废水中苯酚的降解
焦化废水中苯酚去除效率的研究
收稿日期：２０２００５２５ 修订日期：２０２００６２３基金项目：江苏省大学生创新创业训练计划项目（２０２０１１４６００４９Ｙ）．作者简介：曹晶晶，南京晓庄学院环境科学学院副教授，研究方向：环境监测和修复．Ｅ ｍａｉｌ：ｃｊｊｘｒｘ＠１６３．ｃｏｍ２０２０年１１月第６期南京晓庄学院学报ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＮＡＮＪＩＮＧＸＩＡＯＺＨＵＡＮＧＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＮｏｖ．２０２０Ｎｏ．６焦化废水中苯酚去除效率的研究曹晶晶，李玉洁，常玉广（南京晓庄学院环境科学学院，江苏南京２１１１７１）摘 要：焦化废水含有的苯酚量规模较大，是一种带有高毒性且降解难度较大的有机废水．选取苯酚作为样本污染物，利用高级氧化技术将其进行有效降解，通过单因素实验以及正交实验考察了Ｈ２Ｏ２单独处理时的反应时间及投加量，Ｈ２Ｏ２和硫酸亚铁联用时的不同配比的芬顿试剂及ｐＨ值等因素对苯酚去除率的影响．结果表明：过氧化氢氧化工艺单独处理焦化废水时，降解苯酚的最佳条件为反应时间为１２０ｍｉｎ，Ｈ２Ｏ２投加量达到６ｍＬ／Ｌ时去除焦化废水中苯酚的效果最好，去除率达到４１．４％；Ｈ２Ｏ２和硫酸亚铁联用，当反应时间为１２０ｍｉｎ，ｐＨ值为３，Ｈ２Ｏ２投加量为６ｍＬ／Ｌ，Ｈ２Ｏ２与硫酸亚铁摩尔比为１０∶１时，去除焦化废水中苯酚的效果最好，去除率达到６７．２％．关键词：焦化废水；苯酚；紫外分光光度法；芬顿试剂氧化技术中图分类号：Ｘ５２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００９７９０２（２０２０）０６００５５０４焦化废水产生于煤炼焦、化工产品回收、化工产品精制以及煤气净化等多个生产过程，此类废水所含有的苯酚量规模较大，是一种带有高毒性且降解难度较大的有机废水［１，２］．苯酚作为有机污染物中最典型的一种物质，它所产生的相关衍生物，并且其降解存在较大的难度，所散发的毒性对人类的危害性较高．对这一类废水物质的有效处理直接关系到整个社会物种安全［３］．郭蒙蒙等利用生物接触氧化工艺处理含苯酚废水，发现苯酚降解主要发生在厌氧阶段［４］．杜婷选取活性炭作为催化剂，并且用Ｆｅｎｔｏｎ法进行改良后来处理苯酚废水，结果显示与常规Ｆｅｎｔｏｎ法相比，改良Ｆｅｎｔｏｎ法的效果更佳［５］．国内外大量实验研究［６１１］表明：芬顿试剂是一种高效氧化剂，适用于难降解有机废水的处理．本文选取江苏沙钢集团的焦化废水，通过正交实验，研究过氧化氢氧化、芬顿氧化在不同实验条件下对焦化废水处理过程中苯酚降解效率的影响，并找出苯酚去除率最高的条件．１ 实验部分１．１ 实验仪器和试剂ＵＶ－２１０２ＰＣ型紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；ＰＨＳ－３Ｃ型ｐＨ计（上海精密科学仪器有限公司）．苯酚（中药国医上海化学试剂公司）；质量分数为３０％的过氧化氢（天津市华明镇化学试剂厂）；七水合硫酸亚铁（天津市科密欧化学试剂有限公司）；氯化铵（天津市广成化学试剂有限公司）；氨水（莱阳市康德化工有限公司）；４ 氨基安替比林（国药集团化学试剂有限公司）；铁氰化钾（天津市科密欧化学试剂有限公司）；９８％硫酸（莱阳市康德化工有限公司）．１．２ 实验分析方法１．苯酚含量的测定采用《ＨＪ５０３———２００９水质挥发酚的测定４ 氨基安替比林分光光度法》，通过蒸馏—５５—图１ 苯酚标准曲线法分离出酚类化合物，将酚类化合物与４ 氨基安替比林在ｐＨ值为１０和铁氰化钾存在下反应，制得橙红色安替比林染料．显色后于４６０ｎｍ处测定吸光度．２．绘制标准曲线：取５个５０ｍＬ容量瓶，分别加入２ ００、４．００、６．００、８．００、１０．００ｍｌ苯酚标准溶液，用蒸馏水定容至刻度．在以蒸馏水为基准溶液的１ｃｍ石英皿中，于４６０ｎｍ波长处，测量标准溶液的吸光度，标准曲线如图１．３．试样溶液的测定：用移液管分别取５．００、１０．００、１５ ００ｍＬ三组来自不同车间的焦化废水试样于５０ｍＬ容量瓶配制溶液，测得苯酚含量分别为８６３、８６１、８５８ｍｇ／Ｌ．１．３ 实验设计为了选择最优的降解苯酚的工艺及反应条件，先用过氧化氢单独处理水样，并找出最佳时间和最优过氧化氢投加量．当过氧化氢和硫酸亚铁联用，在单指标实验基础上设计正交实验，从而达到实验目的，找出去除苯酚效率最高的条件．试验参数选取如表１，正交实验设计如表２．由于三组不同车间的焦化废水苯酚含量相近，所以本实验以苯酚含量最高的第七车间的数据进行分析，即苯酚含量初始值为８６３ｍｇ／Ｌ．表１ 实验参数选取因素代表符号１２３反应时间（ｍｉｎ）Ａ６０９０１２０ｐＨＢ３５７摩尔比Ｃ１０∶１１５∶１２０∶１表２ 芬顿法正交实验实验号Ａ时间（ｍｉｎ）ＢｐＨＣ摩尔比实验方案ｌ６０３１０∶１Ａ１Ｂ１Ｃ１２６０５１５∶１Ａ１Ｂ２Ｃ３３６０７２０∶１Ａ１Ｂ３Ｃ３４９０５２０∶１Ａ２Ｂ２Ｃ３５９０７１０∶１Ａ２Ｂ３Ｃ１６９０３１５∶１Ａ２Ｂ１Ｃ２７１２０７１５∶１Ａ３Ｂ３Ｃ２８１２０３２０∶１Ａ３Ｂ１Ｃ３９１２０５１０∶１Ａ３Ｂ２Ｃ１图２ 反应时间对苯酚含量的影响２ 结果与讨论２．１ 过氧化氢单独处理苯酚２．１．１ 反应时间对苯酚含量的影响在室温下，向１０００ｍＬ已知苯酚含量的焦化废水水样中，加入２ｍＬ３０％过氧化氢．放入摇床反应时间分别为１０ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、６０ｍｉｎ、９０ｍｉｎ、１２０ｍｉｎ、１５０ｍｉｎ、１８０ｍｉｎ．Ｈ２Ｏ２单独处理苯酚时，反应时间对苯酚含量的影响如图２．分析图２可知，当反应时间小于１２０ｍｉｎ时，苯酚含量急剧下降，而当反应时间达到１２０ｍｉｎ时，苯酚下降速率趋于平稳．主要原因是Ｈ２Ｏ２具有强氧化性，可以降解待测废水中的苯酚，但与待测废水反应需要时间，当反应时间达到—６５—１２０ｍｉｎ时，苯酚含量趋于平稳，过氧化氢已基本反应完全．Ｈ２Ｏ２单独处理苯酚的最佳反应时间为１２０ｍｉｎ，苯酚去除率达到１３．２％．２．１．２ 过氧化氢投加量对苯酚含量的影响图３ 过氧化氢投加量对苯酚含量的影响在室温下，向１０００ｍＬ已知苯酚含量的焦化废水水样中，加入３０％过氧化氢的量分别为０ｍＬ、１ｍＬ、２ｍＬ、４ｍＬ、６ｍＬ、８ｍＬ、１０ｍＬ，放入摇床震荡１２０ｍｉｎ．过氧化氢单独处理苯酚时，过氧化氢投加量对苯酚含量的影响如图３．分析图３可知，随着Ｈ２Ｏ２投加量的增加，苯酚含量减少，但当投加量达到６ｍＬ／Ｌ时，苯酚含量的变化趋于平缓．主要原因是随着Ｈ２Ｏ２投加量的增加，Ｈ２Ｏ２氧化性增强，使得苯酚含量迅速下降；而当Ｈ２Ｏ２投加量较大，超过６ｍＬ／Ｌ时，苯酚含量趋于平稳，主要原因有两个方面：其一是Ｈ２Ｏ２自身的分解反应会因为投加量的增加而加剧，其二是Ｈ２Ｏ２可以清除自身的羟基．因此，当用Ｈ２Ｏ２单独处理苯酚含量为８６３ｍｇ／Ｌ的焦化废水时，最佳条件为反应时间１２０ｍｉｎ，３０％Ｈ２Ｏ２投加量６ｍＬ／Ｌ，去除率达到４１．