核酸的性质

合集下载

06核酸的性质

06核酸的性质
DNA的变性达到50%时 DNA的变性达到50%时,即增色效应达到一半时的温度称为 的变性达到50% DNA的解链温度 meltingtemperature,Tm) Tm也称熔解 的解链温度( DNA的解链温度(meltingtemperature,Tm),Tm也称熔解
下一页
温度或DNA的熔点。 温度或DNA的熔点。 DNA的熔点 一般DNA的 值在70 85° 70一般DNA的Tm值在70-85°C之间 DNA
六、核酸的性质
目录
(一)、核酸的一般理化性质 )、核酸的一般理化性质
DNA为白色纤维状固体,RNA为白色粉末状固体 为白色粉末状固体, DNA为白色纤维状固体,RNA为白色粉末状固体, 为白色纤维状固体 都微溶于水,其钠盐在水中的溶解度较大。 都微溶于水,其钠盐在水中的溶解度较大。但不 溶于乙醇、 溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂。(用乙 醇从溶液中沉淀核酸) 醇从溶液中沉淀核酸) DNA和RNA在细胞中常以核蛋白形式存在 在细胞中常以核蛋白形式存在, DNA和RNA在细胞中常以核蛋白形式存在,两种核 蛋白在盐溶液中的溶解度不同。 蛋白在盐溶液中的溶解度不同。 DNA溶液的粘度很大 溶液的粘度很大, RNA溶液的粘度小得多 溶液的粘度小得多。 DNA溶液的粘度很大,而RNA溶液的粘度小得多。 核酸发生变性或降解后其粘度降低。 核酸发生变性或降解后其粘度降低。 核酸受到强大离心力的作用时, 核酸受到强大离心力的作用时,可从溶液中沉降 下来,其沉降速度与核酸的大小和密度有关。 下来,其沉降速度与核酸的大小和密度有关。
下一页
退出
人类将进入生物经济时代
目录
基因——操纵生命的工具 操纵生命的工具 基因 基因组——潜藏着巨大的经济价值 潜藏着巨大的经济价值 基因组

第八章 核酸的理化性质 - 复制

第八章 核酸的理化性质 - 复制

mRNA的提取 磁珠吸附法
4.核酸的含量测定
紫外吸收法:
定磷法:在浓H2SO4作用下将有机P转化成无机P, 酸性条件下与钼酸作用氧化成磷钼酸,最终被还 原成钼蓝,660nm测定紫外吸收。 定糖法: 1)核糖与浓盐酸和苔酚蓝共热呈绿色, 在 670nm处可测RNA; 2)2-脱氧核糖与酸和二苯胺共热呈蓝 紫色,在595nm处可测DNA。
3.判断DNA是否变性
在DNA的变性过程中,摩尔吸光系数增大(增色效应) 在DNA的复性过程中,摩尔吸光系数减小(减色效应)
四 核酸的变性、复性、分子杂交
1、变性(Denaturation)
1)定义:双螺旋DNA的 有序结构或具双螺旋 区的RNA,在外界因 素的作用下,碱基间 的氢键断裂,形成无 规则单链线团结构的 过程。
DNA的Tm一般在82— 95℃之间
3.影响Tm的因素:
1)DNA的均一性
均一性高,变性温度范围越窄,据此可分析DNA均 一性。
2)G-C含量:Tm与G-C含量成正比。 (G+C)%=(Tm-69.3)X2.44
3)介质的离子强度:离子强度低,Tm低,
熔解温度范围窄。
大肠杆菌DNA在不同浓度KCl溶液下的熔融温度曲线
32P
*ACTTCGACAG 肼/Nacl(C): *AC *ACTTC *ACTTCGA C *ACTTCGACAG 肼(C+T): *AC *ACT *ACT T *ACTTC *ACTTCGAC *ACTTCGACAG
硫酸二甲酯(G): *ACTTCG *ACTTCGACAG
甲酸(G+A): *A *ACTTCACAG
应用 于克 隆、 测序、 检测 DNA 等
碱基的解离 p504 核苷的解离 P505 核苷酸的解离 P505 核酸的滴定曲线 P506

