液氮超低温冻结保藏技术规范
液氮储存和使用技术说明
液氮储存和使用技术说明液氮是一种低温制冷剂，通常用于实验室、医疗、食品加工等领域。
其极低的温度能够使很多材料变得脆性，同时还具有杀菌、杀虫等功能。
液氮的储存和使用需要一定的技术，下面就详细介绍一下。
一、液氮的制备和特性液氮的制备主要是利用物理方法降低氮气的温度，使其从气态变为液态。
一般采用制冷机、压缩机等方式制冷，制出的液氮温度约为-196℃。
液氮在环境下快速挥发，由于液态氮的沸点为-196℃，在常温下液氮会迅速转变成气态氮。
同时，液氮没有颜色、没有气味，不能直接感知其存在。
二、液氮储存技术1、储存容器的选择液氮的储存需要用到液氮容器，常用的液氮容器有两种：气化式和球形真空式。
气化式液氮容器是容量较大、适用于长期储存，但使用过程中容器内压力较高，对安全要求比较高。
球形真空式液氮容器是容量较小，通常用于液氮的短期存储和运输。
球形真空式液氮容器在使用时需要放置在平稳的水平面上，并且需要经常保持液氮的液位不低于指示线，以便及时添加液氮。
2、安全使用液氮容器在液氮的储存和使用过程中，必须注意安全。
尤其是在使用气化式液氮容器时，由于容器内压力较高，有可能引起气体泄漏或爆炸等危险。
因此必须严格遵守液氮容器的使用规程，以确保液氮的安全使用。
使用液氮容器时，应按照容器的使用说明进行操作，并确保容器安装在平稳的水平面上。
在加注液氮时，应分多次进行，并等待液氮完全挥发后再进行下一次加注。
加液时应注意缓慢注入，避免过度注入导致液氮外泄。
当液氮容器中的液位下降到规定的安全线时，应及时添加液氮，以保持液位不低于安全线。
3、液氮的储存环境设置液氮的储存环境需要保证干燥、通风和安全。
在室内储存液氮时，应确保通风良好，防止室内液氮浓度过高。
在室外储存液氮时，需要设置合适的防护措施，以防止液氮被紫外线照射并产生过高温度。
此外，还应设置不易被刺激的地方，以防止人员因误操作而受伤。
三、液氮的使用技术1、液氮的安全使用液氮的使用需要注意安全。
整理微生物菌种的冷冻干燥和低温冷冻保藏
精品文档国家自然科技资源平台微生物菌种的冷冻干燥和低温冷冻保藏技术规程（试行）《自然科技资源收集整理保存技术规程研究制定》项目组二00四年十二月十日精品文档目次前言 (2)弓I 言 (3)1范围 (4)2规范性引用文件 (4)3术语和定义 (4)4内容 (5)参考文献 (10)精品文档*»-t-刖言本规程由微生物菌种资源平台建设项目提出。
本规程起草单位：中国农业科学院土壤肥料研究所、中国兽医药品监察所、中国科学院微生物研究所、中国林业科学研究院森林保护研究所、中国药品生物制品检定所、中国医学科学院医药生物技术研究所、中国食品发酵工业研究院。
本规程主要起草人：张月琴、刘红宇、黄明玉、姜瑞波、顾金刚、周宇光、朴春根、叶强、陈敏、程池等。
精品文档精品文档引言微生物菌种资源的长期有效保藏是微生物菌种资源有效实施共享的前提，采用操作性简便、保藏周期长、遗传变异率低是菌种资源保藏方法的首要选择。
精品文档精品文档微生物菌种的冷冻干燥和低温冷冻保藏技术规程1范围本规程规定了冷冻干燥和低温冷冻保藏技术的定义、原理、技术要求、方法与步骤。
本规程适用于普通病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌及担子菌等微生物菌种的保藏。
对于病原微生物及其他需要特殊操作技术的微生物的参见相应的技术规程。
2规范性引用文件下列文件中的条款通过本规范的引用而成为本规范的条款。
凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本规范，然而，鼓励根据本规范达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本规范。