４％．２．２ 过氧化氢与硫酸亚铁联用处理苯酚在室温下，向１０００ｍＬ已知苯酚含量的焦化废水水样中投加３０％Ｈ２Ｏ２６ｍＬ／Ｌ，而后分别加入不同质量的硫酸亚铁，Ｈ２Ｏ２与投加的硫酸亚铁的摩尔质量比分别为１０∶１、１５∶１、２０∶１，将焦化废水放入摇床，按表２进行正交试验，结果如表３．表３ 芬顿法正交实验结果实验号Ａ时间（ｍｉｎ）ＢｐＨＣ摩尔比实验方案苯酚含量（ｍｇ／Ｌ）去除率ｌ６０３１０∶１Ａ１Ｂ１Ｃ１３０５６４．７％２６０５１５∶１Ａ１Ｂ２Ｃ２４１３５２．１％３６０７２０∶１Ａ１Ｂ３Ｃ３４６３４６．３％４９０５２０∶１Ａ２Ｂ２Ｃ３３１１６４．０％５９０７１０∶１Ａ２Ｂ３Ｃ１４０３５３．３％６９０３１５∶１Ａ２Ｂ１Ｃ２４１２５２．３％７１２０７１５∶１Ａ３Ｂ３Ｃ２３２１６２．８％８１２０３２０∶１Ａ３Ｂ１Ｃ３３５１５９．３％９１２０５１０∶１Ａ３Ｂ２Ｃ１４２５５０．８％Ｋ１５４．４％５８．８％５６．５％Ｋ２５６．５％５５．６％５５．７％Ｋ３５７．６％５４．１％５６．３％Ｒ３．２％４．７％０．８％由表３可知，Ｈ２Ｏ２与硫酸亚铁联用时，最佳反应条件为反应时间１２０ｍｉｎ，ｐＨ值为３，Ｈ２Ｏ２与硫酸亚铁摩尔比为１０∶１．ｐＨ值的影响程度＞反应时间的影响程度＞过氧化氢与硫酸亚铁的摩尔比的影响程度．主要原因是硫酸亚铁与过氧化氢反应时，能够激发出羟基自由基与待测废水中的有机物反应，羟基自由基的氧化性比Ｈ２Ｏ２更强，所以比过氧化氢更高效；在酸性条件（ｐＨ＝３）时，Ｈ２Ｏ２与硫酸亚铁反应形成的羟基自由基才能最有效地被激发；当硫酸亚铁与过氧化氢的摩尔比为１０∶１时，硫酸亚铁的量足够激发出羟基自由基．根据正交实验得到的最佳反应条件做４组平行实验见表４，苯酚去除率可达到６７．２％．—７５—表４ 优化条件下的平行实验实验号去除率（％）平均值（％）ｌ６７．２２２６７．１７６７．２０３６７．１５４６７．２６３ 结论利用高级氧化技术对含苯酚废水进行有效降解，通过单因素实验以及正交实验考察Ｈ２Ｏ２单独处理时的反应时间及投加量，Ｈ２Ｏ２和硫酸亚铁联用时的不同配比的芬顿试剂及ｐＨ值等因素对苯酚去除率的影响，得出以下结论：１）用过氧化氢氧化工艺单独处理焦化废水时，降解苯酚的最佳条件为反应时间为１２０ｍｉｎ，Ｈ２Ｏ２投加量达到６ｍＬ／Ｌ，此时，苯酚的去除率达到４１．４％．２）在使用Ｈ２Ｏ２最佳投加量（６ｍＬ／Ｌ）的基础上，用苯酚工艺即Ｈ２Ｏ２与硫酸亚铁联用处理焦化废水时，降解苯酚的最佳条件为反应时间为１２０ｍｉｎ，ｐＨ值为３，过氧化氢与硫酸亚铁摩尔比为１０∶１，此时，苯酚的去除率达到６７．２％．参考文献：［１］王宏图．微污染水中苯酚的去除研究［Ｄ］．山东建筑大学，２０１７．［２］郑炎城．芬顿试剂对工业废水苯酚去除效果的影响［Ｊ］．广东化工，２０１４，４１（９）：１７２１７３，１６２．［３］张一鸣．芬顿工艺的影响因素及其在难降解工业废水处理中的应用［Ｊ］．资源节约与环保，２０１５，（１１）：３９４０．［４］郭蒙蒙，戴博文，赵思远，等．ＡＢＲ＋生物接触氧化法处理高浓度有毒有机废水［Ｊ］．工业安全与环保，２０１５，４１（２）：１６１８．［５］杜婷，王三反，陈霞．固体催化改良Ｆｅｎｔｏｎ法处理苯酚废水的研究［Ｊ］．环境科学与技术，２０１２，３５（２）：１５５１６６．［６］李健．高级氧化技术在水处理中的研究进展［Ｊ］．环境与发展．２０１９，３１（２）：９４９５．［７］陈科．微电解 Ｆｅｎｔｏｎ试剂法预处理生物难降解制药废水的实验研究［Ｄ］．南华大学，２０１９．［８］班福忱，李承斌，程琳，等．Ｆｅｎｔｏｎ试剂法处理苯酚废水的研究［Ｊ］．技术与开发，２００９，３８（４）：４７４８．［９］ＮｅｙｅｎｓＥ，ＢａｅｙｅｎｓＪ．ＡｒｅｖｉｅｗｏｆｃｌａｓｓｉｃＦｅｎｔｏｎ ｓＰｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎａｓａｎａｄｖａｎｃｅｄｏｘｉｄａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＨａｚａｒｄｏｕｓＭａｔｅｒｉａｌｓ２００３，９８（１３）：３３５０．［１０］Ｇｏｍｅｚ ＨｅｒｒｅｒｏＥ，Ｌｅｂｉｋ ＥｌＨａｄｉＨ，Ａｉｔ ＡｍａｒＨ，ｅｔａｌ．ＴｈｉａｍｅｔｈｏｘａｍｒｅｍｏｖａｌｂｙＦｅｎｔｏｎａｎｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｏｘｉｄａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０２０，９５（４）：９１３９２１．［１１］ＨｅＤＱ，ＣｈｅｎＪＹ，ＢａｏＢ，ｅｔａｌ．ＯｐｔｉｍｉｚｉｎｇｓｌｕｄｇｅｄｅｗａｔｅｒｉｎｇｗｉｔｈａｃｏｍｂｉｎｅｄｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｒｏｆＦｅｎｔｏｎ ｓｒｅａｇｅｎｔａｎｄｃａｔｉｏｎｉｃｓｕｒ ｆａｃｔａｎｔ［Ｊ］．ＪｏｕｒｎａｌｏｆＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，２０２０，８８（２）：２１３０．（责任编辑：桂 利）ＳｔｕｄｙｏｎＲｅｍｏｖａｌＥｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆＰｈｅｎｏｌｉｎＣｏｋｉｎｇＷａｓｔｅｗａｔｅｒＣＡＯＪｉｎｇ ｊｉｎｇ，ＬＩＹｕ ｊｉｅ，ＣＨＡＮＧＹｕ ｇｕａｎｇ（ＳｃｈｏｏｌｏｆＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＳｃｉｅｎｃｅ，ＮａｎｊｉｎｇＸｉａｏｚｈｕａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１１１７１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｃｏｋｉｎｇｗａｓｔｅｗａｔｅｒｃｏｎｔａｉｎｓａｌａｒｇｅａｍｏｕｎｔｏｆｐｈｅｎｏｌ，ｗｈｉｃｈｉｓａｎｏｒｇａｎｉｃｗａｓｔｅｗａｔｅｒｗｉｔｈｈｉｇｈｔｏｘｉｃｉｔｙａｎｄｇｒｅａｔｄｉｆｆｉｃｕｌｔｙｉｎｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｉｎｔｈｉｓｗｏｒｋ，ａｍｅｔｈｏｄｕｓｉｎｇｔｈｅａｄｖａｎｃｅｄｏｘｉｄａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓｅｓ（ＡＯＰｓ）ｈａｓｂｅｅｎｅｍｐｌｏｙｅｄｔｏｄｅｇｒａｄｅｔｈｅｐｏｌｌｕｔａｎｔｓｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｗｈｅｎｔｈｅｃｏｋｉｎｇｗａｓｔｅｗａｔｅｒｉｓｔｒｅａｔｅｄｂｙｈｙｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅｏｘｉｄａｔｉｏｎｐｒｏｃｅｓｓａｌｏｎｅ，ｂｙｍｏｎｏ ｆａｃｔｏｒ，ｔｈｅｂｅｓｔｒｅａｃｔｉｏｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇｒｅａｃｔｉｏｎｔｉｍｅｏｆ１２０ｍｉｎ，ｈｙｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅｄｏｓａｇｅｏｆ６ｍＬ／Ｌ，ｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｔｈｅｒｅｍｏｖａｌｒａｔｅｒｅａｃｈｅｄ４１．４％．Ｂｙｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ，ｔｈｅｏｐ 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苯酚类废水处理方法