核酸的组成与理化性质

核酸的组成与理化性质

3.脱氧核糖核酸酶类
OH OH
+
CMP
NH 2
±
CMP
N
pICMP =
pKa1+pKa2 2
=
0.8+4.5 2
= 2.65
NH 2 N
pKa2=4.5
O
ON
HO P O CH2 O
O-
HH
H
H
OH OH
CMP-
pKa3=6.4
O -
ON
O P O CH2 O
O-
HH
H
H
OH OH
CMP--
多核苷酸中磷酸二酯键中的磷酸基团只 有一个解离常数
主要内容
一、一般理化性质 二、核酸的酸碱性质(磷酸基,碱基) 三、核酸的水解(糖苷键,磷酸二酯键) 四、核酸的紫外吸收(碱基) 五、核酸的变性、复性与分子杂交 六、DNA纳米技术
一、一般物理性质
DNA为白色纤维状固体,RNA为白色粉末状固 体。均微溶于水,其钠盐易溶于水。不溶于 一般有机溶剂。
I从pH6.9用 酸或碱正向 滴定
II从pH12或 pH2.5分别反向 滴定
DNA分子内部的氢键的 变化,碱基的暴露
核酸的凝胶电泳
在中性或偏碱缓冲液中,核酸解离成阴离子,在电场 中向阳极移动。 迁移率与核酸的大小和构象有关,可用于核酸的分离、 鉴定
溴化乙啶染色
简单介绍 琼脂糖凝胶电泳技术
提取出来的质粒跑电泳胶 经常有1-3条带 单酶切
(三)酶水解
水解核酸的磷酸二酯酶称为核酸酶; 核酸酶的分类
(1)按底物专一性分 非特异性核酸酶:作用于DNA和RNA 核糖核酸酶(RNase):作用于RNA 脱氧核糖核酸酶(DNase):作用于DNA

核酸的理化性质及应用

核酸的理化性质及应用

核酸的理化性质及应用核酸是一类含有大量核苷酸单元的生物大分子,在细胞中起着重要的生物学功能。

核酸分为两类:脱氧核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。

下面我将介绍核酸的理化性质及应用。

一、核酸的理化性质:1. 化学成分:核酸由核苷酸单元组成,单个核苷酸由一个五碳糖(脱氧核糖或核糖)、一个含氮碱基和一个磷酸基团组成。

2. 结构:DNA是由两条互补的链以双螺旋结构排列而成,RNA是以单链形式存在。

DNA的碱基对是按照互补规则特异性配对的,腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)之间有两个氢键相连,鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)之间有三个氢键相连,保持了DNA分子的稳定性。

3. 酸碱性:核酸是一种多酸性物质,可与碱性染料结合。

通过电泳技术可将核酸分离,由于核酸是多酸性的,具有负电荷,在电场中可被迁移,从而实现其分离和纯化。

4. 稳定性:由于DNA中的碱基对通过氢键相连,DNA分子具有较高的稳定性,可在适宜条件下长期储存。

二、核酸的应用:1. 遗传学研究:核酸是遗传物质的重要组成部分,在遗传学研究中发挥着关键作用。

通过对DNA或RNA的序列进行分析,可以揭示生物个体之间的遗传差异,并研究基因与功能的关系。

例如,人类基因组计划(Human Genome Project)使用DNA测序技术对人类整个基因组进行了测序,从而为深入研究人类遗传学奠定了基础。

2. 诊断医学:核酸在疾病诊断中的应用日益重要。

通过PCR(聚合酶链式反应)技术可以在体液或组织中检测到微量的病原体DNA或RNA,从而实现病原体的快速检测和诊断。

例如,在新冠疫情中,核酸检测成为最常用的方法之一。

3. 基因工程:核酸在基因工程领域具有重要应用。

通过将外源DNA或RNA导入细胞中,可以实现基因的插入、删除或替换,从而实现基因改造或修复。

这种技术在生物技术、农业、医学等领域中有着广泛的应用,如转基因作物的培育、基因治疗等。

4. 疾病治疗:核酸药物被广泛应用于疾病的治疗。

2-核酸的性质

2-核酸的性质
Denaturation ▲
D.S DNA
▼ Renaturatio,因为两条链必须依靠随机碰撞找到 一段碱基配对部分,首先形成双螺旋。第二步快得多,尚未配对的其 他部分按碱基配对相结合,象拉拉链一样迅速形成双螺旋。


