DNA转录

DNA 转录
中心法则—— “一个中心（DNA），两个基本点（RNA和 蛋白质”。 与DNA复制的共同性质 1) 需要模板、解链和解除转录过程中形成的正超螺旋 2) 只能按照5′→3′的方向进行 虫草素可以证明此。 与DNA复制不同的性质 1)不需要引物 2) NTPs 代替dNTPs; UTP代谢dTTP 3) 缺乏校对活性（错误率在1/104 ~1/105 nts） 4) 发生在特定的区域（不是所有的DNA序列） 5) 对于一个特定的基因而言，只有一条链转录 记住一些名称——模板链（无意义链，Watson链）和编 码链（有意义链，Crick链）
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RNA聚合酶全酶 -70
启动子特异性的 转录起始
’
* ‘ 结合DNA * 结合NTPs * 和 ‘ 一起构成活性中心 * 似乎是组装和酶受调节蛋白激活所必需的。它们也能结 合 DNA. * r识别启动子序列
σ因子
具有两个功能 (1) 降低酶对非特异性DNA序列的亲和性。 (2) 大大提高酶对启动子序列的亲和性。
病毒RNA 聚合酶
* T7 RNA 聚合酶 * T3 RNA聚合酶 * SP6 RNA聚合酶
转录的详细机制
* 三步骤反应 1) 起始 2) 延伸 3) 终止 * 原核生物的DNA转录 * 真核生物的DNA转录 * 体外转录
原核生物的DNA转录
* 起始 1) 什么是启动子？ 2) 如何决定启动子序列？ DNA酶I足印法 3) 启动子一致序列 4) 转录复合物的形成 * 延伸 * 终止
转录的起始
转录的起始实际上是RNA聚合酶与启动子相互作用并形 成活性转录起始复合物的过程，整个反应可分为以下 几步： * RNA聚合酶与dsDNA非特异性结合 * RNA 聚合酶全酶与启动子形成封闭复合物 * 封闭复合物异构化，转变成开放复合物 * 第一个磷酸二酯键形成 * 启动子清空
细菌基因转录起始过程中开放复合物的形成
放射性同位素标记
DNA酶I部分消化
缺少的片段
电泳
放射自显影
足印
原核生物几种基因的启动子序列
启动子的性质
* 启动子通常由转录起始点上游40bp长的序列组成 * 包括两段一致序列： “-35 区”—— 一致序列是TTGACA Pribnow盒或“-10 区”——一致序列是TATAAT，它有利于 解链，为什么？ * “－35”区和“－10区”之间的间隔序序列的性质不重要， 但长度重要，一般为17±1bp。 * “增强元件”——发现在某些转录活性超强的rRNA基因的 上游－40和－60之间的区域，富含AT的启动子序列，可将 转录活性提高30倍。 * 如果一个基因的启动子序列与一致序列越相近，则该启动 子的效率就越高，为强启动子；如果一个基因的启动子序 列与一致序列相差越大，则该启动子的效率就越低，为弱 启动子。
α鹅膏蕈碱的化学结构
真核细胞核RNA聚合酶共同的性质
* 都是大的多亚基蛋白质（500-700 k） * 都有两个大的与大肠杆菌RNA聚合酶和′亚基同 源的亚基，因此活性中心是保守的 * 都有与大肠杆菌亚基同源的亚基 * 然而，真核RNA聚合酶没有与大肠杆菌σ因子同源 的亚基 * 这些性质是所有真核生物RNA聚合酶共同的
来自嗜热水细菌的RNA聚合酶 核心酶的三维结构
聚合酶具有 螃蟹钳子的 形状，其内 部含有结合 DNA和RNA 的宽广的通 道。
真核细胞的RNA聚合酶
真核细胞的RNA聚合酶出现了功能分工，不同性 质的RNA由不同的RNA聚合酶催化转录，其细胞 核具有三种RNA聚合酶，即RNA聚合酶I、II、和 III，三者也分别被称为RNA聚合酶A、B和C，它 们分别催化细胞核内的rRNA（5S rRNA除外）、 mRNA和小分子RNA（tRNA和5SrRNA）的转录。 除此以外，线粒体和叶绿体也含有RNA聚合酶。
真核细胞5种RNA聚合酶结构与功能的比较 名称 RNA聚合酶I （A） RNA聚合酶 II（B） RNA聚合酶 Ⅲ（C） 细胞定 位 核仁 对α-amanitin的 敏感性 不敏感 对放线菌素D 转录 功能 的敏感性 因子 非常敏感 1到 3种 8种 以上 4种 以上 rRNA的合成（除了5S rRNA） mRNA，具有帽子结构 的SnRNA的合成 小分子RNA，包括 tRNA，5S rRNA，没有 帽子结构的SnRNA，7S RNA，端粒酶RNA，某 些病毒的RNA等合成。 所有线粒体RNA的合成
RNA聚合酶
* 共同的性质 -DNA模板：一条链被转录 -底物：GTP, CTP, UTP, ATP -二价金属离子：Mg2+ * 与DNA聚合酶之间的主要差别
RNA聚合酶与DNA聚合酶的差别
