苯酚硫酸法测多糖含量
实验一、硫酸苯酚法测多糖含量
实验一硫酸－苯酚法测多糖含量1．目的要求测量蒽酮硫酸法不能测量的血清型的过程样品中的多糖含量2．方法原理糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定，在波长490 nm处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量，本方法可用于多糖、单糖含量的测定。
3．主要实验仪器及材料浓硫酸，苯酚，蒸馏装置，分光光度计，电子天平，坐标纸或电脑等。
４．掌握要点硫酸显色的安全、准确操作，单糖到多糖的转换系数。
５．试剂配制1）葡萄糖标准液的配制准确称取干燥恒重的葡萄糖100 mg，蒸馏水准确定容至100 mL的1 mg/L的葡萄糖液，摇匀后准确吸取10 mL该溶液，蒸馏水稀释定容至100 mL,即得100 ug/mL的葡萄糖标准液。
2）90%苯酚液的配制准确移取苯酚90mL，蒸馏水定容至100 mL，即得90％苯酚液，棕色瓶中避光保存3）6%苯酚液的配制将90%苯酚液稀释至6%，即一体积储存液对应十四体积纯水，临用现配。
6.实验步骤表1 标准曲线的制作步骤管号0 1 2 3 4 5 6 7葡萄糖 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 1.0苯酚液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5浓硫酸 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0取8支干净的具塞试管按表2方法在操作，先在冰水浴中加入0.5ml的苯酚溶液，震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸，以不放热或微量放热为宜，摇匀后恒温加塞沸水放置20min,取出凉水冷却10min,以0号作为空白调零,在最大吸收波长处（490nm）测定吸光度。
以葡萄糖浓度X为横坐标（ug/mL），吸光度Y为纵坐标，从而来绘制标准曲线。
用exceL软件求得回归方程2）待测样品多糖的测定与计算将提取得到的待测多糖用蒸馏水溶解，定容至100 mL,取溶解后的溶液，按标准曲线中的测定方法，以样液为参比液，测定溶液的吸光值，按回归方程计算待测溶液的多糖浓度，注意乘换算系数。
苯酚硫酸法测多糖
采用硫酸-苯酚法测定多糖含量[10-11]。
标准曲线的制作：精确称取经干燥至恒重的标准葡萄糖10mg，用蒸馏水定容至100mL，分别吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL，各以蒸馏水补至2mL，然后加入6%苯酚水溶液1.0mL，再迅速加入浓硫酸5.0mL，水浴15分钟后显色彻底，在冷水中冷却，至室温后在波长490nm处测定吸光度，以水代替糖溶液作空白对照，以吸光度为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标制作标准曲线。
样品测定：取定容液1mL于试管中，稀释10倍即加入蒸馏水9mL得样品液，吸取该多糖样品溶液1mL按标准曲线制作步骤操作，测吸光度，以标准曲线计算多糖含量。
表2 葡萄糖标准曲线设计方案
根据以上表格数据作葡萄糖标准曲线，如下：。
实验一、硫酸苯酚法测多糖含量
实验一硫酸-苯酚法测多糖含量1.目的要求测量蔥酮硫酸法不能测量的血清型的过程样品屮的多糖含量2•方法原理糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定，在波长490 nm处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量，本方法可用于多糖、单糖含量的测定。
3•主要实验仪器及材料浓硫酸，苯酚，蒸馆装置，分光光度计，电子天平，坐标纸或电脑等。
4.掌握要点硫酸显色的安全、准确操作，单糖到多糖的转换系数。
5 .试剂配制1)葡萄糖标准液的配制准确称取干燥恒重的葡萄糖100 mg,蒸馅水准确定容至100 mL的1 mg/L的葡萄糖液，摇匀后准确吸取10 mL该溶液，蒸馆水稀释定容至100 mL,即得100 ug/mL的葡萄糖标准液。
2)90%苯酚液的配制准确移取苯酚90mL,蒸憎水定容至100 mL,即得90 %苯酚液，棕色瓶屮避光保存3)6%苯酚液的配制将90%苯酚液稀释至6%,即一体积储存液对应十四体积纯水，临用现配。
