进行探讨。
首先，让我们来了解核酸的结构和功能。
核酸是由核苷酸组成的大分子，包括DNA（脱氧核酸）和RNA（核糖核酸）两种类型。
DNA是生物体遗传信息的存储和传递载体，而RNA则参与遗传信息的转录和翻译过程。
DNA由两条互补的链以双螺旋结构存在，形成了双链DNA分子。
每条链由磷酸、核糖和碱基组成。
碱基包括腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C），它们之间通过氢键相互连接。
这种碱基的配对规则决定了DNA的遗传信息的稳定性。
除了DNA，RNA也是生物体中的重要分子。
RNA与DNA的区别在于，RNA中的胸腺嘧啶（T）被尿嘧啶（U）取代。
RNA的结构形式多样，包括信使RNA（mRNA）、转运RNA（tRNA）和核糖体RNA（rRNA）等。
mRNA通过转录过程将DNA上的遗传信息转移到蛋白质合成的位置；tRNA将氨基酸运送到核糖体，参与蛋白质合成的翻译过程；rRNA是核糖体的主要组成部分，起着结构和催化的作用。
接下来，让我们来了解蛋白质的结构和功能。
蛋白质是由氨基酸组成的聚合物，是生物体中最丰富的有机物质。
蛋白质参与了生物体的各种功能，包括结构、酶催化、免疫和运输等。
蛋白质的结构呈现出四个层次：一级结构是指由氨基酸组成的线性序列，二级结构是指蛋白质链的局部折叠，包括α-螺旋和β-折叠；三级结构是指整个蛋白质链的空间结构，由二级结构之间的相互作用所形成；四级结构是指由多个蛋白质亚基组成的复合物。
蛋白质的功能与其结构密切相关。
蛋白质的结构决定了其功能特性，例如酶的催化活性依赖于其特定的构象。
此外，蛋白质还可以通过与其他分子的结合来参与信号转导、运输物质和响应环境变化等功能。
电泳的原理的应用举例讲解
电泳的原理的应用举例讲解1. 什么是电泳?电泳是一种将带电粒子（通常是带电的蛋白质、DNA或RNA分子）在电场中移动的技术。
它基于粒子在电场中呈现电荷偏向性的原理。
2. 电泳的原理电泳的原理是基于电场对带电粒子的作用力和粒子的电荷量质量比的不同而产生的。
当电场施加在带电粒子上时，带电粒子会受到电场力的作用而在电泳溶液中运动。
带正电荷的粒子会移动到阴极，带负电荷的粒子会移动到阳极。
3. 电泳的应用举例3.1 蛋白质电泳蛋白质电泳是一种常见的蛋白质分离和分析方法。
它基于不同蛋白质在电场中移动速度的差异来分离不同的蛋白质。
蛋白质电泳广泛应用于生物医学研究、食品分析等领域。
应用举例：在食品分析中，蛋白质电泳可用于检测食品中的添加剂、致敏物质等。
通过分离和分析食品中的不同蛋白质，可以判断食品的质量和成分。
3.2 DNA电泳DNA电泳是一种常见的DNA分离和分析方法，它基于DNA分子的大小和电荷差异来进行分离和鉴定。
DNA电泳广泛应用于基因测序、DNA指纹鉴定等领域。
应用举例：在基因测序中，DNA电泳可用于检测DNA序列的长度和纯度，以确定基因序列的正确性。
3.3 RNA电泳RNA电泳是一种常见的RNA分析方法，它基于RNA分子的大小和电荷差异来进行分离和鉴定。
RNA电泳广泛应用于基因表达研究、疾病诊断等领域。
应用举例：在基因表达研究中，RNA电泳可用于分析不同组织或细胞中的RNA表达水平，以了解基因在不同组织中的表达差异。
3.4 蛋白质-核酸互作电泳蛋白质-核酸互作电泳是一种用于研究蛋白质和核酸相互作用的方法。
通过在电泳条件下观察蛋白质和核酸分子的运动，可以了解它们之间的相互作用。
应用举例：在疾病机制研究中，蛋白质-核酸互作电泳可用于检测病理过程中蛋白质和DNA/RNA之间的相互作用，从而揭示疾病的发生机制。
4. 总结电泳作为一种基于电场作用力的分离和分析技术，在生物医学研究、食品分析等领域中有着广泛的应用。
蛋白质与核酸的相互作用核酸结合蛋白模板
3.2.3 锌指结构的特点
Cys2His2锌 指蛋白与DNA 形成复合物的 X-射线晶体衍 射图谱。 三个锌指以 半环状排列于 DNA的大沟中。
3.2.3 锌指结构的特点