影响复性的因素
温度变化: 将热变性的DNA骤然冷却时, 由于温度突然降低,单链DNA 分子失去碰撞的机会,因而 DNA不能复性,保持单链变性 的状态,这种过程叫“淬火”
hybridization)。
5
3
5 3


定量、定性测定少量的DNA或RNA。 用紫外分光光度计读出260nm与280nm的OD 值,从A260/A280的比值即可判断样品的纯度。 dsDNA:A260/A280=1.8 RNA:A260/A280= 2.0 pro:A260/A280 < 1
样品中如含有杂蛋白和酚,A260/A280比 值即明显降低。(蛋白质的最大吸收峰在 280nm)

3、核酸的酸解、碱解、酶解

酸解
用稀酸作短时间处理,DNA和RNA都不发生降 解。延长处理时间、提高温度或酸的强度,则会 使部分糖苷键发生水解。 首先是嘌呤碱基被水解下来,同时少数磷酸 二酯键也发生水解,链断裂。继续增加酸浓度或 延长处理时间,可使嘧啶碱基水解下来,核酸降 解程度增加。



A型比较宽,结构更紧密, 主要是RNA和RNA-DNA杂合 体的主要螺旋形式。 Z型的左手螺旋结构在热 力学上看来是不利的,但 是它的不稳定性又为DNA 的解链提供了便利。

稳定双螺旋结构的因素:
①碱基堆积力形成疏水环境(主要因素)。 ②碱基配对的氢键。GC含量越多,越稳定。 ③磷酸基上的负电荷与介质中的阳离子或组蛋白的 正离子之间形成离子键,中和了磷酸基上的负电 荷间的斥力,有助于DNA稳定。 ④碱基处于双螺旋内部的疏水环境中,可免受水溶 性活性小分子的攻击。

第5章核酸的化学 第四节 核酸的性质

第5章核酸的化学 第四节  核酸的性质

食品生物化学
图5-15 RNA紫外吸收曲线
波长nm
食品生物化学
四、核酸的变性与复性
当核酸在某些理化因素(如有机溶剂、酸、碱、尿素、加 热及酰胺等)作用下,互补碱基对间的氢键断裂,双螺旋结构 松散,变成单链的过程称为变性(denaturation)。变性使核酸的 二级结构、三级结构改变,但核苷酸排列顺序不变。变性后的 核酸理化性质改变,生物学活性丧失。
核酸是相对分子质量很大的高分子化合物,高分子溶液比 普通溶液黏度要大得多,高分子形状的不对称性愈大,其黏度 也就愈大,不规则线团分子比球形分子的黏度大,线形分子的 黏度更大。由于DNA分子极为细长,因此即使是极稀的溶液也 有极大的黏度,RNA的黏度要小得多。
二、核酸的酸碱性质
核酸和蛋白质一样,也是两性电解质,在溶液中发生两性 电离。因磷酸基的酸性比碱基的碱性强,故其等电点偏于酸性。 利用核酸的两性解离能进行电泳,在中性或偏碱性溶液中,核 酸常带有负电荷,在外加电场力作用下,向阳极泳动。利用核 酸这一性质,可将相对分子质量不同的核酸分离。
DNA的变性是可逆的。变性DNA在适当条件下,变性的两 条互补链重新结合,恢复原来的双螺旋结构和性质,这个过程 称为复性(renaturation)。热变性的DNA经缓慢冷却(称退火处 理)即可复性。最适宜的复性温度比Tm值约低25℃,这个温度 又叫退火温度。
食品生物化学
图5-16 两种不同来源的DNA在260nm的吸收值与温度变化的关系
食品生物化学
DNA的解链过程发生于一个很窄的温度区内,DNA的变性 过程是爆发式的,有一个相变过程,把A260达到最高值的一半时 对应的温度称为该DNA的解链温度或融解温度,用Tm表示。 Tm值大小与DNA碱基组成有关,由于G-C之间的氢键联系要比 A-T之间的氢键联系强得多,故G+C含量高的DNA其Tm值越高。 通过测定Tm值可知其G+C碱基的含量。