国务院令第424号《病原微生物实验室生物安全管理条例》GB 19489实验室生物安全通用要求科技部自然科技资源平台联合管理办公室文件自然科技资源共性描述规范（试行）3术语和定义下列术语和定义适用于本规范。
3.1冷冻干燥freeze-drying将微生物冷冻，在减压下利用升华作用除去水分，使细胞的生理活动趋于停止，从而长期维持存活状态。
实验室储存液氮的安全操作指南
实验室储存液氮的安全操作指南液氮是一种极低温流体，它的存储和使用需要特殊的安全措施。
液氮的温度可达到零下196摄氏度，因此必须严格遵守以下液氮的安全操作指南，以确保实验室的安全和人员的健康。
一、液氮存储设备及容器选择1. 应选择质量可靠、国家标准认证的液氮储存设备和容器。
储存设备和容器必须能够有效密封，以防止液氮的挥发和泄漏。
2. 储存设备和容器应定期进行检查和维护，确保其完好无损，避免潜在的泄漏和安全隐患。
二、液氮的安全操作1. 个人防护措施a. 使用液氮前，必须戴上绝缘手套、护目镜和长袖衣物，以保护手部和眼睛免受液氮的损伤。
b. 避免直接接触液氮，特别是避免将液氮倒入皮肤或眼睛中，以免造成灼伤。
c. 在操作液氮时，不得穿戴裙子或短裤等暴露部位过多的服装，以免液氮的温度对皮肤造成伤害。
2. 液氮的安全存储a. 液氮储存设备和容器应远离明火和热源，放置在通风良好的地方，以防止液氮的挥发和积聚。
b. 液氮的存储区域应保持干燥，避免存放其他易燃物品，以降低火灾的风险。
c. 液氮容器应放置在稳固的平台上，避免碰撞和翻倒，以免引发液氮泄漏和意外事故。
3. 液氮的使用和操作a. 在需要使用液氮之前，必须经过专业培训和指导，并熟悉相关的安全知识和操作规程。
b. 需要低温条件的实验应尽量在防护屏幕下进行，以减少液氮的波及范围。
c. 在操作液氮时，必须小心轻放容器，避免剧烈摇晃和振荡，以免液氮喷溅或溅射出容器。
d. 操作液氮时，应使用专门的工具和设备，避免直接用手触碰容器，降低操作风险。
e. 操作液氮的区域应明确标识并设置明显的安全警示标识，以提醒工作人员注意安全。
4. 液氮的废弃处理a. 液氮的废弃物必须按照相关规定进行处理，不得随意倾倒或排入污水系统。
b. 液氮容器的废弃处理必须彻底清洗干净，确保液氮完全蒸发，并按照规定的方式进行回收或处置。
三、液氮的紧急处理1. 液氮泄漏a. 发现液氮泄漏时，第一时间通知相关人员，并迅速撤离人员，确保人员的安全。
关于病毒的液氮罐超低温保存法介绍
关于病毒的液氮罐超低温保存法介绍大多数微生物都可以用超低温来保存，超低温保存法是适用范围最广泛的微生物保存法。
需要复杂营养的微生物种，如用其他的贮存方法不能保持其活力（如植物的病原性真菌），通常可用超低温的方法保存（ATCC1983；Halliday，Baker1985）。
此法是将冻存在小管或安瓿里的细胞以较慢的冷冻速率（1℃／分钟）冷冻，直至—150℃，再将这些小管贮存在—150～－196℃的液氮中。
超低温的冷冻保护剂不同于冻干法所用的冷冻剂。
ATCC常用一种由甘油（10％）、二甲亚砜（5％）和培养液制成的混合剂保存多数的细胞株。
这些化学试剂进入细胞内可避免内膜的冷冻损伤。
贮存在低温容器内的细胞复苏时必须小心操作。
当小管被加热时，所形成的冰晶会将细胞杀死，正确操作就可避免这种事故。
只要迅速将样品解冻就能减少活力的丢失，做法是：将封口的小管迅速放入37℃的水中，直至所有的冰融化，然后打开管口，将内容物移入培养基。
超低温保藏的微生物必须始终贮存在温度非常低的环境中，因此需要液氮罐。
在长期贮存的过程中必须经常注意补充液氮。
这种贮存方式比冻干法需要更多的经费，包括为了维持贮存温度所必要的劳动力和液氮等。
1材料病毒超低温保存所需材料有：热收缩塑料管（NuncCryoflex），液氮罐，防护手套和面罩，永久性记号笔，气体喷灯，装液氮的保温瓶。
2方法（1）剪一段两端各超出冷冻管长度2cm的热收缩塑料管。