雌激素受体 (ER) DNA结 合结构域与 DNA识别因子 配位的同二聚 体。其中四个 圆代表二聚体 中的四个Zn 离子。
RNA结构的特点：胞内RNA一般呈单链结构，但往往 折叠成各种二级结构（突起、发夹、茎环等）。
RNA结合蛋白中的基本结构
结合结构 核糖核酸蛋白结 构域 dsRBD 结合部位 β-折叠 β-折叠 分布 真核生物 所有生物 举 例 U1A snRNP 果蝇的Staufen蛋白
K-同源蛋白
环区
真核生物
6.3 解读蛋白中的氨基酸
部分替换：用基因工程方法替换结构域中的某 些残基，研究其对与DNA结合的重要性。 结构分析：用X-射线、NMR方法研究发现，在 DNA和蛋白质结合过程中，蛋白质和DNA的构 象发生了适宜性的变化，水分子在蛋白和DNA 的相互作用中也发挥了特殊的作用。
6.4 假定的锌指蛋白DNA识别密码
目前还没有发现一套普遍的密码适用于所有的蛋白质 和氨基酸，但在锌指蛋白中发现了一个初步的规律。 锌指蛋白氨基酸残基与DNA碱基对应关系
3’
T A G
5’
与Zif268相关的锌指蛋白的部分DNA识别密码
三联体密码中碱基的位置
碱基
A C
5’
中部
3—Asn 3—Asn，Leu，Thr，Val
3’
-1—Gln+2--Ala
类固醇受体家 族 碱性结构域 带状-螺旋-螺旋 组蛋白-核心
α -螺旋
α -螺旋
真核生物
真核生物
核酸与蛋白质互作的生物化学解析
核酸与蛋白质互作的生物化学解析核酸与蛋白质互作是生物学领域中一个重要的研究课题。
核酸是DNA和RNA的总称，是生物体内保存遗传信息的重要分子。
而蛋白质则是构成细胞的主要成分，承担着多种生物学功能。
核酸与蛋白质之间的相互作用对于细胞的生长、分化、代谢等过程起着至关重要的调控作用。
本文将对核酸与蛋白质之间的互作进行生物化学解析。
一、核酸与蛋白质的结构特点核酸的结构主要由磷酸、五碳糖和碱基组成。
DNA的碱基包括腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、胸腺嘧啶（T）和胞嘧唑（C）四种。
RNA 的碱基包括腺嘌呤（A）、鸟嘌呤（G）、尿嘧啶（U）和胞嘧唑（C）四种。
蛋白质是由氨基酸通过肽键连接而成，具有复杂的三维结构。
蛋白质的功能主要取决于其特定的三维构象。
二、核酸与蛋白质的相互作用机制1. DNA与蛋白质的相互作用DNA和蛋白质之间的相互作用主要包括DNA结合蛋白、转录因子等。
DNA结合蛋白主要与DNA发生非特异性或特异性结合，参与DNA的复制、修复和重组等过程。
转录因子则在转录调控中发挥重要作用，通过与DNA特定序列结合，启动或抑制基因的转录。
2. RNA与蛋白质的相互作用RNA与蛋白质之间的相互作用主要包括RNA结合蛋白和RNA酶等。
RNA结合蛋白参与RNA的合成、修饰和稳定等过程，调控基因的表达水平。
RNA酶则参与RNA的降解过程，维持细胞内RNA的稳态。
三、核酸与蛋白质互作在生物学过程中的作用1. 转录调控核酸与蛋白质互作在转录调控中发挥重要作用。
转录因子与DNA特定序列结合，激活或抑制基因的转录，调控基因表达水平。
RNA结合蛋白则参与RNA的合成和修饰过程，影响基因的翻译和表达。
2. 蛋白质合成RNA酶参与RNA的降解过程，维持细胞内RNA的稳态。
蛋白合成依赖于RNA的翻译过程，RNA与核糖体、转运RNA等蛋白质协同作用，完成蛋白合成过程。
结语综上所述，核酸与蛋白质之间的互作在生物学过程中具有重要的生物化学意义。
核酸与蛋白质的相互作用与生命活动解析
核酸与蛋白质的相互作用与生命活动解析在生命的奥秘中，核酸与蛋白质的相互作用扮演着重要的角色。
核酸是生命的遗传物质，而蛋白质则是生命活动的执行者。
它们之间的相互作用不仅决定了生物的结构和功能，还参与了许多重要的生物过程，如DNA复制、转录和翻译等。
本文将从不同角度探讨核酸与蛋白质的相互作用对生命活动的影响。
首先，核酸与蛋白质的相互作用在生物体中起着重要的结构功能作用。