苯酚类废水处理方法苯酚类废水是指含有苯酚及其衍生物的工业废水。
苯酚是一种有毒有害的化学物质，对环境和人体都有一定的危害性。
因此，苯酚类废水的正确处理和处理方法的选择非常重要。
本文将探讨和介绍一些常见的苯酚类废水处理方法。
一、物理处理方法：1.吸附法：利用活性炭等吸附剂将废水中的苯酚吸附，从而实现废水中苯酚的去除。
这种方法对苯酚的去除率较高，但吸附剂的选择和再生都需要考虑。
2.溶解气体浮选法：通过将气体溶解到废水中，然后利用气泡的浮力将苯酚分离出来。
这种方法主要适用于苯酚浓度较高的废水处理。
3.沉降法：使用化学药剂将苯酚与其他杂质反应生成沉淀物，然后通过沉淀物的沉降将苯酚分离出来。
二、化学处理方法：1.氧化法：通过加入氧化剂，如过硫酸氢钾、高氯酸等，将废水中的苯酚氧化成无害的化合物。
这种方法应用广泛，但是需要控制适当的反应条件和氧化剂的浓度。
2.还原法：通过还原剂的作用将废水中的苯酚还原成无害的物质。
常用的还原剂有亚硫酸钠、亚硫酸等。
3.氯化法：利用化学方法将废水中的苯酚进行氯化反应，生成无害的化合物。
但是这种方法需要考虑废水的再处理和氯化副产物的处理问题。
三、生物处理方法：1.厌氧处理法：通过利用厌氧菌对废水中的苯酚进行降解和转化，将苯酚转化成无害的化合物。
这种方法适用于高浓度的苯酚废水处理，但需要提供合适的温度和营养物质，同时需要处理废水的剩余物和菌种的再生。
2.好氧处理法：通过运用好氧菌将废水中的苯酚降解为无害的物质。
好氧生物法适用于低浓度的苯酚废水处理，但处理过程中需要提供足够的氧气和温度。
需要注意的点有以下几个方面：1.废水的处理需遵循环保要求并进行合理配置2.废水处理设备的运行维护保养要及时，以确保设备运转正常3.废水处理过程需要监测废水处理效果，确保废水处理达到排放标准4.废水处理过程需完善的资料记录和备案以备查。
总结起来，苯酚类废水的处理方法涉及到多个领域，并且需要根据实际情况进行选择，综合利用多种处理方法可能是更好的选择。
光催化氧化处理苯酚废水的研究
科 技 天 地60INTELLIGENCETiO 2光催化氧化处理苯酚废水的研究沈阳师范大学 郑志国 李 娜摘 要：本文以为光催化剂，在紫外光的照射下，降解处理低浓度苯酚模拟废水。
考察了温度、pH、流量对苯酚降解过程的影响。
结果表明：当苯酚浓度固定为40mg/L，光催化剂浓度为1.0g/L 时，最佳反应参数是温度60℃，流量120L/h，酸性条件。
关键词：光催化作用 苯酚 二氧化钛一、引言光催化氧化法消除和降解污染物是近年来环境保护技术中的一个研究热点，光催化氧化结构简单、操作条件容易控制、氧化能力强、无二次污染，是一种具有广阔应用前景的水处理技术。
做催化剂的光催化氧化法因其光稳定性好、化学稳定性高、无毒且成本低，己成为目前最引人注目的环境净化材料。
酚类是一种重要的工业原料，广泛应用于化工、杀虫剂、杀菌剂、防腐剂、和造纸等工业，具有恶臭、异味和高度毒性，是重要的有机污染物之一。
本实验用光催化氧化法对苯酚的降解进行了研究。
二、光催化反应设备用于测定催化剂性质及光催化反应动力学的装置如图1所示：图1 光催化氧化反应装置图Fig 1 Chart of photo-catalytic reaction equipment 实验设备技术参数如表1所示。
表1装置技术参数Tab.1 Techno-parameters of the equipment紫外光波长253.5nm 紫外光功率20W紫外光电压220V 循环水方向由下至上循环水泵功率370W 循环水泵电压220V 循环水泵形式自吸式容器体积5L实验过程中，在容器中配置模拟废水(废水体积必须大于照射反应管的有效容积)， 并加入光催化剂（）以及辅助催化剂（）之后，搅拌均匀使粉末处于悬浮状态。
然后打开控制器面板上的电源及循环泵开关，并调节转子流量计的大小，使模拟废水以一定的流速在紫外光处理器与反应容器之间构成循环。
一段时间之后打开紫外灯开关，进行有机物的紫外光催化降解（反应过程中需要更换冷却水浴以控制体系温度）。
超声波／H2O2对苯酚有机废水降解的研究
法能充分发挥其机械 和化学效应 ， 生协 同效 应 ， 而提高 产 从 降解效率。研究较多 的是其和臭氧氧化 、 紫外 、 絮凝、 厌氧生
Ｄ ｇ ａ ａ ｏ ｈ ｎ ｌ ａ ｅ ａｅ ｙＵ ｔａ ｎｃＷａ ｅ Ｈ Ｏ ｅｒｄｔ ｎｏ Ｐ ｅｏ Ｗ ｓ ｗ ｔ ｂ ｌ ｓ ｉ ｉ ｆ ｔ ｒ ｒ ｏ ｖ／ ２ ｚ
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郭 晋君 张治 宏 吴 小 平 张俊 丰
（． １湘潭 大 学 化 工 学 院 湖 南 湘 潭 ４１０ ； ２西 安工 业 大 学 材 料 与 化 工 学 院 １１５ ． ３ 湖 南 省 环境 监 测 中 心 站 ． 长 沙 ４００ ） １０４ 西 安 ７０ ３ ； １０２
摘
要
研 究在 超 声 波 ／ ２ ２ Ｈ ｏ 联合 作 用 下 ， 声 波场 中降 解 苯 酚有 机 废 水 的 过程 。 察 了超 声 功 率 、 声 时 间 、 Ｈ值 、 超 考 超 ｐ 氧
ｐ ｖ ｓｗｉ ｅ ｉｃ ｅ ｓ ｆｒａ ｔ ｎ ｔ ｏ ｒ ｅ ｔ ｔ ｎ ｒａ ｅ ｏ ｃｉ ｉ ｈｈ ｅ ｏ ｍｅ；ｐ ｖ ｌ ｅａ ｅ ｔ ｔｅ ｄ ｇ ａ ａｉｎ ｅ ｃｅ ｃ ｎ ｈ ｎ ｌｉ ａ ｙ ｔ ｅ ｄ ｇ ａ ｅ ｎ ｔｅ ａ ｉ ｏ ｄｔｏ 。 Ｈ ａｕ ｆ ｃ ｓｈ ｅ ｒｄ ｔ ｆ ｉｎ ｙ ａ ｄ ｐ ｅ ｏ ｓｅ ｓ ｏ ｂ ｅ ｒｄ ｉ ｃ ｄｃ ｎ ｉ ｎ ｏ ｉ ｄ ｈ ｉ
化荆 Ｈ０ 的浓度等 因素对降解率的影响。实验结果表明 ， ２２ 超声时 间越 长 。 废水降解 率越 大； Ｈ值 的变化对 降解率影响较 ｐ
高效苯酚降解菌的分离及降解性能的研究
高效苯酚降解菌的分离及降解性能的研究引言石油、化工、煤气、焦化及酚类等生产厂排放的废水当中含有大量的苯酚[1]。
未经净化的含酚废水可导致水源被污染，致使鱼类死亡，危害农作物，最终威胁人类的健康。
许多国家将苯酚列为重要的污染物之一。
目前，国内外处理含酚废水的方法主要有物理法、化学法、微生物法及各种结合法[2]。
