RNA的提取及其组分的鉴定
实验4 酵母RNA的分离及组分鉴定
实验4 酵母RNA的分离及组分鉴定酵母RNA是由酵母细胞合成的核糖核酸，包含了酵母细胞的遗传信息，并参与了细胞的生理代谢过程。
本实验旨在通过离心分离和酸性酚/氯仿法提取，纯化酵母RNA，并通过紫外吸收光谱和琼脂糖凝胶电泳等方法对酵母RNA进行组分鉴定。
一、材料与方法1.材料酵母细胞、DTT、Tris、EDTA、NaCl、硝酸、醋酸等。
2.方法1)制备样品a.在液氮中将酵母细胞粉磨成细粉；b.称取10mg酵母细胞粉末加入1ml去离子水中，振荡混匀，制成1mg/ml的酵母细胞悬液。
2)离心分离a.取1ml稀释后的酵母细胞悬液，离心10000rpm/10min，弃去上清液；b.用10μl无菌去离子水重悬沉淀，制成1mg/ml的RNA悬液。
3)RNA的提取和纯化a.取1ml离心沉淀物加入700μl去离子水，混合均匀，加入100μl10%SDS和100μl 酸性酚(pH4.5)混合，振荡15min；b.加入300μl氯仿，振荡混合，离心12,000g/10min；c.取上层水相(约600μl)，加入等量异丙醇混合，振荡；d.离心12,000g/5min，弃去上清液，将胶状RNA沉淀用70%酒精重悬，制成1mg/ml的RNA溶液。
4)鉴定RNAa.测定RNA含量和纯度b.通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA条带。
c.用紫外吸收光谱测定RNA吸收光谱曲线。
5)结果分析a.通过鉴定RNA的吸收峰和电泳图谱来分析RNA组分。
二、实验结果1.酵母RNA提取和纯化效果良好，制得1mg/ml的RNA溶液。
2.根据紫外吸收光谱结果，可以看到RNA在260nm的吸收峰高于280nm，证明纯化后的RNA具有良好的纯度。
3.琼脂糖凝胶电泳显示，RNA溶液中有一个清晰的28S条带和一个模糊的18S条带，证明RNA转录水平较高。
三、讨论和结论通过离心分离和酸性酚/氯仿法提取纯化酵母RNA，可以得到高质量和高纯度的RNA样品。
此外，琼脂糖凝胶电泳和紫外吸收光谱可以对RNA组分和质量进行鉴定，为后续的RNA研究提供了有价值的基础数据。
酵母核糖核酸的分离及组分鉴定实验报告
酵母核糖核酸的分离及组分鉴定实验报告一、实验目的本次实验旨在通过实验方法，对酵母细胞中的核糖核酸进行分离和组分鉴定，了解酵母细胞中核糖核酸的基本特性和组成。
二、实验原理1. 酵母细胞中RNA的基本特性RNA是一种由核苷酸构成的生物大分子，它与DNA类似，但其主要功能是参与蛋白质合成。
RNA包括mRNA、tRNA和rRNA三种类型。
其中mRNA是转录过程中产生的信息分子，tRNA则将氨基酸运输到肽链上进行合成，而rRNA则是构成核糖体的重要组成部分。
2. RNA的提取方法常用的RNA提取方法包括：碱裂解法、有机溶剂提取法、硫酸盐沉淀法等。
其中硫酸盐沉淀法在提取纯度高、效率高等方面表现较好。
3. RNA电泳将提取出来的RNA样品经过琼脂糖凝胶电泳后可以得到不同大小的带状图谱，根据不同大小可以初步判断出样品中含有哪些类型的RNA。
三、实验步骤1. 酵母细胞的培养和收获将酵母菌株接种到含有YPDA培养基的锥形瓶中，在室温下静置培养48小时，直至菌落生长到一定程度。
然后将菌液离心收获，去除上清液。
2. RNA的提取和纯化将离心后的酵母细胞加入10ml Tris-EDTA缓冲液中，加入等体积的酚/氯仿混合液混合均匀，离心分离上清液中的DNA和蛋白质。
再用等体积异丙醇沉淀RNA，在70%乙醇中洗涤，最后用DEPC水重悬RNA。
3. RNA电泳将提取出来的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，经过染色后在紫外线下观察不同大小带状图谱。
四、实验结果与分析通过实验方法得到了纯化后的RNA样品，并进行了琼脂糖凝胶电泳。
实验结果显示，在琼脂糖凝胶电泳中可以看到明显的28S、18S两种大小不同的RNA带，表明样品中含有rRNA和mRNA两种类型的RNA。
五、实验结论通过本次实验，成功地提取出了酵母细胞中的RNA，并进行了琼脂糖凝胶电泳分析。