3 核酸性质


离心机示意图
2.2核酸的沉降特性
2.3沉降系数(沉降常数)
概念:指单位离心力场的沉降速度。对于一个特定的分子而 言是一个定值: 沉降速度 S= 沉降系数和 离心加速度 分子量之间 可以进行换 算(沈同、王
镜岩« 生物化学 » 200-204页),
在表示分子 大小时常用 沉降系数表 示。如:
3核酸的紫外吸收 3.1原理 嘌呤和嘧啶碱基含有共轭双键结构,因而核酸有紫外吸收 特性,最大吸收波长为260nm。 3.2分光光度计的原理 光源 待测物质溶液 检测系统
5.2 电泳 带电粒子在电 场中向与自身所 带电荷相反的电 极移动的现象. 移动速度与分 子的大小和形状 等因素有关.
负 极
1 2 3 4 5
正极 介质 缓冲溶液
样品
6核酸的提取
植物基因组DNA提取---CTAB法 1) 称取0.6-0.8克样品,加液氮,迅速研磨成细粉末,转入10毫 升离心管。 2) 向离心管中加入3毫升经65℃预热的提取缓冲液,混匀。 3) 65℃水浴30分钟,其间不时颠倒混匀样品。 4) 4℃,12000rpm离心20分钟,取上清液。 5) 上清液中加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1),颠倒混匀, 12000rpm离心15分钟,取上清液。 6) 上清液中加入2倍体积的-20℃的无水乙醇,轻轻混匀,室温静 置30分钟,可见DNA析出。 7) 用去尖枪头轻轻将白色絮状DNA挑出,放入1。5毫升离心管, 70%乙醇清洗沉淀2次。 8) 沉淀室温干燥,500μL 1×TE充分溶解,无色透明。4℃储存备 用 9) 质量和浓度检测
第三节 核酸的性
1一般物理性质 质 DNA为白色纤维状固体,RNA为白色粉末状固体,都微溶于 水,但钠盐在水中的溶解度较大。不熔于乙醇、乙醚和氯仿等 有机溶剂。两种核蛋白在盐溶液中溶解度不同。 A B C 2沉降特性 2.1离心技术 离心时,大于溶液密度的 组分如细胞碎片、大分子等 向离心管底部移动(沉降)。 由于各组分的分子大小、 形状等不同,造成沉降速度 不同,经过一段时间后不同 组分实现分离。

核酸2


2. 碱水解:
RNA可被碱水解为核苷酸。
DNA对碱具有一定抗性。
RNA的磷酸酯键对碱敏感 室温,0.3-1mol/L KOH,18-24h,可将RNA完
全水解,得到2’-ysis of RNA under alkaline conditions.
3. 酶水解:
定义:
高温、酸、碱及某些变性剂(如尿素等)能破
坏核酸中的氢键,使有规律的双螺旋结构变成单
链的、无规律的线团,此作用称DNA的变性。
•变性不涉及共价键的断裂。 •变性后,核酸紫外吸收值增加,粘度、比旋下降,生物
活性部分或全部丧失。
Stages in the reversible denaturation and renaturation of DNA.
• 核酸酶(nuclease)(特异性地水解核酸)
根据作用方式
核酸内切酶 核酸外切酶
核糖核酸酶 如:牛胰核糖核酸酶( RNaseⅠ)
根据底物 核糖核酸酶T1
脱氧核糖核酸酶 如:牛胰脱氧核糖核酸酶(DNaseⅠ)
牛脾脱氧核糖核酸酶(DNase Ⅱ) 限制性核酸内切酶
An example of nuclease specificity: The specificity of RNA hydrolysis by bovine pancreatic Rnase (RNaseⅠ).
(670nm比色)
(2)二苯胺法定性、定量鉴定DNA: 加热 D-2-脱氧核糖 + 酸 + 二苯胺 冰醋酸,少量浓硫酸
蓝色物质
(595nm比色)
(3)核酸的溴化乙锭(EB)染色: EB是一种荧光染料,可插入核酸相邻碱基对之间。在紫
外灯下,结合EB的核酸呈橙红色荧光。