其中微生物法主要利用微生物的代谢活动去除废水中的有毒物，处理方法无2次污染且安全、经济。
目前，已鉴定具有降解苯酚能力的微生物主要有假单胞菌（Pseudonomonas.sp）[3]、芽孢杆菌（Bacillus.sp）[4]、酵母菌（Yeast trichosporon）[5]、根瘤菌（Rhizobia）[6]、醋酸钙不动杆菌（A. calcoaceticus）[7]等，降酚菌株多存在于酚类污染物企业排放的废水、污泥和被废水污染的土壤中[8]。
本课题拟从被苯酚废水污染的污泥中进行菌株筛选，得到耐酚菌后在以苯酚为唯一碳源的无机盐培养上筛选降酚菌株，进一步测定苯酚降解的影响因素。
对特定菌株降解含酚废水的应用价值进行研究。
1 实验材料和方法1.1 菌株来源采集原黑龙江省佳木斯东郊黑龙农药化工集团废弃排污口处污泥进行菌株筛选。
1.2 培养基基础培养基：NaCl 5.0g/L，蛋白胨10g/L，琼脂15～20g/L，酵母浸膏5.0g/L，调节pH为7.0。
以苯酚为唯一碳源的无机盐培养基：CaCl2 0.1 g/L ，FeSO4.7H2O 0.01 g/L，K2HPO4 0.5g/L，MnSO4.7H2O 0.05 g/L，NaCl 0.2 g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4.H2O 0.01 g/L，NH4NO3 1.0 g/L苯酚按实验需要量添加，调节pH为7.0 [8]。
富集培养基：葡萄糖10.0g/L，营养琼脂33.0g/L，酵母浸粉10.0g/L，调节pH为7.5。
1.3 研究内容与方法1.3.1 菌株和的驯化和分离在超净工作台中，将10mL含0.1g/L苯酚的基础培养基倒入培养皿，取10 g污泥加90mL蒸馏水搅拌15min，静置5min后取上层清液为菌原液[8]。
水中苯酚处理1
苯酚是造纸、炼焦、炼油、塑料、农药、医药合成等行业生产的原料和中间体。
含酚废水对人类的危害非常严重，因此，研究水中苯酚的去除非常必要。
为进一步提高对苯酚废水的处理效率，近年来，国内外学者苯酚废水的处理做了大量的研究工作，并开发出多种处理方法。
本文详细介绍一种含苯酚废水处理方法——二氧化氯对苯酚废水的处理。
二氧化氯的氧化能力强，是广谱性杀菌消毒剂和优良的漂白剂，可用于工业废水处理[1]。
笔者就二氧化氯对苯酚的氧化性能进行初步探讨，利用稳定的二氧化氯水溶液对苯酚废水进行处理，并确定适宜的处理条件。
1 材料与方法1．1 仪器和试剂仪器：722型可见分光光度计、恒温水浴锅。
试剂：重铬酸钾标准溶液(0．100 0 mol／L)、Na2S2Os溶液(0．101 4mol／L)、20％碘化钾溶液、(1+5)硫酸、二氧化氯储备液(48o．6 mg ／L)、苯酚标准储备液(1．002 9 mg／L)、4一氨基安替比林溶液、缓冲溶液、铁氰化钾溶液、 so4(纯)、蒸馏水。
1．2 试验方法配置苯酚溶液100 mL，反应温度为(25±0．5)℃，加入二氧化氯，在反应不同时间后取样进行分析。
苯酚浓度采用4一氨基安替比林直接光度法测定[2]；二氧化氯浓度的测定采用连续碘量法[3]。
2 结果与讨论2．1 反应时间和初始浓度对苯酚去除率的影响配置不同苯酚初始浓度的水溶液，反应温度为(25±0．5)℃，加入二氧化氯(10 mg／L)，在反应不同时间后取样进行分析，结果如图1所示。
在苯酚初始浓度为4,6 mg／L时，在开始2—3 min，苯酚浓度下降很快，苯酚去除率达到82％左右，而苯酚浓度达到8mg／L时，则在反应6 min时才达到相同驱除率，水溶液中苯酚浓度高时，反应生成中间产物，并且消耗掉一定量的二氧化氯，影响了苯酚的去除。
初始浓度为8 mg／L的苯酚溶液，在反应20 min后，去除率达到93％，这说明二氧化氯用量是决定苯酚去除率的主要因素，也说明对苯酚的去除是十分有效的。
电化学法降解苯酚废水的实验研究
间 、 间距离 、 电极 废水 ｐ Ｈ值 、 废水 电导率 等对苯 酚去除效 果
的影响 ， 确定了最佳 的处理条件 。
１ 电催 化 氧化 有 机 物 原 理
电催化氧化法降解有 机污染物是一个很复杂的过程 ， 其
机理研究还在探索之 中， 有研究 者认为 ， 其原 理是 利用 电极 在电场作用下 ， 分解 Ｈ ０， ２ 产生具 有强 氧化 能力 的羟基 自由 基（Ｏ ・ Ｈ基团 ）从 而使 许多 难 以降解 的有 机污 染物 分解 为 ，
本文应用 自制电化学 反应 器对 废水 中苯酚 的电催化 氧 化【Ｉ］ １４处理进行 了研究 ， 实验了阳极材料 、 电流密度 、 电解 时
电极极板表面做适 当的处理 ， 放人实验装置内。将活性 炭粒子用稀酸浸泡几 分钟 ， 再用 自来水 冲洗 干净 ， 然后充填 于实验装置 内， 加入 待 处理 的模 拟 废水 ， 通 电源 ， 节 电 接 调 压、 电导率及 ｐ Ｈ值等 条件 ， 反应 一定 的时 间后取样 进行分 析 ， 处 理 后 苯 酚 的 残 余 浓 度 和 Ｃ Ｄ、 Ｏ 测 Ｏ Ｔ Ｃ值。用 Ｕ ｖ— Ｖ Ｓ５０紫外可见分 光光度计 于波长 ２０—４０ｎ Ｉ８０ ３ ０ ｍ范 围内作
ｃ２ ｏ 或其他简单化合物 ［ｌ ５。 ２ 实验部分
２ １ 实 验装 置 ．
苯酚降解前后的紫外 光谱 扫描。分别取 未被用作 填充 电极
ｔＴ ｅ。ｄｃ ｎ ｔｅｏ ｔ ｌｔｅｔ ｎ ｏ ｄｔ ｉ ｅｅｍｉｅ ．３ ｅ ｖｌｒｔ ｆｐ ｅｏ ａ ｅｃ ｂ ｖ ８％ ｕ ｄ ｒｓｃ ｏ ｄｔ ｎ ，ｔｅ ．ａｄ ｈ ｐｉ ｍａ ｒａｍｅ ｔｃｎ ｉｏ ｓｄ ｔｒ ｎ ｉ ｎ ｄ ｈｅｒｍｏａ ａｅｏ ｈ ｎｌｅ Ｒｒａｈ ａｏ ｅ９ ｎ ｅ ｕ ｈｃｎ ｉｏ ｓ０ ｈ ｉ ８
污泥中苯酚降解方法
污泥中苯酚降解方法1 引言目前，随着现代工业的不断发展，大量有毒有害废水排入到环境中，苯酚作为树脂制造、炼油、制药、焦碳原料等工业过程中的重要工业原料和产生的一种有机污染物，是工业污水中的主要有害物质，会对动、植物产生有毒甚至致命的危害.苯酚对水生生物具有很强的毒害作用，水体中5~25 mg · L-1的浓度即可对鱼类的生存构成威胁.长期饮用被苯酚污染的水或吸入低浓度酚蒸汽或会引起长期累积性中毒，而饮用高浓度酚溶液、吸入高浓度酚蒸汽则将引起急性中毒，尤其对人体神经系统危害较大.美国环保署把苯酚列入129种优先污染物和65种有毒污染物之列，我国也把苯酚列入中国环境优先处理的污染物“黑名单”之中.因此，去除水体中的苯酚等酚类污染物已成为污水处理的重要课题.降解酚类的方法主要包括吸附法，电化学法和生物降解法等，其中生物降解因投资与运行成本低、二次污染小、处理效率高等优点，因而广泛应用于含酚废水处理.近年来，许多学者在这方面进行了大量的研究，从被酚类物质污染的环境中已分离得到多种降解酚类的微生物菌株，主要有根瘤菌、酵母菌、醋酸钙不动杆菌、假单胞菌、真养产碱菌、反硝化菌、红球菌等.其中，大部分研究主要集中于酵母菌、芽孢杆菌以及假单胞杆菌，对Acinetobacter属的细菌较少报道.