结果表明，酵母细胞中含有rRNA和mRNA两种类型的RNA。
这为我们深入了解酵母细胞内部核糖核酸的组成和特性提供了基础数据。
酵母RNA的提取及组分鉴定
一、目的与要求 了解RNA提取的原理，掌握RNA组分鉴定的方法
二、实验原理 酵母细胞中所含的核酸主要是RNA,DNA含量很少，故本实验采用酵母提取RNA。由于酵母细胞中所含的核蛋白不溶于水和稀酸，但能溶于稀碱，所以先用稀碱加热煮沸处理，使RNA成为可溶性的钠盐而与酵母中其它的成分分离。然后加乙醇沉淀溶液中的RNA，最后加酸将其完全水解，并用下列方法鉴定其中组分： (一) 钼酸铵试剂与无机磷酸结合生成的磷钼酸易被还原生成钼蓝，以鉴定核酸中的磷。 (二) 3,5-二羟基甲苯与核糖在浓酸中共热呈绿色，以鉴定核糖的存在。 (三) 嘌呤碱与硝酸银共热产生褐色的嘌呤银沉淀，以鉴定嘌呤的存在。
(二) RNA的水解 两管沉淀物中各加入1.5mol/L H2SO4 2.5ml后合并，沸水浴10min，使其充分水解。 (三) RNA组分鉴定（取试管3支编号） 1. 磷酸试验：1号管，取钼酸铵试剂10滴，加RNA水解液10滴摇匀，再加4%维生素C 6滴混匀后，置沸水浴中加热5～10min，观察颜色变化。 2. 核糖试验：2号管，取3,5-二羟基甲苯试剂6滴，加RNA水解液10滴摇匀后，置沸水浴中加热5～10min，观察颜色变化。 3. 嘌呤试验：3号管，取5% AgNO3 10滴，加氨水2-3滴（至沉淀消散后），再加RNA水解液10滴摇匀后，置沸水浴中加热约5～10min，观察颜色变化。
四、结果与计算 管水中加热时要时常摇动试管； (三) 硝酸银中加氨水应逐滴加入，白色沉淀消散后再加水解液。
思考题 1．本实验为什么要选用酵母作为提取RNA的实验原料？ 2．实验过程中酵母细胞为什么要充分研磨？
三、操作步骤 (一) 酵母中RNA的制备 1. 取0.5g干酵母置研钵中，加入0.04mol/L NaOH 4ml，磨3～5min，使其成匀浆； 2. 将酵母匀浆倒入1支大试管中，在沸水中加热30min； 3. 把大试管中匀浆分别放入2支小试管中，配平； 4. 2000r/min离心15min，将两上清液分别倒入另两小试管中，弃去沉淀； 5. 各加3mol/L HAc 2滴，立即摇匀酸化，用石蕊试纸检查。 6. 上述溶液猛力摇匀后，徐徐倒入两支各盛有2.5ml酸性乙醇的试管中，即有白色沉淀析出。 7. 2000r/min离心15min，倾去上清液，作下一步实验。
生化实验 酵母RNA的提取及组分鉴定
酶的特异性及影响酶活性的因素
滴瓶、滴管与细口瓶 生 物 化 学 实 验
1、提出滴头，排出空气。 2、伸入液面下，吸取液体。 3、按量排出液体。 4、将剩余液体排出，放松手指，将滴 头自然放入滴瓶内
Exit
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蛋白质的提取、分离纯化及定量
离心机
生 物 化 学 实 验
⑴将字心机置于平坦结实的地面或实验台上。 ⑵检查离心机调速旋钮是否处在0置 ⑶装入待离心液体后，把离心机转头对称位 置上的离心管（包括外套管）放在天平上平 衡，装入液体量以距管口1--2cm为宜
反应，产生显色复合物。
⑶ 嘌呤碱与硝酸银能产生白色的嘌呤银化合物沉淀。
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酵母RNA的提取及组分鉴定
实验步骤
生 物 化 学 实 验
一、RNA的粗提取：
二、水解RNA
三、RNA组分鉴定
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酵母RNA的提取及组分鉴定
实验步骤
生 物 化 学 实 验
一、RNA的提取 1.7g酵母悬浮于0.2％ 氢氧化钠溶液70ml中。
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酵母RNA的提取及组分鉴定
实验原理
⑵ 核糖：RNA与浓盐酸共热时，发生降解，形成的核
生 物 化 学 实 验
糖继而转变成糠醛，后者与地衣酚反应，在Fe3+或Cu2+催化
下生成鲜绿色复合物。脱氧核糖与二苯胺试剂反应成蓝色