（1）RNA聚合酶只有 5′→3′的聚合酶活性，无5′-外切酶或3′-外切酶的活 性。RNA聚合酶缺乏 3′-外切酶的活性是转录忠实性不如复制的主要原 因； （2）RNA聚合酶本身就能够促进DNA双链解链； （3）RNA聚合酶催化转录的从头合成，不需要引物； （4）RNA聚合酶与进入的NTP上的2′-OH有多重接触位点； （5）RNA聚合酶在转录的起始阶段，DNA分子会形成皱褶，以使在发生 无效转录时，仍然能与启动子结合； （6）在转录过程中，转录物与模板解离，而在复制中，DNA聚合酶上开 放的裂缝允许DNA双链从酶分子上伸展出来； （7）RNA聚合酶在转录的起始阶段受到多种调节蛋白的调控； （8）RNA聚合酶的底物是NTP，而不是dNTP，由UTP代替dTTP； （9）RNA聚合酶启动转录需要识别启动子； （10）RNA聚合酶的反应速度低，平均值只有50nt/秒。
Fig. 9.9
转录的延伸
一旦σ因子释放，转录就进入延伸。失去σ因子的核心酶通过 松散的“滑动钳”构象握住DNA，以更快的速度沿着模板链向 前推进。转录泡则随着核心酶的移动而移动，其大小维持在 17 bp左右。转录泡的维持不仅需要聚合酶在转录泡前面解链 以使新的模板链序列得以暴露，而且还要允许转录泡后面的 DNA重新形成双链。解链形成的超螺旋可被结合在转录泡前 面的拓扑异构酶解除。由于转录的方向始终是从5′→3′，新 参入的核苷酸总是被添加在RNA链的3′-OH端。每参入一个 新的核苷酸，RNA-DNA杂交双链必须发生旋转。 在延伸阶段，RNA链3′-端大约有9 bp长的片段与模板链形成 A型杂交双螺旋。延伸的平均速度在37º C下约为50nt/秒。但 是，延伸速度并不是恒定的，已发现很多基因当转录到某些 位置的时候，如富含GC碱基对的区域，聚合酶的移动速度 趋缓，甚至发生暂停。有时，互补的NTP暂时短缺也可导致 RNA聚合酶的暂停。如果发生这种情形，重新启动RNA合成 需要内源核酸酶—GreA和GreB来解除暂停状态：先是RNA 聚合酶倒退，然后，GreA和GreB切除 3′-端几个核苷酸，以 便让RNA的3′-OH能重新回到活性中心。
核质
核质
高度敏感(108~10-9 mol/L) 中度敏感
轻度敏感
轻度敏感
线粒体RNA 聚合酶
线粒体 基质
不敏感
敏感
2种
叶绿体RNA 聚合酶
叶绿体 基质
不敏感
敏感
3种 所有叶绿体RNA的合成 以上
RNA聚合酶 II 抑制剂
• 白毒伞含有有毒的环状十肽——鹅膏蕈碱
这种蘑菇口味
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原核生物和真核生物RNA聚合酶的结构比较
来自嗜热水生菌的RNA聚合酶
来自酵母细胞的RNA聚合酶II 注意两者总体形状是相同 的。
亚基同源物在空间上的分 布也是相同的。
小鼠、果蝇和酵母的CTD序列
羧基端结构域——CTD
所有的真核细胞RNA聚合酶II最大亚基的CTD都含有 一段由7个氨基酸残基组成的高度保守的重复序列，其 一致序列是富含羟基氨基酸的YSTPSPS，因此能够被 磷酸化修饰。在酵母细胞，该序列重复了26次，哺乳 动物则重复56次。该重复序列是RNA聚合酶II的活性 所必需的。缺失突变实验表明，酵母的CTD至少需要 13段重复序列它才能保证酵母细胞能够生存。其它研 究还表明，CTD没被磷酸化的RNA聚合酶II参与转录 的起始，CTD被磷酸化以后，转录才从起始阶段进入 延伸阶段，而且磷酸化的CTD对于转录的后加工（带 帽和加尾）也是必需的。
原核生物RNA聚合酶的结构与功能
所有的三类RNA由同一种RNA聚合酶催化
大肠杆菌的RNA聚合酶大小为465 k，含有2 , 1 , 1 ′, 1 , 1ω亚基
* 全酶 * 核心酶：2 , 1 , 1 , 1ω*抑制剂利福霉素和利链霉素
大肠杆菌RNA聚合酶全酶的组成及其功能分工 亚基 α亚基 β亚基 β′亚基 ω亚基 σ70因子 基因 RopA RopB RopC RopZ RopD 大小（kDa） 36 151 155 11 70 每一个酶分子中 的数目 2 1 1 1 1 功能 聚合酶的组装，转录的起始，与 调节蛋白的相互作用 转录的起始和延伸 DNA结合 在体外为变性的RNA聚合酶成功 复性所必需 启动子的识别
(w亚基是组装效率提高)
1 2 ’ 2 2 2’ = 核心酶
核心酶的组装
核心酶 无序列特异性, 非特异性转录起始
70
正常生长 (主要的)
+
32
热休克 (应急条件下)
60
N饥饿 (应急条件下)
σ 因子 可以互换的, 启动子识别
1 70 全酶的结构与功能:
细菌基因转录从起始阶段向延伸阶段的转变
RNA聚合酶催化1个磷酸二酯键形成以后面临的3种选择
RNA聚合酶每催化1个新的磷酸二酯键 形成就面临3种选择：（1）继续延伸 —合成新的磷酸二酯键；（2）倒退— 向后滑动，新生RNA 3′-端的一部分序 列与DNA模板链解离；（3）解离—转 录延伸复合物的完全解离，转录结束 。 在3种选择中，倒退有时作为一种转录 校对的手段，因为聚合酶的倒退会使 新生RNA的3'-端暴露出来。如果转录 中正好发生了错误，含有错误的寡聚 核苷酸就被GreA蛋白或GreB 蛋白切除 。GreA与GreB十分相似，但作用机制 略有不同，其中GreA受刺激后切除 2nt~3 nt长的寡聚核苷酸，GreB 受刺激 后切除2nt~9 nt长的寡聚核苷酸。