核酸的性质与研究方法

可见, DNA变性是在一个很窄的温度范围内发生的。通 常将核酸加热变性过程中,紫外光吸收值达到最大值的50% 时的温度称为核酸的解链温度,由于这一现象和结晶的融解 相类似,又称融解温度(Tm,melting temperature)。在Tm 时,核酸分子内50%的双螺旋结构被破坏。特定核酸分子的 Tm值与其G+C所占总碱基数的百分比成正相关,两者的关系
核酸的理化性质
核酸的分离纯化、 测定及研究方法
ห้องสมุดไป่ตู้酸的理化性质
核酸的性质是由其结构决定的。核酸的结构 特点是分子大,有一些可解离的基团,具有共轭 双键等.这些特点决定了核酸及其组分核苷酸性 质的基础.下面介绍几种重要的性质:
一、物理性质
1、性状:RNA及其组分核苷酸、核苷、嘌呤碱、嘧啶碱的纯品都呈白色 的粉末或结晶;DNA则为疏松的石棉一样的纤维状固体。
核酸的磷酸基具有酸性,碱基具有碱性,因此, 核酸具有两性电离的性质。但核酸中磷酸基的酸 性大于碱基的碱性,其等电点偏酸性。DNA的pI约 为4~5,RNA的pI约为2.0~2.5,在pH7~8电泳时 泳向正极。
四、UV吸收 :核酸分子中含有嘌呤碱和嘧啶碱,因而具有紫 外吸收的的性质,在260nm处核酸紫外吸收最强。核酸的紫外 吸收是核酸定量测定的基础。
指经加热变性的DNA在适当条件下,二条互补链全部 或部分恢复到天然双螺旋结构的现象,它是变性的一种 逆转过程。热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性,此过 程称之为退火(annealing)。这一术语也用以描述杂交核 酸分子的形成(见后)。
DNA的复性不仅受温度影响,还受DNA自身特性等其它因 素的影响:
杂交可以发生于DNA与DNA之间,也可以发生于RNA 与RNA之间和DNA与RNA之间。

知识点5核酸的性质

4.5核酸的性质核酸的性质一、解离性质多聚核苷酸有两类可解离的基团:磷酸和碱基能发生两性解离。

磷酸是中等强度的酸,碱基的碱性较弱,因此,核酸等电点在较低的pH范围内。

DNA等电点4—4.5RNA 等电点2—2.5RNA链中,核糖C’2-OH的氢能与磷酸酯中的羟基氧形成氢链,促进磷酸酯羟基氢原子的解离。

二、水解性质1、碱水解室温,0.1mol/LNaOH可将RNA完全水解,得到2’-或3’-磷酸核苷的混合物。

在相同条件下,DNA不被水解。

这是因为RNA中C’2-OH的存在,促进了磷酸酯键的水解。

DNA、RNA水解难易程度的不同具有极为重要的生理意义。

DNA稳定,遗传信息。

RNA是DNA的信使,完成任务后降解。

2、酶水解生物体内存在多种核酸水解酶RNA水解酶RNaseDNA水解酶DNase核酸外一切酶核酸内切酶最重要的:限制性核酸内切酶三、光吸收性碱基具有共轭双键,使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有强烈的光吸收,λmax=260nm1、鉴定纯度纯DNA的A260/A280应为1.8(1.65-1.85),若大于1.8,表示污染了RNA。

纯RNA的A260/A280应为2.0。

若溶液中含有杂蛋白或苯酚,则A260/A280比值明显降低。

2、含量计算1 ABS值相当于:50ug/mL双螺旋DNA或:40ug/mL单螺旋DNA(或RNA)或:20ug/mL核苷酸3、增色效应与减色效应增色效应:在DNA的变性过程中,摩尔吸光系数增大减色效应:在DNA的复性过程中,摩尔吸光系数减小。

四、沉降特性(DNA)不同构象的核酸(线形、环形、超螺旋),起密度和沉降速率不同,用Cs-Cl密度梯度离心就可以将它们区分开来,这一方法常用于质粒DNA的纯化。

相对沉降常数线型双螺旋分子 1.00松驰双链闭环 1.14切刻双链环 1.14单链环 1.14线型单链 1.30正超或负超螺旋双链环状 1.41坍缩 3.0五、变性、复性及杂交变性、复性是核酸的重要的物化性质,相对蛋白质来说,核酸可以耐受反反复复的变性、复性。