生物降解法处理有毒和难降解的工业废水时，一般需要利用生物强化技术来驯化、筛选、诱变和选育高效微生物降解利用有毒有害物质，但工业废水组成成分的动态变化特点易对生物系统造成冲击，使其中的高效降解微生物菌群致死、流失.利用高效降解微生物对苯酚进行生物降解，能有效去除水体中的苯酚，但降解过程的影响因素较多，有必要从诸多影响因素中筛选出最为重要的影响因素，控制生物降解系统能较好的耐受环境冲击并高效运转.由于传统单因素实验不能确定主次因素的差别，而Plackett-Burman实验广泛应用于生物过程重要参数的筛选，通过对实验进行统计学设计和数据分析，筛选出对目标值影响最大的关键因素.响应面分析法(response surface methodology，RSM)是一种优化过程的有效方法，其中的Box-Behnken实验设计法比较常用，可用于确定实验因素及其交互作用在过程中对指标响应值的影响，精确的表述因素与响应值之间的关系.该法与正交设计比较，所需实验组数相对较少，更能直观体现因变量的最佳值.本研究从株洲某化工厂污水处理车间氧化池的活性污泥中筛选分离出一株能高效降解苯酚的细菌菌株YH8，根据其形体特征、生理生化性状、BIOLOG鉴定、16S rDNA和gyrB序列分析进行分类鉴定，研究了该菌株降解苯酚的特性和初步探讨了该菌株降解苯酚的途径，并利用响应面法(RSM)优化菌株YH8降解苯酚的条件以提高降解效率.2 材料与方法2.1 实验材料2.1.1 样品来源从株洲市某化工厂废水处理车间氧化池采集的活性污泥作为筛选降解菌株的样品.2.1.2 培养基种子培养基(LB):每升含酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，NaCl 10 g，pH 7.0~7.2.无机盐培养基(MS):每升含K2HPO4 0.4 g、KH2PO4 0.4 g、NaCl 0.1 g、(NH4)2SO4 0.04 g、MgSO4 · 7H2O 0.1 g、MnSO4 · H2O 0.01 g、Fe2(SO4)3 · H2O 0.01 g、NaMoO4 · 2H2O 0.01 g，加水定容至1000 mL. 选择培养基:在已灭菌的MS培养基中，按浓度要求加入经0.22 μm微孔滤膜过滤的苯酚母液(10 g · L-1水溶液)，pH 7.0.以上固体培养基需加入1.8%的琼脂粉，经121 ℃、20min高压灭菌备用.2.2 实验方法2.2.1 菌株的分离纯化准确称量氧化池活性污泥10 g，加入到装有90 mL三级水的锥形瓶中，30 ℃、200r · mi n-1恒温摇床中振荡培养1 h.将重悬液按2%接种量加入到含苯酚的选择培养基中，苯酚浓度按100、200、500、1000、1200、1500、2000 mg · L-1依次提高以梯度驯化与富集降解菌.经过多次转接培养，梯度稀释培养液并涂布于含苯酚固体选择培养基上，在30 ℃恒温培养箱中倒置培养12 h.挑取菌落形态不同的单菌落接种至LB平板上，反复划线分离纯化得到纯菌株，保存于4 ℃冰箱中备用.2.2.2 降解菌的筛选将保藏的纯化菌株接种至LB平板上，划线分离单菌落.挑取单菌落接种到LB液体培养基中，30 ℃、200 r · min-1振荡培养至OD600为2.0(对数生长期末期).连续活化3代后，用生理盐水将发酵液离心洗涤2次并重悬菌体.以2%接种量接种至选择培养基中，振荡培养并间隔12 h检测培养液中苯酚含量，从中挑选降解苯酚能力最强的菌株.2.2.3 形态特征鉴定肉眼观察降解菌的菌落形状、大小、颜色、透明度、粘稠度、湿润度、隆起和边缘特征及是否产色素等，菌体染色后用高倍显微镜观察菌体革兰氏染色、鞭毛、荚膜、芽孢等结构，利用日立S-3400N型扫描电镜观察菌体大小和表面结构.2.2.4 生理生化特性测定参照文献进行生理生化鉴定，另采用BIOLOG全自动鉴定仪比对代谢指纹进行鉴定.采用添加5 μg · mL-1的抗生素，浓度梯度为50、100、400、500、800、1000、1200、1500、2000mg · L-1的重金属盐的LB培养基培养YH8，检测菌株的相关抗性.2.2.5 16SrDNA基因序列的测定及分子系统发育树的构建细菌基因组DNA采用EasyPure Genomic DNA Kit试剂盒，依据说明书提取.16S rDNA基因序列的获取参照文献.PCR产物经琼脂糖电泳检测纯化，送上海生工进行双向测序并拼接输出全序列，16S rDNA序列用BLAST进行相似性搜索和同源性比对，采用ClustalX 1.8进行序列匹配分析，通过MEGA6.0软件使用邻接法(Neighbor-Joining method)构建系统发育树，利用Bootstrap(1000次重复)检验各分支的置信度.2.2.6 gyrB基因序列的测定及分子系统发育树的构建gyrB基因是普遍存在于细菌中编码促旋酶B亚单位的基因，该基因进化速率快，每100万年的平均碱基替换率为0.7%~0.8%，gyrB基因弥补了非蛋白编码基因16S rDNA无法区分近源种的缺陷.以提取的细菌基因组DNA为模板，采用gyrB的保守引物对UP-1F/UP-2R进行PCR扩增，PCR反应体系及反应步骤参照文献.利用测序引物UP-1S:5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA-3′和UP-2sr: 5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC-3′双向测序并连接，gyrB序列构建系统发育树的方法同上.2.3 优化降解条件经单因素实验确定影响YH8降解苯酚的环境因素.以苯酚降解率为响应值，采用三步法进行苯酚降解的优化.首先，利用Plackett-Burman设计选出对菌株降解苯酚效率影响较大的因素，然后利用最陡爬坡设计逼近最佳区域，最后利用响应曲面法中的Box-Benhnken设计进行实验.通过实验数据拟合响应面模型，最终确定最优降解条件并进行验证.实验数据借助SPSS和Design Expert软件进行分析.2.4 苯酚降解机理的研究2.4.1 细胞粗酶液的提取将筛选到的菌株YH8接种至选择培养基(含1000 mg · L-1苯酚)和LB培养基中，30 ℃、200 r · min-1振荡培养32h，取对数生长期末期菌液50 mL，4 ℃、12000 r · min-1离心10 min，上清液即为胞外粗酶液，于-20 ℃冻存.菌体沉淀用pH 7.0的磷酸缓冲液清洗两次后，重悬于磷酸缓冲液中.在冰浴中，用HUP-400A型超声波细胞破碎仪破碎细胞，超声破碎30 s，间隔30 s，连续处理10 min.于4 ℃、13000 r · min-1离心20 min，上清液即为胞内粗酶液，于-20 ℃冻存.2.4.2 菌株降解苯酚相关基因的PCR扩增以细菌基因组DNA为模板，扩增苯酚羟化酶(LmPH)、邻苯二酚2，3-双加氧酶(C23O)和邻苯二酚1，2-双加氧酶(C12O)基因片段.LmPH引物为Lph:5′-AGGCATCAAGATCACCGACTG-3′;Lph2:5′-CGCCAGAACCATTTATCGATC-3′. C23O引物为C23OF:5′-GGTCTGATYGAAATGGAYCGCGA-3′;C23OR:5′-CGTTCGTTSAGCACCCGGTCGTG-3′. C12O引物为C12OF:5′-CCTGARCBGTHGGYTTT GCNCGTATGGATGA-3′;C12OR: 5′-TCACGRGTW GCRWARGCAAAGTC-3′.