化合物，而核糖无此反应。 地衣酚鉴定戊糖时特异性较差， 凡属戊糖均有此反应。微量DNA无影响，较多DNA存在时有 干扰作用，在试剂中加入适量CuCl2· 2H2O可减少DNA的干扰， 甚至某些戊糖持续加热后生成的羟甲基糠醛也能与地衣酚
实验6酵母RNA的分离及组分鉴定
结果讨论与结论
01
根据分光光度计的读数分析，实验组的RNA浓度较高且纯度良 好，而对照组的RNA浓度较低，可能受到了其他物质的干扰。
02
通过电泳结果观察，实验组的RNA完整性较好，而对照组 的RNA可能受到了降解。
03
综合以上结果，可以得出实验组分离得到的酵母RNA质量较高 ，适合用于后续的分子生物学实验。而对照组的RNA质量较差
条带。
RNA的组分鉴定
01
02
03
将提取的RNA进行反转 录，合成cDNA。
利用PCR仪对cDNA进行 扩增，并进行电泳检测
。
根据电泳结果判断RNA 的完整性，并分析其组
分。
04
结果分析
分光光度计的读数分析
实验组
在260nm和280nm处的吸光度分别 为0.85和0.78，表明RNA浓度较高， 纯度良好。
实验中遇到的问题和解决方案
问题1
解决方案
问题2
酵母细胞破碎不完全， 导致提取的RNA不纯。
采用更剧烈的破碎方法， 如超声破碎，以提高细
胞破碎率。
电泳过程中出现条带模 糊。
解决方案
优化电泳条件，如调整 缓冲液浓度和电泳温度
等。
对实验的改进建议和展望
01
改进建议1
在细胞破碎步骤中，尝试使用不同的破碎方法以提高破碎效率和RNA提
了解RNA的组成成分
了解RNA的基本组成
RNA由核糖核苷酸组成，包括腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿 嘧啶四种碱基，以及磷酸和核糖。
学习通过电泳分离RNA组分
通过电泳技术可以将RNA分离成不同大小的组分，如rRNA 、mRNA和tRNA等。
学习并掌握分光光度计的使用方法
RNA的提取和鉴定
利用高效液相色谱仪检测RNA溶液中的杂质含量，从而评估其纯度。
rna的完整性评估
生物信息学分析
利用生物信息学软件对RNA序列进行 分析，可以评估其完整性。完整的 RNA序列在软件中呈现为一条连续的 线，而降解的RNA则呈现为多个片段。
实时荧光定量PCR
通过实时荧光定量PCR技术检测特定基因的 表达水平，可以间接评估RNA的完整性。 完整的RNA能够更好地逆转录成cDNA，进 而进行PCR扩增，而降解的RNA则会影响 逆转录和PCR扩增的效果。
提取的rna降解
总结词
降解的rna可能无法用于某些实验。
详细描述
如果提取的rna发生了降解，可能会影响其后续的应用，如Northern blot、实时定量 PCR等。为了解决这个问题，可以尝试使用更稳定的提取试剂、优化提取步骤、减少操 作时间等方法。同时，也可以通过电泳或分光光度法检测rna的完整性，以确定其是否
04 rna提取的常见问题及解 决方案
提取的rna浓度过低
总结词
浓度过低可能是由于提取过程中丢失或 降解造成的。
VS
详细描述
在rna提取过程中，如果操作不当或使用 的试剂不适当，可能导致rna的丢失或降 解，从而使得提取的rna浓度过低。为了 解决这个问题，可以尝试增加样本量、优 化提取步骤、使用高质量的试剂等方法。
疾病预防和筛查
通过rna提取和分析，可以发现早期 疾病迹象，为疾病预防和筛查提供 有力手段。
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样本保存
在收集样本后应立即进行rna提取，或 将其保存在适当的介质中短期保存。
细胞裂解和分离
细胞裂解
使用适当的裂解液处理样本，使细胞裂解释放出rna。
实验 酵母RNA的分离及组分鉴定
※实验六酵母RNA的分离及组分鉴定【实验目的】了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。
【实验原理】酵母核酸种RNA含量较多。
RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀。
由此即得到RNA的粗制品。