  1. 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
  2. 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
  3. 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。

核酸的性质核酸的理化性质及研究方法内容十分庞杂,本节只可能对若干比较重要的核酸理化性质和研究方法作概要叙述。

一、一般物理性质1. 溶解度DNA为白色纤维状固体,RNA为白色粉末状固体,它们都微溶于水,其钠盐在水中的溶解度较大。

它们可溶于2-甲氧乙醇,但不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般有机溶剂,因此,常用乙醇从溶液中沉淀核酸,当乙醇浓度达50%时,DNA就沉淀出来,当乙醇浓度达75%时RNA也沉淀出来。

DNA和RNA在细胞内常与蛋白质结合成核蛋白,两种核蛋白在盐溶液中的溶解度不同,DNA核蛋白难溶于0.14mol/L的NaCl溶液,可溶于高浓度(1~2mol/L)的NaCl溶液,而RNA核蛋白则易溶于0.14mol/L的NaCl溶液,因此常用不同浓度的盐溶液分离两种核蛋白。

2. 分子大小DNA分子极大,分子量在106以上,RNA的分子比DNA分子小得多。

核酸分子的大小可用长度、核苷酸对(或碱基对)数目、沉降系数(S)和分子量等来表示。

3. 形状及粘度核酸(特别是线形DNA)分子极为细长,其直径与长度之比可达1:107,因此核酸溶液的粘度很大,即使是很稀的DNA溶液也有很大的粘度。

RNA溶液的粘度要小得多。

核酸若发生变性或降解,其溶液的粘度降低。

二、核酸的紫外吸收嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键,使碱基、核苷、核苷酸和核酸在240~290nm的紫外波段有一强烈的吸收峰,因此核酸具有紫外吸收特性。

DNA钠盐的紫外吸收在260nm附近有最大吸收值(图3-25),其吸光率(absorbance)以A260表示,A260是核酸的重要性质,在核酸的研究中很有用处。

在230nm处为吸收低谷,RNA钠盐的吸收曲线与DNA无明显区别。

不同核苷酸有不同的吸收特性。

所以可以用紫外分光光度计加以定量及定性测定。

实验室中最常用的是定量测定小量的DNA或RNA。

对待测样品是否纯品可用紫外分光光度计读出260nm与280nm的OD值,因为蛋白质的最大吸收在280nm处,因此从A260/A280的比值即可判断样品的纯度。

纯DNA的A260/A280应为1.8,纯RNA应为2.0。

样品中如含有杂蛋白及苯酚,A260/A280比值即明显降低。

不纯的样品不能用紫外吸收法作定量测定。

对于纯的核酸溶液,测定A260,即可利用核酸的比吸光系数计算溶液中核酸的量,核酸的比吸光系数是指浓度为1μg/mL的核酸水溶液在260nm处的吸光率,天然状态的双链DNA的比吸光系数为0.020,变性DNA和RNA的比吸光系数为0.022。

通常以1OD 值相当于50μg/mL双螺旋DNA,或40μg/mL单螺旋DNA(或RNA),或20μg/mL寡核苷酸计算。

这个方法既快速,又相当准确,而且不会浪费样品。

对于不纯的核酸可以用琼脂糖凝胶电泳分离出区带后,经啡啶溴红染色而粗略地估计其含量。

三、核酸的沉降特性溶液中的核酸分子在引力场中可以下沉。

不同构象的核酸(线形,开环,超螺旋结构)、蛋白质及其他杂质在超离心机的强大引力场中,沉降的速率有很大差异,所以可以用超离心法纯化核酸,或将不同构象的核酸进行分离,也可以测定核酸的沉降常数与分子量。