6.实验步骤表1标准曲线的制作步骤0123456AvV丨• ■ •葡萄糖0. 00. 10. 20. 30.40. 60. 8 1.0苯酚液0. 50. 50. 50. 50. 50. 50. 50. 5浓硫酸 3. 0 3. 0 3. 0 3. 0 3.0 3. 0 3. 0 3.0取8支干净的具塞试管按表2方法在操作，先在冰水浴中加入0.5ml的苯酚溶液，震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸，以不放热或微量放热为宜，摇匀后恒温加塞沸水放置20mi n,取出凉水冷却lOmin,以0号作为空白调零，在最大吸收波长处(490nm)测定吸光度。
以葡萄糖浓度X为横坐标(ug/mL),吸光度Y为纵坐标，从而来绘制标准曲线。
用exceL软件求得回归方程2)待测样品多糖的测定与计算将提取得到的待测多糖用蒸馅水溶解，定容至100 mL,取溶解后的溶液，按标准曲线中的测定方法，以样液为参比液，测定溶液的吸光值，按回归方程计算待测溶液的多糖浓度，注意乘换算系数。
苯酚-硫酸比色法测定多糖含量
苯酚-硫酸比色法测定多糖含量
苯酚-硫酸法是常用的多糖含量测定方法之一。
该方法基于多糖在硫酸的作用下，与苯酚产生颜色反应的原理，利用光度计测定反应产物的吸收值，从而计算出多糖的含量。
步骤如下：
1. 取样品0.1g，在50ml锥形瓶中加入5ml去离子水，振荡
20min溶解。
2. 加入2ml 5%苯酚水溶液，振荡均匀。
3. 加入5ml浓硫酸，使用磁力搅拌器搅拌1-2min。
4. 将混合物放置在冷水中冷却10min。
5. 用紫外分光光度计在490nm处测定吸光度A，同时以含有相同试验液体积的去离子水为对照。
6. 计算样品中多糖含量。
该方法测定简便，精度高，适用于多糖含量较高的样品。
但此法不能区分多糖的种类及其组成，不能应用于含非多糖的样品中。
苯酚_硫酸比色法测定多糖含量
随着对生物药物、天然药物和保健食品研究的深入，多糖的研究进展很快。
目前多糖含量的测定方法尚无统一标准，广泛应用的是苯酚－硫酸比色法。
该法具有简单、快速、无需多糖纯品和贵重仪器等优点，且对水溶性样品和非水溶性样品均可测定。
１ 苯酚－硫酸比色法原理苯酚－硫酸比色法测定多糖含量是由Ｄｕｂｏｉｓ等［１，２］提出的。
其原理是：多糖或寡糖被浓硫酸在适当高温下水解，产生单糖，并迅速脱水成糠醛衍生物，该衍生物在强酸条件下与苯酚起显色反应，生成橙黄色物质，在波长４９０ｎｍ处和一定浓度范围内，其吸光度Ａ值与糖浓度Ｃ呈线性关系，从而可用比色法测定其含量。
２ 实验方法２．１ 标准溶液的配制精密称取１０５℃下干燥至恒重的葡萄糖约１００．０ｍｇ，置１００ｍＬ量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，配得葡萄糖标准溶液。
２．２ 供试品贮备液的配制将样品进行适当处理（如真空干燥、回流提取等，根据各品种不同而有差异），取适量，按一定比例稀释，配制供试品贮备液。
２．３ 苯酚溶液的配制称取苯酚１００ｇ，加铝片０．１ｇ和碳酸氢钠０．０５ｇ，常压蒸馏，收集（１８０±２）℃馏分。
精密称取该馏分约１０．０ｇ置于２００ｍＬ量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀后转置于棕色试剂瓶中，即得苯酚溶液，将其置于冰箱中备用。
２．４ 测定条件选择２．４．１ 反应温度选择 精密吸取供试品贮备液、葡萄糖标准液各１．０ｍＬ于１００ｍＬ量瓶中，用水稀释至刻度，分别作为供试品溶液和对照品溶液。
分别吸取供试品溶液１．０ｍＬ于两个具塞试管中，各加苯酚液１．０ｍＬ，并分别迅速滴加浓硫酸５．０ｍＬ。
一份于水浴中煮沸１５ｍｉｎ，另一份于４０℃水浴中恒温３０ｍｉｎ。
另取两份对照品溶液１．０ｍＬ同上操作。
取出，冷却至室温，１５ｍｉｎ后于４９０ｎｍ处测其Ａ值，选取Ａ较高的作为实验温度。
２．４．２ 苯酚及硫酸用量选择 分别吸取供试品液和对照品液１．０ｍＬ５份，各加入苯酚液０．２，０．４，０．６，０．８，１．０ｍＬ，加水至２．０ｍＬ，再各滴加浓硫酸５．０ｍＬ，４０℃恒温３０ｍｉｎ后，测其Ａ值，从苯酚液加入量达到某一值开始，Ａ值基本保持不变，说明苯酚液量达到该值以上时，反应都能完成。
苯酚_硫酸比色法测定多糖含量