核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。
加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。
鉴定依据：磷酸与定磷试剂反应产生蓝色物质。
核糖与苔黑酚作用产生绿色物质。
嘌呤碱与硝酸银能产生白色的嘌呤碱银化合物沉淀。
【实验器材】150ml锥形瓶、水浴、量筒、漏斗及抽虑瓶、吸管7、滴管8、试管及试管架9、烧杯、离心机、漏斗【试剂和材料】1、0.04 mol/L氢氧化钠溶液；2、酸性乙醇溶液：将0.3毫升浓盐酸加入30毫升乙醇中；3、95%乙醇；4、乙醚；5、1.5 mol/L硫酸溶液；6、浓氨水；7、0.1 mol/L硝酸银溶液；8、三氯化铁浓盐酸溶液：将2 ml 10%三氯化铁溶液（用FeCl3·6H2O配制）加入到400ml浓盐酸中；9、苔黑酚（地衣酚）乙醇溶液：溶解6 g苔黑酚于100 ml 95%乙醇中（可在冰箱中保存一个月）；10、定磷试剂：（1）17%硫酸溶液：将19ml浓硫酸（比重1.84）缓缓加入到83ml水中（2）2.5%钼酸铵溶液：将2.5 g钼酸铵溶于100 ml水中（3）10%抗坏血酸溶液：10g抗坏血酸溶于100ml水中，贮棕色瓶保存（溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄或棕色则失败，需纯化抗坏血酸）。
临用时将上述3种溶液与水按如下比例混合。
17%硫酸溶液：2.5%钼酸铵溶液：10%抗坏血酸溶液：水=1：1：1：2 (V/V)；11、酵母粉。
【实验操作】1、溶解RNA将5 g酵母悬浮于90 ml 0.04 mol/L氢氧化钠溶液于150 ml锥形瓶中，在沸水浴中加热30分钟，制成碱提取液，将其冷却。
2、解聚RNA将冷却的碱提取液离心（6000ｒ/min）5分钟，将上清液用乙酸调节pH至酸性（pH5~6））缓缓倾入30 ml乙醇溶液中，注意要一边搅拌一边缓缓倾入。
生化技术实验指导书(20学时)
生化技术实验指导书湖北工业大学生物工程学院二0一0年三月修订实验一酵母RNA的提取及其组分的鉴定一、实验目的1.了解稀碱法提取RNA及提取物组分鉴定的基本原理；2. 掌握稀碱法提取RNA及提取物组分鉴定的具体操作方法。
二、实验原理酵母中RNA的含量比较丰富（2.67%~10%），而DNA的含量相对地较少（据资料报道，酵母DNA的含量低于RNA的20%），因此从酵母中提取RNA比较方便。
RNA溶于碱性溶液，碱性溶液使蛋白质带负电荷，促进RNA(带负电荷)与蛋白质的分离，碱性溶液可使酵母细胞壁变性，同时进行加热，可增加细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。
因此，酵母粉用稀碱液加热抽提时，可将其中的RNA抽提出来。
当碱性抽提液中和后，加入2倍体积的95%乙醇时，可以使抽提物沉淀出来。
抽提物的主要成分是RNA的钠盐，并带有少量的蛋白质。
用碱抽提时，RNA会有不同程度的降解。
地衣酚（3，5-二羟基甲苯）是比较灵敏的测定戊糖的试剂，常用于测定RNA。
核糖与地衣酚试剂反应呈现鲜绿色。
地衣酚试剂反应灵敏，也易被其他物质干扰。
DNA中的脱氧核糖也可与地衣酚反应，因此，单靠地衣酚显色实验不能作为RNA 与DNA鉴别依据。
二苯胺试剂是常用于测定DNA中脱氧核糖的试剂，脱氧核糖与二苯胺试剂反应产生蓝色物质，而RNA中的核糖一般不与苯胺起反应。
嘌呤碱可与硝酸银反应生成白色的嘌呤银化合物的沉淀。
双缩脲反应是检验蛋白质常用的颜色反应。
双缩脲或含有两个以上肽键的化合物（蛋白质、肽等）在碱性条件下与硫酸铜反应生成紫红色的配合物。
如果蛋白质含量很低时，此颜色反应不易观察到。
三、试剂与器材1. 试剂：（1）酵母粉（药用）；（2）0.5%NaOH溶液；（3）乙酸；（4）10%硫酸溶液；（5）氨水；（6）5%硝酸银溶液；（7）95%乙醇；（8）地衣酚试剂（硫酸铁铵1.35g，地衣酚2g，用蒸馏水配成50mL作为母液，保存于冰箱中。
使用前，取母液2.5mL，加浓盐酸41.5mL再加蒸馏水60mL）；（9）二苯胺试剂（1.5g二苯胺溶于100mL高纯度的冰醋酸中，再加1.5mL浓硫酸）；（10）10%氢氧化钠溶液；（11）1%硫酸铜溶液。