应用不同介质组成密度梯度进行超离心分离核酸时,效果较好。

RNA分离常用蔗糖梯度。

分离DNA时用得最多的是氯化铯梯度。

氯化铯在水中有很大的溶解度。

可以制成浓度很高(8mol/L)的溶液。

应用啡啶溴红—氯化铯密度梯度平衡超离心,很容易将不同构象的DNA、RNA及蛋白质分开。

这个方法是目前实验室中纯化质粒DNA时最常用的方法。

如果应用垂直转头,当转速为65 000r/min(Beckman L-70超离心机),只要6h即可以完成分离工作。

但是如果采用角转头,转速为45 000r/min时,则需36h。

离心完毕后,离心管中各种成分的分布可以在紫外光照射下显示得一清二楚(图3-26)。

蛋白质漂浮在最上面,RNA沉淀在底部。

超螺旋DNA沉降较快,开环及线形DNA沉降较慢。

用注射针头从离心管侧面在超螺旋DNA 区带部位刺入,收集这一区带的DNA。

用异戊醇抽提收集到的DNA以除去染料,然后透析除CsCl,再用苯酚抽提1~2次,即可用乙醇将DNA沉淀出来。

这样得到的DNA有很高的纯度,可供DNA重组、测定序列及绘制限制酶图谱等。

在少数情况下,需要特别纯的DNA 时,可以将此DNA样品再进行一次氯化铯密度梯度超离心分离。

四、核酸的两性解离及凝胶电泳核酸既含有呈酸性的磷酸基团,又含有呈弱碱性的碱基,故为两性电解质,可发生两性解离。

但磷酸的酸性较强,在核酸中除末端磷酸基团外,所有形成磷酸二酯键的磷酸基团仍可解离出一个H+,其pK为1.5;而嘌呤和嘧啶碱基为含氮杂环,又有各种取代基,既有碱性解离又有酸性解离的性质,解离情况复杂,但总的来看,它们呈弱碱性。

所以,核酸相当于多元酸,具有较强的酸性,当pK>4时,磷酸基团全部解离,呈多阴离子状态。

核酸是具有较强的酸性的两性电解质,其解离状态随溶液的pH而改变。

当核酸分子的酸性解离和碱性解离程度相等,所带的正电荷与负电荷相等,即成为两性离子,此时核酸溶液的pH就称为等电点(isoelectric point, 简称pI)。