（2）将含有澄清病毒悬液（组织培养的上清培养基，或组织培养基内的细胞溶解产物均可）冰浴几分钟，用灭菌移液管将0.2ml冰浴过的上清悬液分装到冷冻管内，并将盖子拧紧。
（3）将有病毒的冷冻管放入热收缩塑料管中部，插入正确的标签。
（4）用喷灯小心加热热收缩塑料管，并使之包住冷冻管。
注意不要用太高的温度加热热收缩塑料管。
（5）再小心加热热收缩塑料管的两端，用大号镊子夹紧管的端口至完全密封。
（6）将密封好的冷冻管快速在装有液氮的保温瓶中冷冻（操作时要求戴面罩和手套）。
液氮超低温冻结保藏技术规范
液氮超低温冻结保藏技术规范液氮超低温冻结保藏技术规范1. 目的规范液氮超低温冻结方法保存各类微生物菌种的操作，保证菌种长期保藏的质量和安全。
2. 范围本规程适用于各类微生物菌种的液氮超低温冻结保存。
3. 基本原则和要求针对接收的不同类群的微生物菌种资源，保藏中心应根据工作经验和微生物菌种提供人的建议，选择合适的冻结速度和保护剂系统，进行微生物菌种的液氮超低温冻结保存，以保证这些微生物菌种在长期保藏过程中的活性和稳定性。
4. 规程4.1 准备冻存管4.1.1 用蒸馏水浸泡、冲洗干净耐低温（聚丙烯）塑料冻存管，干燥后备用。
4.1.2 保藏中心应为保存菌种的每一支冻存管标注明确的标识，标签内容应至少包括菌种的保藏编号和制备批号（日期），可将保藏编号排在第一行，制备批号用连续的年月日（八位数字）表示，排在第二行，并根据冻存管的容积将标签裁成合适的大小。
保藏中心应根据标签的放置位置选择符合要求的标签材质，以确保在长期的保藏过程中，标签不会发生自然或人为的脱落、污损。
4.1.2 将准备好的标签放置于冻存管规定的位置，加入或不加入合适体积的保护剂，拧上冻存管帽，装入塑料冻存盒中，1 公斤压力蒸汽灭菌30 分钟，备用。
4.2 准备保护剂根据需要保藏的微生物类别选择适宜的保护剂种类，按照配方配制、分装、灭菌备用。
用于保存厌氧微生物的保护剂，应除去保护剂中的溶解氧。
4.3 菌种保藏4.3.1 无菌操作将符合质量要求的、需要保藏的菌种接种在规定的培养基上，并尽量涂满整个斜面，置最适宜的条件下培养，单细胞微生物菌种培养至对数生长期后期（静止期初期），对于放线菌和产孢丝状真菌应培养至形成成熟的孢子。
对于生物量较低的菌种，应多准备几只斜面菌种。
对于不产孢子的丝状真菌，无菌操作将需要保藏的菌种接种在规定的平板培养基上，培养时间根据菌种的生长速度确定。
4.3.2 用无菌滴管将一定体积的灭菌保护剂无菌操作注入培养好的斜面菌种试管中，并将菌苔（或孢子）轻轻刮下，吹打数次，制成细胞或孢子悬浮液。
液氮锁鲜技术
液氮锁鲜技术液氮锁鲜技术目前，随着人们生活水平的不断提高，对鱼类产品质量的要求也越来越高。
作为鱼类产品的贮藏方法，以冷冻加工为主，但所谓的冷冻产品并不是简单地把鱼类产品放入冷库冻结贮藏即成，而是经超低温冷冻液体生产过程而加工制成的。
在使用—般冷冻库冷冻食品时，由于需要时间长造成食品中的水分结冰时会膨胀、破坏细胞膜。
但是丹东天茂气体生产的鱼类液氮速冻机通过-196的液氮为制冷剂，对水产品进行超低温极速冻结，这种极速冻结保护了细胞膜以及水产品中的各种组织不被破坏，水分子也不会膨胀，更不会导致细胞壁的破裂，而且排列均匀，有效抑制了水产品微生物的生长，让食品在解冻后与冻结前口味一致，新鲜美味。
与其他普通水产品速冻设备相比，丹东天茂气体研发生产的鱼类液氮小型速冻机有着不可相比优势。
1.当液氮与被冻结食物接触时，在-35~-85的超低温状态下，用极短时间使被冻物品通过最大的冰晶生成区。
2.使食物细胞内外的压力达到相对平衡，最大限度地保护被冻物品的细胞组织，保持细胞活性，保证被冻物品的鲜活品质，最大限度保留原营养成分。
减少细胞内水份外析，解冻时汁液流失少。
3.细胞组织内部浓缩溶质和食品组织，胶体以及各种成分相互接触的时间显著缩短，浓缩的危害性下降到最低程度。
4.将食品迅速降低到微生物生长活动温度之下，有利地抵制微生物的增长及其生化反应。