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四、实验步骤
１、酵母RNA的提取：
取酵母1.0g（3片）、 0.04MNaOH+8ml 研磨匀浆 沸水浴20min 冷却至室温 离心10min（3000r /min） 95%乙醇洗沉淀一次， 离心3min（3000r /min） 收集上清液于50mL烧杯中 无水乙醇洗沉淀一次 加入10mL酸性乙醇沉淀RNA 离心3min（3000r /min） 沉淀即为RNA粗品 转移至10mL 离心管 收集沉淀 离心3min（3000r /min）
2、RNA组分的鉴定
RNA的水解：
用10m1.5mol/L硫酸溶液小心将RNA沉淀洗至试管中，沸水浴 10min，冷却后离心，然后将上清液定容至100mL,分别取1mL至两个 1.5mLEp管中留做定量用,余下做定性分析。
RNA组分的鉴定：
（１）嘌呤碱
取水解液1ml+浓氨水（5滴）+1mlAgNO3，观察嘌呤银化合物 的絮状沉淀。
组分鉴定
RNA在硫酸液中煮沸可水解成核糖、嘌呤碱、嘧啶碱 和磷酸，可分别进行鉴定。
核苷酸
核糖+（嘌呤碱or嘧啶碱）+磷酸
三、材料与试剂
1、酵母 2、0.04mol/L的NaOH溶液 3、酸性乙醇溶液 0.3mL浓盐酸加入到30mL乙醇 中 4、95％乙醇溶液 5、乙醚 6、1.5mol/L硫酸溶液 7、浓氨水 8、0.1mol/L硝酸银溶液 9、三氯化铁浓盐酸溶液 2mL10％三氯化铁加入到 400mL浓盐酸中 10、苔黑酚乙醇溶液 6g苔黑酚溶于100mL95％乙醇（4℃ 保存） 11、定磷试剂 （１）17％的硫酸溶液 （２）2.5％钼酸氨溶液 （３）10％抗坏血酸溶液 （４）蒸馏水 使用时按下比例临时配置（体积比）： 17％的硫酸溶液: 2.5％钼酸氨溶液:10 : ％抗坏血酸溶液:蒸馏水＝1 : 1 : 1 : 2 :
（２）核糖 取0.5ml水解液+0.2ml苔黑酚+2ml三氯化铁盐酸溶液，沸水浴10min， 观察颜色变化（亮绿色） （３）磷酸 取0.2ml水解液+0.8ml水 +1ml定磷试剂 ，沸水浴10min ，观察颜色变 化（蓝色）
五
思考题
１、如何得到高产量的RNA粗品？ ２、本实验RNA组分是什么？怎样验证？
RNA的分离
RNA和DNA分别存在于细胞质和细胞核中，分离提 出核酸，首先要将破碎制成匀浆、使核酸充分提取出来。 酵母核酸中RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，在 碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉 淀。但蛋白质的存在干扰核酸的测定，因此在沉淀中加 入95%乙醇溶液洗涤，以除去蛋白，由此可得到RNA的 粗制品。
酵母核糖核酸的分离及组分鉴定
一、实Байду номын сангаас目的
学习从酵母中提取RNA和鉴定 和鉴定RNA组分的方法。 组分的方法。 学习从酵母中提取 和鉴定 组分的方法
二、原理：
核酸（nucleic acid) 核苷酸(nucleotide)
磷酸(phosphate)
核苷(nucleoside)
核糖 (ribose)
嘌呤（嘧啶）碱 Purine (pyrimidine) base
RNA(ribonucleic acid)背景知识
细胞RNA通常都是单链分子（但病毒RNA双链、环状、 线型等多种形式），由核糖、碱基（A、U、G、C）和磷 酸组成，其种类繁多。目前有许多具有特殊功能的RNA不 断被发现，几乎涉及细胞功能的各个方面，其中参与蛋白 质合成的RNA有三类：转移RNA（transfer RNA）、核糖 体RNA（ribosomal）和信使RNA（messenger RNA）。 研究表明，RNA不仅仅是遗传信息的中间传递体 （from DNA to protein）。RNA的功能总结起来可以分为 以下几类：控制蛋白质的合成；作用于RNA转录后加工与 修饰；基因表达与细胞功能的调节；生物催化与其他细胞 持家功能；遗传信息的加工与进化。