核酸分为DNA和RNA两种类型，DNA是遗传信息的存储库，而RNA则是信息的传递者和执行者。
蛋白质则是由氨基酸组成的多肽链，具有各种不同的结构和功能。
核酸与蛋白质之间的相互作用能够使蛋白质折叠成特定的结构，从而实现其特定的功能。
例如，DNA与蛋白质之间的相互作用可以形成染色体结构，使得DNA能够被紧密地包装在细胞核中，从而保护和维持遗传信息的稳定性。
其次，核酸与蛋白质的相互作用对基因表达和调控起着重要的作用。
基因表达是指遗传信息从DNA转录成RNA，再由RNA翻译成蛋白质的过程。
这一过程需要核酸与蛋白质之间的相互作用来协调和调控。
例如，转录因子是一类能够结合到DNA上的蛋白质，它们与DNA的结合能够启动或抑制基因的转录。
这种相互作用可以使细胞根据不同的环境信号和需求来调整基因的表达水平，从而适应不同的生理和生化过程。
此外，核酸与蛋白质的相互作用还参与了许多其他重要的生物过程。
例如，核酸酶是一类能够催化核酸的降解和合成反应的酶，它们与核酸的相互作用能够调控核酸的稳定性和代谢。
另外，核酸与蛋白质之间的相互作用还参与了细胞信号转导、免疫应答和细胞凋亡等重要的生物过程。
这些相互作用的失调往往会导致疾病的发生和发展，如癌症、遗传性疾病等。
最后，研究核酸与蛋白质的相互作用对于生命科学的发展具有重要意义。
通过研究核酸与蛋白质之间的相互作用，科学家们能够揭示生命活动的机制和规律，进而为疾病的治疗和预防提供理论依据。
例如，通过研究DNA与蛋白质的相互作用，科学家们可以开发出一些抗癌药物，从而有效地治疗癌症。
核酸-蛋白质互作的生物化学研究方法
核酸-蛋白质互作的生物化学研究方法
核酸-蛋白质互作是生物学中一个重要的研究领域，它涉及到核酸和蛋白质之间的相互作用，以及它们在生物体中的功能。
研究这种相互作用的生物化学方法有很多，其中最常用的是蛋白质结构分析、核酸结合实验、蛋白质-核酸相互作用实验和蛋白质-核酸相互作用的分子模拟。
蛋白质结构分析是研究核酸-蛋白质互作的重要方法，它可以帮助我们了解蛋白质的结构和功能，以及它们与核酸之间的相互作用。
通常，蛋白质结构分析可以通过X射线衍射、核磁共振成像和计算机模拟等技术来实现。
核酸结合实验是另一种研究核酸-蛋白质互作的重要方法，它可以帮助我们了解核酸与蛋白质之间的相互作用。
通常，核酸结合实验可以通过紫外光谱、荧光光谱和电泳等技术来实现。
蛋白质-核酸相互作用实验是研究核酸-蛋白质互作的重要方法，它可以帮助我们了解蛋白质与核酸之间的相互作用。
通常，蛋白质-核酸相互作用实验可以通过紫外光谱、荧光光谱、电泳和质谱等技术来实现。
最后，蛋白质-核酸相互作用的分子模拟是研究核酸-蛋白质互作的重要方法，它可以帮助我们了解蛋白质与核酸之间的相互作用。
通常，蛋白质-核酸相互作用的分子模拟可以通过分子动力学模拟、分子对接和分子模拟等技术来实现。
总之，蛋白质结构分析、核酸结合实验、蛋白质-核酸相互作用实验和蛋白质-核酸相互作用的分子模拟是研究核酸-蛋白质互作的重要生物化学方法。
这些方法可以帮助我们了解核酸和蛋白质之间的相互作用，以及它们在生物体中的功能。
生物化学中的核酸及蛋白质互作
生物化学中的核酸及蛋白质互作生物化学是研究生物体内分子结构、组成和功能的学科。
在生物化学中，核酸和蛋白质是两个重要的分子，它们在细胞内发挥着不可或缺的作用。
而核酸和蛋白质之间的互作更是生命活动的基础。
本文将探讨核酸和蛋白质在生物化学中的互作关系，以及它们在细胞内的功能和调控。
一、核酸的结构和功能核酸是生物体内的重要分子之一，包括DNA和RNA两种。
DNA是遗传信息的携带者，而RNA则参与基因表达和蛋白质合成等过程。
核酸的结构由碱基、糖和磷酸组成，其中碱基是核酸的核心部分，包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶四种。
核酸通过碱基之间的氢键相互连接，形成双链结构（DNA）或单链结构（RNA）。