由于采用超低温冷冻技术，所以在产品速冻时能完全有效杀毒灭菌作用。
产品速冻完直接进冷藏库冷藏就可以，也不需要担心食品附带的细菌繁殖破坏食品。
5.解冻后营养物质不流失，保持食品原有的风味、口感和营养价值，甚至在口感上比新鲜食品更胜一筹。
6.一般常规冻结需要4小时以上甚至十几小时，而速冻技术只需几分钟到十几分钟。
7.液氮速冻技术在甲壳纲、全条鱼、贝类，金枪鱼，大黄鱼，龙虾，其它海鲜水产品以及牛肉，羊肉单冻方面有着无可挑剔的优势，真空包装的生鱼片、虾仁也是液冻技术的优势所在，在品质上具有极强的竞争性。
液氮冷冻标准
液氮冷冻标准
液氮冷冻的标准涉及多个方面，以下是部分相关标准：
1. 温度控制：液氮冷冻的关键在于温度的控制。
在冷冻过程中，要保证常温下的小食品在加入液氮后能够迅速降温至-30℃\~-40℃，以达到快速冻结的效果。
2. 冷冻速度：食材从周围进行解冻，厚度或直径为厘米（cm）的食材，中心温度降低到-5摄氏度所需要的时间为小时。
根据此标准，液氮的超低温可以瞬间吸收食材的温度，且极速超速冻结食材，属于超速冻结的一种物理速度技术的操作。
3. 冷冻环境：液氮冷冻需要在特定的环境下进行，以确保安全和有效性。
例如，液氮罐应存放在通风良好的地方，远离火源和易燃物品，以防止意外发生。
需要注意的是，不同的应用领域和具体情况可能会有不同的液氮冷冻标准。
因此，在实际应用中，应根据具体情况制定合适的液氮冷冻标准，并遵循相关规范和操作要求，以确保安全和有效性。
液氮保藏法
液氮保藏法液氮保藏法是目前保存微生物菌种最可靠的方法，多数国家级菌种保藏单位都采用此法。
1准备安培管用于液氮保藏的安培管，要求能耐受温度突然变化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安培管。
安培管的大小通常使用75×10mm的安培瓶。
2加保护剂与灭菌保存细菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的细胞时，则将空安培管塞上棉塞，在压力0.11MPa，温度121℃条件下灭菌15min；若保存霉菌菌丝体则需在安培管内预先加入保护剂，如10%的甘油蒸馏水溶液或10%二甲亚砜蒸馏水溶液，加入量以能浸没以后加入的菌种块为限，而后再进行高压灭菌。
3接入菌种将菌种用10%的甘油蒸馏水溶液制成菌悬液，装入已灭菌的安培管；霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器，从平板内切取菌落圆块，放入含有保护剂的安培管内，然后用火焰熔封。
浸入水中检查有无漏洞。
4冻结再将已封口的安培管以每分钟下降1℃的慢速冻结至－30℃。
若细胞急剧冷冻，则在细胞内会形成冰的结晶，因而降低存活率。
5保藏经冻结至－30℃的安培管立即放入液氮冷冻保藏器的小圆筒内，然后再将小圆筒放入液氮保藏器内。
液氮保藏器内的气相为－150℃，液态氮为－196℃。
6恢复培养保藏的菌种需要用时，将安培管取出，立即放入38～40℃的水浴中进行急剧解冻，直到全部融化为止。
再打开安培管，将内容物移到适宜的培养基上培养。
此法除了适宜于一般微生物的保藏外，对于一些用冷冻干燥法都难以保藏的微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞都可长期保藏，而且不易发生变异。
缺点是需要特殊设备。
关于液氮复苏样品的方法及建议：方法一：准备吸水纸两张，干净毛巾一条。
1.在地面或是桌面上铺两层干净吸水纸。
2.迅速从液氮罐中取出冻存管后，放在吸水纸上（注意一定要将冻存管放到，不要直立起来，因为直立起来的冻存管内液氮很难在短时间内挥发出来，而放平以后，液氮会快速从管缝隙中渗漏出来）3.用干净毛巾罩住冻存管样品（还是为了防止爆炸造成伤害），大约3-5min即可进行后续试验。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