上述基因片段扩增体系与16S rDNA基因序列扩增体系相同，LmPH引物的PCR反应程序为:94 ℃预变性5min;94 ℃变性30s，52 ℃退火30s，72 ℃延伸1min，30个循环;72 ℃延伸10min.C12O和C23O的引物的PCR反应程序为:94 ℃预变性3min;94 ℃变性30s，59 ℃退火30s，72 ℃延伸1min，30个循环;72 ℃延伸10min.PCR产物经琼脂糖电泳检测、纯化、测序，测序结果用BLAST软件与Genbank数据库中已收录的基因序列进行同源性比对.2.4.3 质粒的检测与消除采用碱裂解法抽提质粒.质粒消除采用变温-SDS法.采用点接法将单菌落按相同位置接种至LB和选择培养基的平板上，对能在LB平板上生长而不能在选择培养基上生长的菌株进行质粒检测.挑取质粒消除突变菌株利用LmPH和C12O引物进行PCR扩增，检测突变菌株是否存在LmPH和C12O基因.2.5 分析方法2.5.1 细胞浓度的测定采用可见分光光度法在600 nm下测定培养液的吸光度(OD600).2.5.2 苯酚浓度的测定采用4-氨基安替比林直接分光光度法测定苯酚的含量.2.5.3 粗酶液活性测定苯酚羟化酶活性的测定参照文献.分别参考文献检测邻苯二酚1，2-双加氧酶(C12O)和邻苯二酚2，3-双加氧酶(C23O)催化降解邻苯二酚的产物粘糠酸和2-羟基粘糠酸半醛，分别在260 nm和375 nm处有最大吸收峰.C12O和C23O酶活力测定以单位时间内反应产物分别在260 nm和375 nm处吸光度变化表示.反应体系为8.01 mL邻苯二酚、0.39 mL磷酸缓冲液(pH=7.0)和0.6 mL粗酶液，以缓冲液为参比.定义C12O(或C23O)活力单位(U)为25 ℃条件下每分钟反应产生1 μmol产物所需酶量.总蛋白含量用Bradford法测定，具体方法参见全式金Easy ProteinQuantitative Kit试剂盒说明书.酶的比活力以每毫克的蛋白质中所含酶的活力单位数计算.3 结果与讨论3.1 菌株的分离与纯化从活性污泥中分离纯化得到单菌落，划线分离后获得58株苯酚降解菌.通过复筛得到一株苯酚降解能力最强的菌株，命名为YH8.在驯化前，菌株YH8在苯酚浓度为1000 mg · L-1的选择培养基中，经30 ℃、200 r · min-1培养2d可使苯酚降解率达到78.54%.采用梯度浓度驯化后，菌株YH8可在4d内使1200 mg · L-1的苯酚降解89.47%.3.2 菌株的鉴定3.2.1 形态特征鉴定菌株YH8的菌落呈圆形、浅白色、中间隆起、边缘整齐、湿润有光泽、较透明、较粘稠、不产色素.菌株细胞呈短杆状，有荚膜，无鞭毛与芽孢.经扫描电镜观察该菌在LB和选择培养基生长的菌株细胞差异，正常细胞表面较光滑，而苯酚则使该菌细胞表面出现凹陷(图 1~图 2).因苯酚在水溶液水解成酸性，高浓度的苯酚对细胞有一定的毒害作用，故选择培养基中培养的细胞易出现破损等现象.图1 YH8在LB中的扫描电镜图(×20.0 k)图2 YH8在苯酚中的扫描电镜图(×20.0 k)3.2.2 生理生化鉴定菌株YH8生理生化指标如下:革兰氏染色阴性、氧化酶阴性、过氧化氢酶阳性、苯丙氨酸脱氨酶阴性、吲哚实验阴性、淀粉水解阴性、硫化氢阴性、三糖铁阴性、硝酸盐还原阳性、V-P实验阴性、甲基红阴性、明胶液化阳性、纤维素酶阴性，4 ℃可生长，40 ℃不能生长，不具有运动性.将菌株YH8细胞悬浮液接种至BIOLOG GN2板微孔中，培养4h和16h后分别测定菌株代谢指数.经BIOLOG细菌鉴定系统分析，菌株YH8代谢指数与Acinetobacterguillouiae(Acinetobacter genospecies 11)的相似性为94%.重金属抗性实验发现，菌株YH8能在分别添加1.0 g · L-1 Pb2+、1.5 g · L-1 Cr6+、1.8 g · L-1 Cr3+、0.5 g · L-1 Cd2+、1.0 g · L-1 Sb3+、3.0 g · L-1 Mn2+、1.0g · L-1 Cu2+和1.0 g · L-1 Zn2+的LB培养基中正常生长，低于1 g · L-1的Cr3+、Mn2+、Zn2+可促进菌株的生长，而Cd2+、Hg2+、Ag+对菌株的生长有强烈的抑制作用.同样，龚斌从含有一定浓度的Cd2+、Pb2+、Mn2+、Ni2+的酚类废水中筛选到一株具有重金属抗性的假单胞菌JF-10，可用于重金属污染水体的苯酚污染生物修复.药敏实验结果表明菌株YH8能耐受5 μ g · mL-1的氯霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、红霉素，而对四环素、庆大霉素、壮观霉素、头孢噻肟钠和利发霉素敏感.菌株在NaCl浓度为1%~12%的选择培养基中生长，表明菌株YH8可适应较高渗透压的环境.3.2.3 分子生物学鉴定菌株YH8的16S rDNA经PCR扩增得到一条约1.5Kb的DNA片段，测序得到1448bp的序列，其GenBank登录号为KM658327.16S rDNA序列BLAST结果表明，菌株YH8与Acinetobacter guillouiae和Acinetobacter lwoffi的16S rDNA序列具有极高的同源性(99%).构建的16S rDNA序列系统发育树(图 3)表明菌株YH8与多株不动杆菌处在同一个分支.图3 菌株YH8的16S rDNA基因系统发育树经PCR扩增获得一段约1.3 kb的DNA片段，测序得到1182bp的序列，其GenBank登录号为KM658329.gyrB序列BLAST结果表明，菌株YH8与Acinetobacter baylyi的gyrB序列具有很高的同源性(98%)，而与其它菌株gyrB基因相似性均在98%以下，系统发育分析(图 4)表明，菌株YH8与Acinetobacter baylyi同处在一分支.因NCBI数据库中暂未收录Acinetobacterguillouiae的gyrB序列数据，故gyrB基因系统进化树中与YH8同一分支中未出现Acinetobacter guillouiae.综合16S rDNA和gyrB基因序列分析以及菌株形态和生理生化特征，菌株YH8鉴定为Acinetobacter guillouiae.图4 菌株YH8的gyr B基因系统发育树3.3 苯酚代谢途径及相关降解酶特性测定3.3.1 降解酶基因扩增按试剂盒说明从菌株YH8中提取到基因组DNA.分别利用LmPH(Lph1/Lph2)、C12O(C12OF/C12OR)、C23O(C23OF/ C23OR)引物对菌株YH8的基因组DNA进行PCR扩增，结果发现引物LmPH、C12O有明显的扩增产物(图 5)，而C23O引物无明显的扩增产物.