核酸在细胞内发挥着多种功能。
首先，DNA作为遗传物质，携带着细胞的遗传信息，并通过复制和遗传转录传递给后代细胞。
其次，RNA参与了蛋白质的合成过程。
在转录过程中，DNA的信息被转录成RNA，然后通过翻译过程将RNA编码的信息转化为蛋白质。
此外，RNA还参与了细胞内的多种调控过程，如RNA干扰和RNA修饰等。
二、蛋白质的结构和功能蛋白质是生物体内最为丰富的分子，它们在细胞内担任着多种功能。
蛋白质的结构由氨基酸组成，氨基酸通过肽键连接在一起，形成多肽链。
蛋白质的结构可以分为四个层次：一级结构是指氨基酸的线性排列顺序；二级结构是指氨基酸之间的氢键相互作用，形成α螺旋和β折叠等结构；三级结构是指蛋白质的立体空间结构，由各种非共价键相互作用所决定；四级结构是指由两个或多个多肽链相互作用而形成的复合物。
蛋白质在细胞内具有多种功能。
首先，蛋白质作为酶，在细胞内催化各种生化反应，如代谢、合成和降解等过程。
其次，蛋白质作为结构蛋白，参与细胞的结构组织和维持细胞的形态。
此外，蛋白质还参与了细胞信号传导、运输和免疫等重要生物过程。
三、核酸和蛋白质的互作关系核酸和蛋白质之间的互作是生物体内最为复杂和重要的分子互作之一。
在细胞内，核酸和蛋白质之间通过多种方式相互作用。
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核酸－蛋白质互作的生物化学研究方法张金璧, 潘增祥, 林飞, 马雪山, 刘红林南京农业大学动物科技学院, 南京210095摘要:研究核酸－蛋白质的互作是揭示生命活动机理的基础, 文章简要综述了用于研究核酸－蛋白质互作的各种生物化学方法。
从体内、体外两个研究角度, 针对核酸、蛋白以及复合物3个研究水平, 概述了硝化纤维膜过滤实验、足迹法、EMSA、Southwestern杂交等经典分析方法的原理、发展和运用。
还着重介绍了最近在表观遗传学领域中广泛运用的nChIP、xChIP等基本染色质免疫沉淀(ChIP)技术及其衍生出的ChIP-on-chip等方法。
关键词: 核酸; 蛋白质; 互作; 足迹; 染色质免疫沉淀Biochemical methods for the analysis of DNA-protein interactionsZHANG Jin-Bi, PAN Zeng-Xiang, LIN Fei, MA Xue-Shan, LIU Hong-LinCollege of animal science and technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, ChinaAbstract: Investigation of DNA-protein interactions is fundamental to understand the mechanism underlying a variety of life processes. In this article, various types of biochemical methods inDNA-protein interaction study in vivo and in vitro at the level of DNA, protein, and the complex, respectively were briefly reviewed. Traditional assays including Nitrocellulose filter-binding assay, Footprinting, EMSA, and Southwestern blotting were summarized. In addition, chromatin immunoprecipitation techniques including nChIP, xChIP, and ChIP-on-chip, which were widely usedin epigenetics, were particularly introduced.Keywords: nucleic acid; protein; interaction; footprinting; chromatin immunoprecipitation (ChIP) 核酸－蛋白的互作在生命活动中发挥着广泛而重要的作用, 二者的协作是各种生命现象的基础。