液氮超低温冻结保藏技术规范
1. 目的
规范液氮超低温冻结方法保存各类微生物菌种的操作，保证菌种长期保藏的质量和安全。
2. 范围
本规程适用于各类微生物菌种的液氮超低温冻结保存。
3. 基本原则和要求
针对接收的不同类群的微生物菌种资源，保藏中心应根据工作经验和微生物菌种提供人的建议，选择合适的冻结速度和保护剂系统，进行微生物菌种的液氮超低温冻结保存，以保证这些微生物菌种在长期保藏过程中的活性和稳定性。
4. 规程
4.1 准备冻存管
4.1.1 用蒸馏水浸泡、冲洗干净耐低温（聚丙烯）塑料冻存管，干燥后备用。
4.1.2 保藏中心应为保存菌种的每一支冻存管标注明确的标识，标签内容应至少包括菌种的保藏编号和制备批号（日期），可将保藏编号排在第一行，制备批号用连续的年月日（八位数字）表示，排在第二行，并根据冻存管的容积将标签裁成合适的大小。
保藏中心应根据标签的放置位置选择符合要求的标签材质，以确保在长期的保藏过程中，标签不会发生自然或人为的脱落、污损。
4.1.2 将准备好的标签放置于冻存管规定的位置，加入或不加入合适体积的保护剂，拧上冻存管帽，装入塑料冻存盒中，1 公斤压力蒸汽灭菌30 分钟，备用。
4.2 准备保护剂
根据需要保藏的微生物类别选择适宜的保护剂种类，按照配方配制、分装、灭菌备用。
用于保存厌氧微生物的保护剂，应除去保护剂中的溶解氧。
4.3 菌种保藏
4.3.1 无菌操作将符合质量要求的、需要保藏的菌种接种在规定的培养基上，并尽量涂满整个斜面，置最适宜的条件下培养，单细胞微生物菌种培养至对数生长期后期（静止期初期），对于放线菌和产孢丝状真菌应培养至形成成熟的孢子。
对于生物量较低的菌种，应多准备几只斜面菌种。
对于不产孢子的丝状真菌，无菌操作将需要保藏的菌种接种在规定的平板培养基上，培养时间根据菌种的生长速度确定。
4.3.2 用无菌滴管将一定体积的灭菌保护剂无菌操作注入培养好的斜面菌种试管中，并将菌苔（或孢子）轻轻刮下，吹打数次，制成细胞或孢子悬浮液。
需要液体培养的菌种，离心收集菌体后，制备菌悬液。
4.3.3 核对菌种试管上标注的菌种编号与事先准备好的冻存管标签上标注的菌种编号的一致性。
用无菌滴管将菌悬液分装进冻存管中，拧紧管帽，放入冻存盒中。
4.3.4 对于不产孢子的丝状真菌，用无菌麦管或打孔器将培养好的菌种打成直径约5mm 大小的菌片（也可用无菌解剖刀将培养好的菌种切割成小菌片），用接种针将切割好的菌片分装入准备好的冻存管中（沿菌落半径挑取菌片，每管3-5 片），拧紧管盖。
4.3.5 将装有冻存管的冻存盒放入专门的提篮架中，直接（或经过慢速/梯度降温处理后）放置进指定的液氮生物储罐（液氮冰箱）中，并记录存放位置。
4.4 质量检测
对于保藏的微生物菌种，尤其是新类型的微生物，可在保存24 小时以后，随机取出一只冻存管，按照规定程序，进行恢复培养，检查保藏菌种的存活性、存活率和纯度，记录检查结果。
保藏5 年后，可再随机取出一只冻存管检测存活及存活率，记录检查结果。
4.5 保藏菌种的恢复培养
4.5.1 根据微生物菌种的类别，准备不同温度的水浴，解冻融化保藏的菌种。
细菌、古菌，38℃水浴；真菌（包括酵母菌）：30 水浴℃；对高温敏感的真菌（如Oomycota）选择25℃水浴。
4.5.2 从液氮冰箱中取出菌种时应注意安全防护。
取出菌种之前，应带好防护手套避免人体皮肤触及液氮或超低温箱体；面部应带好防护面罩，以防安瓿管取出后，可能发生的安瓿管内液氮极速气化导致的安瓿管爆炸伤及面部。
4.5.3 从液氮冰箱中取出菌种冻存管后，应立刻放入准备好的水浴中，轻轻摇动，使冻结安瓿管在最短的时间内快速、完全融化。
4.5.4 用70%乙醇脱脂棉球消毒安瓿管外壁。
开启安瓿管，用无菌吸管吸取全部菌悬液（或用接种针移植安瓿管中的菌块），移植于适当的培养基试管（或培养皿）中，在规定的条件下培养。
污染等。