将扩增产物测序，获得LmPH基因大小为691 bp的片段，C12O基因大小为359 bp的片段.测序比对结果表明，菌株YH8的LmPH基因序列与登录号为D85083.1的LmPH序列同源性最高，达到97%;该菌株的C12O序列与登录号为Z36909.1的C12O序列同源性最高，达到96%.故证明菌株YH8基因组中包括LmPH和C12O基因.苯酚代谢途径的限速步骤由第一步的苯酚羟化酶的催化决定，自然环境中有单组分和多组分两种苯酚羟化酶，而多组分苯酚羟化酶是自然环境的优势类型(El-Sayed et al., 2014).(谭东徽等，2010)通过染色体步移技术克隆得到总长约为6 kb的苯酚羟化酶基因，其中ORF4(开放阅读框)编码苯酚羟化酶大亚基，与编码产碱杆菌(Alcaligenes sp.)苯酚羟化酶大亚基基因的同源性达到93%，为构建高效基因工程菌提供了一定的理论基础.图5 苯酚羟化酶基因片段和邻苯二酚1，2双加氧酶基因片段的扩增产物3.3.2 降解酶活性测定通过测定菌株YH8粗酶液中LmPH、C12O和C23O的活性，初步判断该菌株YH8降解苯酚的代谢途径.菌株YH8粗酶活性检测(表 1)表明，菌株YH8在LmPH的催化作用将苯酚转化为邻苯二酚，邻苯二酚在C12O的作用下通过邻位开环裂解途径降解.这与运用气质联用仪分析生物滴滤塔处理后的苯酚气体检测到的结果一致，推测苯酚的转化形式也相同.菌体破碎后上清液中LmPH和C12O 的活性远高于未破碎菌体上清液中酶活性，由此可见该酶为胞内酶.以LB培养基为基质的两种上清液均未检测到酶活，而选择培养基中酶活远大于LB培养基中酶活，说明该菌株LmPH和C12O为诱导酶.在研究四溴双酚A(TBBPA)的微生物降解特性时，降解TBBPA的菌株H粗酶液中同样检测到一条明显区别于纯培养菌株的蛋白条带，证明红球菌株H相关降解酶是受TBBP诱导的特异性降解酶.表1 不同基质中苯酚相关降解酶比活力3.3.3质粒检测和消除结果采用全式金transgen Plasmid MiniPrep Kit试剂盒抽提菌株细胞中的质粒，1%琼脂糖凝胶电泳检测出现3条目的条带，说明菌株YH8具有一个5 kb左右的质粒.经变温-SDS法消除质粒后，通过点解法得到只能在LB平板上生长而不能在仅含浓度为1000 mg · L-1 苯酚的MS培养基平板上生长的菌株(图 6)，质粒消除率可达57.73%.经质粒检测，在质粒消除后的突变菌株中未发现质粒.挑取质粒消除突变菌株培养并经PCR扩增检测，无LmPH和C12O基因扩增条带出现(图7).这说明经质粒消除后的菌株不能利用苯酚作为唯一碳源生长，且可初步判定苯酚相关降解基因位于质粒上.结果与对不动杆菌质粒及其特性的研究结果一致.图6 LB(a)与苯酚(b)影印对照O基因扩增结果(a. LmPH，b. C12O)图7 质粒消除前后LmPH和C123.4 菌株YH8生长及对苯酚降解的影响3.4.2 菌株YH8利用苯酚生长和降解苯酚曲线将菌株YH8接种于含1000 mg · L-1 苯酚的MS培养基中，30 ℃、200 r · min-1摇床培养，定时取样测定菌体生长量及选择培养基中的苯酚浓度.结果如图 8所示，YH8菌株的生长同步于对苯酚的降解，且菌株的生长和降解曲线的迟缓期为0~12 h，这一时间段为菌株YH8细胞合成苯酚相关降解酶的诱导期.菌株在12~96 h进入对数期，大约在 96 h最大菌体生长量达到0.71，此时苯酚降解率达到94.52%.图8 菌株YH8利用苯酚生长和降解苯酚曲线3.4.3 环境因素对菌株YH8生长和降解苯酚的影响为了研究不同环境条件下菌株YH8对苯酚的降解情况，选择苯酚浓度、温度、接种量、初始pH、外加碳源、外加氮源5个影响因素作为研究对象，进行单因素实验.实验结果表明菌株YH8在苯酚浓度为1000~1200 mg · L-1时具有较高的降解率，高于1200 mg · L-1时，OD600值和苯酚降解率随苯酚浓度增加而迅速减小.菌株YH8生长和降解苯酚的适宜温度范围为24~32 ℃，在30 ℃时菌株生长量和降解率达到最大，即30 ℃初步确定为最适温度.菌株YH8生长和降解的临界温度为36 ℃，超过该温度，菌株YH8的生长和代谢便基本停止.菌株的最适接种量为5%，而菌株YH8在pH为9.0对苯酚的降解率达到最高.添加山梨醇和NaNO3作为最适外加碳源和外加氮源可有效提高菌体的生长速度和降解率，而王玉芬等(2011)研究发现球形红球菌只有在外加碳源的存在下才能降解氯代苯，而且不同碳源对氯代苯降解的影响变化较大，以苹果酸和乙酸做碳源时的降解效果最好，这可能与球形红球菌在好氧条件下必须通过共代谢才能降解氯代苯有关.3.5 菌株YH8降解苯酚条件的优化3.5.1 PB实验设计及结果采用N=12 Placket-Burman 实验设计研究菌株YH8对苯酚的降解率产生影响的7个因素，每组实验重复3次.11个考察因素及其编码水平见表 2，其实验设计以苯酚降解率为响应值，借助实验设计软件Design Expert 7.1进行数据分析，其结果如表 3所示.通过比较各因素的显著性水平，筛选出对苯酚降解率影响较为显著的因素.表2 Placket-Burman设计各因素与水平从表 3可以看出，实验组5的苯酚降解率最高，达96.68%;实验组9的苯酚降解率最低，为35.78%.将实验数据采用SPSS V19.0拟合后，可得方程为:Y= 71.02-9.87X2-0.91X3+6.33X5+9.56X6+10.23X8+1.44X9-1.69X10式中，X2为苯酚浓度(mg · L-1);X3为接种量(%);X5为NaNO3浓度(%);X6为山梨醇浓度(%);X8为初始pH;X9为温度(℃);X10为培养时间(h);X1、X4、X7、X11为空白变量.表3 Placket-Burman实验设计与结果应用Design Expert软件分析得到模型的p为0.0396，表明所得回归方程较显著，即该模型在被研究的整个回归区域拟合性较好.复系数R2=0.9244，说明相关性较好.校正决定系数AdjR2=0.7921，表明79.21%的实验数据的变异性可用此回归模型来解释.通常情况下变化系数(Cv)越低，实验的可信度和精确度越高，Cv值等于12.85%，表示PB实验的可信度和精确度较好.精密度(Adeq Precision)是有效信号和噪声的比值，大于4.0视为合理，本实验精密度达到9.663.根据回归分析结果(见表 4)，从表 4可知苯酚浓度、山梨醇浓度以及初始pH对苯酚降解率存在显著影响，其中初始pH的p值最小(p=0.0178)，对菌株YH8降解苯酚效率影响最显著，其次是苯酚浓度(p=0.0200)，再次为山梨醇浓度(p=0.0222).其他4个因素，蔗糖浓度，苯酚浓度，温度，培养时间p值均大于0.05，对苯酚降解率没有明显影响.由此，初始pH、苯酚浓度和山梨醇浓度为影响苯酚降解率的关键因素.表4 Placket-Burman实验分析结果3.5.2 最陡爬坡实验设计与分析响应面拟合方程只有考察临近区域时才能充分近似真实情况，所以应先逼近最大苯酚降解率区域后再建立有效的拟合方程.