随着对生物药物、天然药物和保健食品研究的深入，多糖的研究进展很快。
目前多糖含量的测定方法尚无统一标准，广泛应用的是苯酚－硫酸比色法。
该法具有简单、快速、无需多糖纯品和贵重仪器等优点，且对水溶性样品和非水溶性样品均可测定。
１ 苯酚－硫酸比色法原理苯酚－硫酸比色法测定多糖含量是由Ｄｕｂｏｉｓ等［１，２］提出的。
其原理是：多糖或寡糖被浓硫酸在适当高温下水解，产生单糖，并迅速脱水成糠醛衍生物，该衍生物在强酸条件下与苯酚起显色反应，生成橙黄色物质，在波长４９０ｎｍ处和一定浓度范围内，其吸光度Ａ值与糖浓度Ｃ呈线性关系，从而可用比色法测定其含量。
２ 实验方法２．１ 标准溶液的配制精密称取１０５℃下干燥至恒重的葡萄糖约１００．０ｍｇ，置１００ｍＬ量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，配得葡萄糖标准溶液。
２．２ 供试品贮备液的配制将样品进行适当处理（如真空干燥、回流提取等，根据各品种不同而有差异），取适量，按一定比例稀释，配制供试品贮备液。
２．３ 苯酚溶液的配制称取苯酚１００ｇ，加铝片０．１ｇ和碳酸氢钠０．０５ｇ，常压蒸馏，收集（１８０±２）℃馏分。
精密称取该馏分约１０．０ｇ置于２００ｍＬ量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀后转置于棕色试剂瓶中，即得苯酚溶液，将其置于冰箱中备用。
２．４ 测定条件选择２．４．１ 反应温度选择 精密吸取供试品贮备液、葡萄糖标准液各１．０ｍＬ于１００ｍＬ量瓶中，用水稀释至刻度，分别作为供试品溶液和对照品溶液。
分别吸取供试品溶液１．０ｍＬ于两个具塞试管中，各加苯酚液１．０ｍＬ，并分别迅速滴加浓硫酸５．０ｍＬ。
一份于水浴中煮沸１５ｍｉｎ，另一份于４０℃水浴中恒温３０ｍｉｎ。
另取两份对照品溶液１．０ｍＬ同上操作。
取出，冷却至室温，１５ｍｉｎ后于４９０ｎｍ处测其Ａ值，选取Ａ较高的作为实验温度。
２．４．２ 苯酚及硫酸用量选择 分别吸取供试品液和对照品液１．０ｍＬ５份，各加入苯酚液０．２，０．４，０．６，０．８，１．０ｍＬ，加水至２．０ｍＬ，再各滴加浓硫酸５．０ｍＬ，４０℃恒温３０ｍｉｎ后，测其Ａ值，从苯酚液加入量达到某一值开始，Ａ值基本保持不变，说明苯酚液量达到该值以上时，反应都能完成。
苯酚硫酸法测定多糖
分子量大于10，000道尔顿的多糖经80%乙醇沉淀后，加入碱性铜试剂，选择性地从其他高分子物质中沉淀出葡聚糖，沉淀部分与苯酚-H2SO4反应，生成有色物质，在485nm条件下，有色物质的吸光度值与葡聚糖浓度成正比。
2. 适用范围参照AOAC方法。
适用于检测含有分子量大于10，000道尔顿葡聚糖的样品。
3.仪器（1）分光光度计（2）离心机（3）旋转混匀器（4）恒温水浴锅4.试剂除特殊说明外，实验用水为蒸馏水，试剂为分析纯。
（1）80%乙醇：800ml无水乙醇加水200ml。
（2）2.5 mol/L NaOH溶液：100 g NaOH加蒸馏水稀释至1 L，加入固体无水硫酸钠至饱和。
（3）铜贮存液：称取3.0 g CuSO4 ·5H2O，30.0 g柠檬酸钠加水溶解至1 L。
溶液可贮存2周。
（4）铜应用溶液：取铜贮存液50 ml，加水50 ml混匀后加入无水硫酸钠12.5 g，临用新配。
（5）洗涤液：取水50 ml，加入10 ml铜应用溶液，10 ml 2.5 mol/L NaOH溶液，混匀。
（6）1.8 mol/L H2SO4：取100ml浓硫酸用水稀释至1L。
（7）20 g/L苯酚溶液：称取2.0g苯酚，加水溶解并稀释至100ml，混匀备用。
（8）葡聚糖标准液：称取500mg葡聚糖（分子量500,000D）于称量皿中，105℃干燥4h 至恒重，置于装有干燥硅胶的干燥器中冷却。
准确称取100mg干燥后的葡聚糖，用水定容至100ml，葡聚糖标准浓度为1.0 mg/ml。
（9）葡聚糖标准应用液：吸取葡聚糖标准液10ml，用水稀释10倍，葡聚糖终浓度为0.1mg/ml。
5. 操作方法5.1 样品处理（1）样品提取：称取样品1～5g，加水100ml，沸水浴加热2h，冷却至室温，定容至200ml （V1），混匀后过滤，弃初滤液，收集余下滤液。
（2）沉淀高分子物质：准确吸取上述滤液100ml （V2），置于烧杯中，加热浓缩至10ml，冷却后，加入无水乙醇40ml，将溶液转至离心管中以3000rpm离心5min，弃上清液，残渣用80%乙醇洗涤3次，残渣供沉淀葡聚糖之用。