将细胞或细胞器中的蛋白质、核酸等生物大分子的相互作用联系起来, 是综合研究一个完整的生物学途径的核心内容[1]。
近半个世纪以来, 研究者们在核酸－蛋白质复合物的构成和分解过程中进行了大量探索, 发展了一系列研究其互作关系的方法技术, 其中, 生物化学相关方法一直是重点与主流。
生物化学法主要利用酶或其他化学制剂, 通过切割、修饰等作用来分析或分辨存在相互作用的核酸和蛋白复合物, 研究其间潜在或实际的结合能力和结合方式。
其中DNaseⅠ、ExoⅢ足迹法以及更加精练的足迹技术, 如羟基自由基足迹分析、保护/干扰实验等, 在鉴别潜在的DNA靶点的基础上可进一步用于研究DNA-蛋白复合物中的DNA构成; 消化纤维膜过滤法、凝胶阻滞分析以及Southwestern印迹等能用作结合位点确定后相关蛋白的分离分析; 随着表观遗传学的兴起, 建立在DNA-蛋白交联基础上的染色质免疫沉淀(Chromatin immunoprecipitation, ChIP)技术迅速发展起来, 成为探索复杂的DNA-蛋白复合物结合情况的重要手段, 被广泛运用于转录复合体和组蛋白修饰的研究。
本文就相关方法的原理、应用及发展情况, 从体内、体外两个方面进行综述。
1体外的生化研究方法在对于蛋白质－核酸互作的多数研究, 尤其是早期研究中, 目的蛋白和目的核酸被分别提取出来, 在人工条件下进行孵育结合, 进行相关研究。
虽然实际上在生物体中, 二者有可能因为空间、电荷等各种关系无法接近而产生作用, 但体外方法有效地体现了核酸和蛋白质能够发生互作的潜力, 为核酸－蛋白质研究所广泛运用。
1.1 硝化纤维膜过滤实验膜过滤方法在核酸－蛋白质复合物研究中渊源已久, 最初用于RNA－蛋白质的互作研究[2], 后由Jones和Berg[3]于1966年首次将其用于DNA－蛋白质的研究中。
其原理是蛋白与硝化纤维膜(Nitrocellulose filter, NCF)结合, 但DNA不与其结合。
将标记过的DNA与蛋白质共同孵育, 用NCF过滤混合物, 则DNA能够通过NCF, 而DNA- protein 复合物留在NCF上。
随后干燥NCF, 通过标记物定量分析留在滤膜上的复合物, 即可判断二者的结合程度。
NC膜过滤的方法虽然在当前的研究中逐渐减少, 但其操作快速、简单, 能够定量地研究蛋白质与DNA相互作用, 仍在分析较多个核酸－蛋白质的互作关系中有一定用途。
Tran等[4]在蛋白互作研究中, 用膜过滤法确定促旋酶的DNA结合特性, Haque等[5]在研究线粒体翻译起始因子与核糖体的互作关系时, 用此方法分析起始复合物中RNA与核糖体蛋白的结合量变化情况; Posner等[6]结合芯片作用原理, 用滤膜板一次性检验384个G 蛋白联合受体的可能结合部位。
1.2足迹法足迹法最大的特点在于能确定蛋白结合DNA的片段长度, 其基本原理与DNA化学测序法相似, 首先将待测双链DNA片段进行标记, 然后加入适当浓度的探针对DNA进行消化剪切, 由于剪切具有随机性, 在反应完全时可将DNA切成单核苷酸。
若控制探针浓度, 将DNA部分消化, 就可以形成一个单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸……n核苷酸的混合物[7]。
经变性后电泳分离, 放射自显影, 即可形成以相差一个核苷酸为梯度的DNA条带。
但当结合上蛋白时, 相应的DNA序列不会受探针的攻击, 因而在放射自显影图谱上DNA梯度条带在相应DNA结合蛋白的结合区域中断, 形成一空白区域, 恰似蛋白质在DNA上留下的足迹, 因而被形象地称作足迹法。