核酸的等电点较低,如酵母RNA的pI 为2.0~2.8。

根据核酸在等电点时溶解度最小的性质,把pH调至RNA的等电点,可使RNA 从溶液中沉淀出来。

根据核酸的解离性质,用中性或偏碱性的缓冲液使核酸解离成阴离子,置于电场中便向阳极移动,这就是电泳(electrophoresis)。

凝胶电泳可算是当前核酸研究中最常用的方法了。

它有许多优点:简单、快速、灵敏、成本低。

常用的凝胶电泳有琼脂糖(agarose)凝胶电泳和聚丙烯酰胺(polyacrylamide)凝胶电泳。

可以在水平或垂直的电泳槽中进行。

凝胶电泳兼有分子筛和电泳双重效果,所以分离效率很高。

(一)琼脂糖凝胶电泳以琼脂糖为支持物。

电泳的迁移率决定于以下因素:1. 核酸分子大小迁移率与分子量对数成反比;2. 胶浓度迁移率与胶浓度成反比。

常用1%胶分离DNA;3.DNA的构象一般条件下超螺旋DNA的迁移率最快,线形DNA其次,开环形最慢。

但在胶中加入过多的啡啶溴红时,上述分布次序会发生改变;4.电压一般不大于5V/cm。

在适当的电压差时,迁移率与电流大小成正比;5.碱基组成有一定影响,但影响不大;6.温度4~30℃都可,常在室温。

琼脂糖凝胶电泳常用于分析DNA。

由于琼脂糖制品中往往带有核糖核酸酶(RNase)杂质,所以用于分析RNA时,必须加入蛋白质变性剂,如甲醛等,以使核糖核酸酶变性。

电泳完毕后,将胶在荧光染料啡啶溴红的水溶液中染色(0.5μg/ml)。

啡啶溴红为一扁平分子,很易插入DNA中的碱基对之间。

DNA与啡啶溴红结合后,经紫外光照射,可发射出红—橙色可见荧光。

0.1μgDNA即可用此法检出,所以此法十分灵敏。

可根据荧光强度可以大体判断DNA样品的浓度。

若在同一胶上加一已知浓度的DNA作参考,则所测得的样品浓度更为准确。

可以用灵敏度很高的负片将凝胶上所呈现的电泳图谱在紫外光照射下拍摄下来,作进一步分析与长期保留。

图3-27即为凝胶电泳图谱。

应用凝胶电泳可以正确地测定DNA片段的分子大小。

实用的方法是在同一胶上加一已知分子量的样品(如图3-27中的λDNA/HindⅢ的片段)。

电泳完毕后,经啡啶溴红染色、照相,从照片上比较待测样品中的DNA片段与标准样品中的哪一条带最接近,即可推算出未知样品中各片段的大小。

目前许多试剂公司都能提供各种不同分子量的标准样品。

凝胶上的样品,还可以设法回收,以供进一步研究。

回收的方法很多,可参考其他资料。

最常用的方法是在紫外光照射下将胶上某一区带切割下来,切下的胶条放在透析袋中,装上电泳液,在水平电泳槽中进行电泳,使胶上的DNA释放出来并进一步粘在透析袋内壁上,电泳3~4小时后,将电极倒转,再通电30~60s,粘在壁上的DNA重又释放到缓冲液中。

取出透析袋内的缓冲液(丢弃胶条),用苯酚抽提1~2次,水相用乙醇沉淀。

这样回收的DNA纯度很高,可供进一步进行限制酶分析、序列分析或作末端标记。

回收率在50%以上。

(二)聚丙烯酰胺凝胶电泳以聚丙烯酰胺作支持物。

常用垂直板电泳。

单体丙烯酰胺在加入交联剂后,就成聚丙烯酰胺。

由于这种凝胶的孔径比琼脂糖凝胶的要小,所以可用于分析分子量小于1 000bp的DNA片段。

聚丙烯酰胺中一般不含有RNase,所以可用于RNA的分析。

但仍要留心缓冲液及其他器皿中所带的RNase。

聚丙烯酰胺凝胶上的核酸样品,经啡啶溴红染色,在紫外光照射下,发出的荧光很弱,所以浓度很低的核酸样品不能用此法检测出来。

五、核酸的变性、复性(一)变性变性(denaturation)作用是核酸的重要物化性质。

核酸的变性指核酸双螺旋区的氢键断裂,变成单链的无规则线团,使核酸的某些光学性质和流体力学性质发生改变,有时部分或全部生物活性丧失(图3-28),并不涉及共价键的断裂。

多核苷酸骨架上共价键(3', 5'-磷酸二酯键)的断裂称核酸的降解。

降解引起核酸分子量降低。

当将DNA的稀盐溶液加热到80~100℃时,双螺旋结构即发生解体,两条链分开,形成无规则线团。

一系列物化性质也随之发生改变:粘度降低,浮力密度升高等,同时改变二级结构,有时可以失去部分或全部生物活性。

DNA变性后,由于双螺旋解体,碱基堆积已不存在,藏于螺旋内部的碱基暴露出来,这样就使得变性后的DNA对260nm紫外光的吸光率比变性前明显升高(增加),这种现象称为增色效应(hyperchromic effect)。

常用增色效应跟踪DNA的变性过程,了解DNA的变性程度。

可以引起核酸变性的因素很多,如加热、极端的pH、有机溶剂、酰胺、尿素等。

由温度升高而引起的变性称热变性。

由酸碱度改变引起的变性称酸碱变性。

尿素是用聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定DNA序列常用的变性剂。

甲醛也常用于琼脂糖凝胶电泳法测定RNA的分子大小。

DNA变性的特点是爆发式的。

当病毒或细菌DNA分子的溶液被缓慢加热进行DNA变性时,溶液的紫外吸收值在到达某温度时会突然迅速增加,并在一个很窄的温度范围内达到最高值。

其紫外吸收增加40%,此时DNA变性发生并完成。

DNA热变性时,其紫外吸收值到达总增加值一半时的温度,称为DNA的变性温度。

由于DNA变性过程犹如金属在熔点的熔解,所以DNA的变性温度亦称为该DNA的熔点或熔解温度(melting temperature),用Tm表示。

DNA的Tm值一般在70~85℃之间(图3-29),常在0.15mol/L NaCI,0.015mol/L 柠檬酸三钠(sodium chloride-sodium citrate, SSC)溶液中进行测定。

相关文档
最新文档