实验一硫酸苯酚法测多糖含量
实验一硫酸苯酚法测多糖含量The pony was revised in January 2021实验一硫酸－苯酚法测多糖含量1．目的要求? 测量蒽酮硫酸法不能测量的血清型的过程样品中的多糖含量2．2．方法原理3．糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定，在波长490 nm处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量，本方法可用于多糖、单糖含量的测定。
4．3．主要实验仪器及材料5．浓硫酸，苯酚，蒸馏装置，分光光度计，电子天平，坐标纸或电脑等。
6．４．掌握要点7．硫酸显色的安全、准确操作，单糖到多糖的转换系数。
8．５．试剂配制9．1）葡萄糖标准液的配制10．准确称取干燥恒重的葡萄糖100 mg，蒸馏水准确定容至100 mL的1 mg/L的葡萄糖液，摇匀后准确吸取10 mL该溶液，蒸馏水稀释定容至100 mL,即得100 ug/mL的葡萄糖标准液。
11．2）90%苯酚液的配制12．?准确移取苯酚90mL，蒸馏水定容至100 mL，即得90％苯酚液，棕色瓶中避光保存3）6%苯酚液的配制将90%苯酚液稀释至6%，即一体积储存液对应十四体积纯水，临用现配。
6.实验步骤表1 标准曲线的制作步骤7.管号 0? 1 2 3 4 5 6 78.葡萄糖9.10.苯酚液11.浓硫酸?12.取8支干净的具塞试管按表2方法在操作，先在冰水浴中加入的苯酚溶液，震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸，以不放热或微量放热为宜，摇匀后恒温加塞沸水放置20min,取出凉水冷却10min,以0号作为空白调零,在最大吸收波长处（490nm）测定吸光度。
以葡萄糖浓度X为横坐标（ug/mL），吸光度Y为纵坐标，从而来绘制标准曲线。
用exceL 软件求得回归方程13.2）待测样品多糖的测定与计算14.将提取得到的待测多糖用蒸馏水溶解，定容至100 mL,取溶解后的溶液，按标准曲线中的测定方法，以样液为参比液，测定溶液的吸光值，按回归方程计算待测溶液的多糖浓度，注意乘换算系数。
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一、硫酸苯酚法测多糖含量
1、试剂配制
1. 浓硫酸：分析纯，95.5%
2. 5%苯酚：取苯酚5 g，置100 ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀后，置棕
色试剂瓶中，冰箱中冷藏储存备用。
3. 标准葡聚糖（Dextran,瑞典Pharmacia）或分析纯葡萄糖。
准确称取20m g
经105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品于500ml容量瓶中，蒸馏水溶解定容。
2、制作标准曲线
准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）10mg于250ml容量瓶中，加水至刻度，分
别吸取0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8及0.9ml，各以蒸馏水补至1.0ml，
然后加入5%苯酚1ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20min以后于490nm测
光密度，以1.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光
密度值，得标准曲线。
1 2 3 4 5 6 7 8 0
0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 0 标准葡萄糖溶液
（mL）
蒸馏水（mL）0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 1.0 5%苯酚（mL）0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 浓硫酸（mL） 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5。