具体原理见图1。
随着可选用的探针逐渐丰富, 足迹法的具体研究方法和功能也丰富起来, 针对不同用途选取不同的探针, 在解决多种实际问题中起到了很大作用。
用于互作分析的探针主要有两种: 生物酶探针和化学探针, 以下分别进行介绍。
1.2.1 酶足迹法生物酶探针特异性好, 一般不会与要研究的结合蛋白作用, 不会扰乱DNA与蛋白质的互作。
因此在脆弱的DNA－蛋白质复合体中, 酶探针更受欢迎[8]。
DNaseⅠ和exonucleaseⅢ是两种最主要的生物酶探针, 在定位与蛋白质结合的DNA序列上有较大优势。
1.2.1.1 DNaseI足迹DNaseⅠ是直径约40Å的蛋白, 结合在DNA小沟, 独立地切割两条链的磷酸骨架[9]。
由于其体积较大, 切割作用更容易受空间位阻作用的影响, 不能切割到有蛋白覆盖的区域及周边的DNA, 因此是足迹法中确定DNA－蛋白结合与否的理想方法之一, 可以确定结合在蛋白上的DNA的片段长度, 但不能给出具体核酸序列。
DNaseⅠ足迹法由Galas和Schmitz[7]于1978年首次运用于DNA序列特异性结合蛋白的研究中。
通常是将DNA单链末端标记, 然后与结合蛋白反应, 复合物用DNaseⅠ部分消化。
结合蛋白的区域受到蛋白保护, 免受DNaseⅠ攻击, 而产物由于分子量的差异, 经电泳和放射自显影即可得到一系列条带, 与对照消化产物的连续条带相比, 其中空缺部分即为蛋白的结合区域。
图1 足迹法原理通过同一DNA片段与多个蛋白的足迹分析, 可推断这些蛋白的结合域是否有交叠或相互分开, 从而推测这些蛋白之间的协作对基因的调节, 如Makarewicz等[10]用单体PhoP进行DNaseⅠ足纹法分析得出, PhoP_P二聚体在phy C启动子上有两个结合区域, 在启动子-35位的结合促进启动子活性, 而在-10的结合抑制其活性; Matta等[11]在拮抗酶Ato C和细菌调控元件的互作研究中, 用DNaseⅠ足迹法检测Ato C的结合位点, 得出其在两个20 bp的位置结合, 序列分析得出这两个位置正好构成与转录起始位点相关的回文序列。
DNaseⅠ足迹法在确定单一转录因子结合区的研究中应用也很广泛。
近期应用此法的一个典型例子是Connaghan-Jones等[12]在研究孕酮受体与小鼠乳腺肿瘤病毒启动子的互作时, 采用DNaseⅠ足迹法检测出PR-a在启动子上的5个特异结合区域。
当然, DNaseⅠ法亦有其缺点。
由于一些结合蛋白也会与其发生作用, 导致一些DNaseⅠ超敏感位点的存在。
另外DNaseⅠ对DNA的切割有位点偏好性, 因此得出的电泳梯度条带是不均匀的, 而且实验中底物需要量大, 不能自动区别开DNA－蛋白质复合体上的多个组分。
这些不足使DNaseⅠ技术具有一定局限性。
1.2.1.2 外切酶Ⅲ足迹法外切酶Ⅲ(ExonucleaseⅢ, ExoⅢ)加工过程独特, 使其在研究序列特异性结合蛋白的工作中成为一种常用的探针, 适用于蛋白结合位置DNA序列的分析。
ExoⅢ是单体酶, 分子量小(28 000 kDa), 具有3'→5'外切酶活性、RNaseH 活性、3′磷酸酶活性和AP核酸内切酶活性[13]。
ExoⅢ足迹法运用了其3'→5'外切酶活性[14], 当ExoⅢ切割双链DNA时, 有蛋白结合的位置被保留下来, 产生的两条单链DNA片段经过变性凝胶电泳分析, 放射自显影检测即可得到结合片段大小。
一般来说, ExoⅢ足迹的切割片段要比DNaseⅠ略小一些, 所有的未被结合的DNA都被完全消化, 这是ExoⅢ的优势所在, 不存在自由DNA产生的背景问题。
不过使用ExoⅢ探针的先决条件是, 蛋白和DNA互作的半衰期不能少于Exo III作用所需要的时间[8]。
ExoⅢ足迹法最早由Shalloway等[14]采用, 通过此方法, 他们用SV40 T抗体找出了SV40 DNA复制起始位点结合区域。