根据Placket-Burman 实验筛选出的3个显著因素估计系数的正负效应，依次增大或减小，其他因素根据估计系数的正负效应分别取PB设计中的最高值和最低值.初始pH和胰蛋白胨浓度对苯酚降解率有显著正效应，应依次增加.而接种量是负效应，应依次减少.其他因素的取值为接种量5%、NaNO3浓度2%、温度30 ℃、培养时间96 h.由表 5数据分析可知，随着初始pH和山梨醇浓度的增加及苯酚浓度的减小，苯酚降解率呈先增大后减小的趋势.当初始pH为9.0，苯酚浓度为1100 mg · L-1，山梨醇浓度为5%时，苯酚降解率达到最大.因此，序号5的实验为最大响应值区域，故以此为中心点进行响应面分析.表5 最陡爬坡实验设计及实验结果分析3.5.3 响应面分析法确定最佳降解条件响应面分析法是一种寻找多因子系统中最佳条件的数学统计方法，其中Box-Behnken和Box-Wilson中心组合设计是两种较常见的响应面分析法(RSA).通过爬坡路径法确定降解条件重要影响因子范围后，以初始pH、苯酚浓度和山梨醇浓度3种因子为自变量，以苯酚降解率为响应值，设计了3因素3水平的响应面分析试验.第13~15次实验为3次重复的中心点实验，用于考察模型的误差.实验设计及结果见表 6.运用Design Expert 软件对15个实验点的响应面值进行回归分析，得二次多项式方程:Y= 98.51-8.04A+6.15B+1.96C+2.89AB+1.82AC+5.80BC-7.45A2-10.07B2-10.80C2式中，Y为苯酚降解率;A、B、C分别为初始pH、苯酚浓度、山梨醇浓度的编码值.相关系数R2=0.9972，说明方程的拟合度很好，可以用该方程进行试验结果预测.表6 Box-Behnken 实验设计及结果预测模型的p值远小于0.0001，说明该模型极显著.结合响应面分析三维图(图 9)，可直观的看出各因素之间的交互作用，各实验各因素对苯酚降解率的影响不是简单的线性关系，且对响应值的影响存在一极值点.图9 菌株YH9各因素及其交互作用的响应面图根据表 7方差分析数据可知，表明对苯酚降解率的影响排序为:初始pH(X2)﹥苯酚浓度(X6)﹥山梨醇浓度(X8).其中，X2、X6、X8、X2X6、X6X8、X22、X26、X28对Y的影响差异极显著，X2X8对Y的影响高度显著.失拟项数值为0.4185，远大于0.05，说明失拟不显著，该模型稳定，可以作为不同因素水平对苯酚降解率影响的预测.根据模型构建的方程进行偏导微分处理，求导得出方程组的3个解:A=9.26，B=1163.63，C=7.81，即:初始pH 9.26、苯酚浓度1163.63 mg · L-1、山梨醇浓度7.81%.此时，YH8菌株对苯酚降解率的最大预测值为99.37%.表7 Box-Behnken 实验回归分析结果3.5.4 验证试验为了验证模型预测的准确性和有效性，按照优化后的苯酚降解条件进行3组平行实验，实际检测苯酚的降解率达到98.95%，实验值与预测值之间具有良好的拟合性，表明回归方程能够比较真实的预测各因素对菌株YH8降解苯酚的影响.降解优化实验组与未优化实验组的结果比较发现，优化后的最佳降解条件可使菌株YH8对苯酚的降解率提高7%左右.等利用响应面法优化实验设计，研究了酵母浸出物、苯酚浓度、接种量3个因素对菌株Candida tropicalis Z-04降解高浓度苯酚效果的影响，拟合多元二次回归方程，并得到最佳降解条件下的实际降解率与预测值高度接近，说明响应面法能有效预测并优化菌株对目标化合物的降解。
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二、试验方法
实验装置图
1、 TiO2光催化降解苯酚溶液的性能验证
在前10h内不加TiO2的光降解速率不高,说明 确是TiO2对降解起到很大的作用。 主要作用原理为:当二氧化钛半导体粒子受到 紫外光的照射时,价带上的电子(e-)被激发跃迁至 导带,在价带上产生空穴(h+),并在电场作用下,分 离并迁移到粒子表面,光生空穴因具有极强的得电 子能力,而具有很强的氧化能力。将其表面吸附的 OH-和H2O分子氧化成OH自由基,而OH几乎无选 择地将有机物氧化,并最终降解为CO2和H2O[2]; 在10~24h内,没加TiO2的光降解率有所提高,这是 因为随着降解时间的延长,在紫外灯照射下溶液中 臭氧浓度渐渐增大,在臭氧的氧化作用下,苯酚被 氧化得以降解。
废水中苯酚的降解
组员：李岚 梁婧怡 张婷 卢兰雪
一、苯酚废水危害
2016/4/16
二、治理方法
• 光催化法 • 沉淀法 • 化剂受到大于禁带宽度能量的光子照 射后，发生电子跃迁，生成光生电子(e一)和空穴对(h+ )，光生电子 具有很强的还原能力，可以还原去除水中的金属离子，而空穴具有 极强的氧化性，可对吸附于其表面的污染物进行直接或间接的氧化 降解，此外，空穴还可以氧化H2O和OH一生成反应性极高的羟基 自由基(· OH)，· OH是一种强氧化剂(氧化还原电位为+2．8V)，它可 以将大多数有机染料氧化为可矿化的最终产物。以本实验中的TiO2 为例。TiO2的带隙能火3.2 eV, 相当于波长为387.5nm 光子能量， 抵达地面太阳能最小波长为300.0nm，300.0～387.5nm 之间的紫 外光能约占太阳能的1%左右。当TiO2受到太阳能辐射后，处于价 带的电子就被激发到导带，价带便生成空穴（h+）。
三、结论
• 在苯酚初始浓度为20mg/L,固液比 2.5g/1000mL,pH为6.3,光照时间为 10h时,苯酚的降解率可达到92.1%。
TiO2光催化降解苯酚溶液的性能验证
2、苯酚降解率与时间的关系
反应2h后,无色液体渐渐变为浅橘 红色;随着反应时间的延长颜色有 所加深,变为橘红色,但6h后颜色基 本不变。
苯酚降解率与时间的关系
3、苯酚降解与pH关系
在pH=6.3时,苯酚降解最好,在 pH值为3~6.3之间,当溶液的pH 值增大时,光催化氧化反应的速 率会呈现出逐渐增大的正比例 变化趋势;但如果pH值增加到一 定值,如pH>9时,在TiO2上的吸 附反应速率反而变小,甚至反应 不明显了。由此可见,在pH值接 近于中性条件时,苯酚的降解速 率最快,降解的效果最好。
• • • • • • • •
光催化反应机理可用以下各式表示： TiO2 +hv(UV) →TiO2(e- + h+ ) TiO2(h+)+ H2O→ TiO2+ H2O+·OH TiO2(h+) + OH一 →TiO2 +·OH 有机染料+· 0H一降解产物 有机染料+h+→氧化产物 有机染料+e一→还原产物 式中hv是将TiO2的电子从价带激发到导带的光子能量。
苯酚降解与pH关系
4、二氧化钛用量对苯酚降解的影响
在50mg/L的苯酚溶液中, 加入光催化剂0.25g时,降 解效果明显较好。
二氧化钛用量对苯酚降解的影响
5、苯酚初始浓度对降解的影响
随着苯酚液浓度的增大, 去除率减小,即随着浓 度的增大,要达到相同 的去除率,需要更长的 反应时间。
苯酚初始浓度对降解的影响