SDS-PAGE,聚丙烯酰胺凝胶电泳详解
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE测定蛋白质分子量
02 实验材料
所需的试剂和溶液
丙烯酰胺（AA）：用于制备凝胶，是聚合反应 的单体。
甲叉双丙烯酰胺（MBA）：交联剂，增加凝胶 的交联度。
N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）：催化剂， 加速交联聚合反应。
所需的试剂和溶液
过硫酸铵（APS）
引发剂，产生自由基，引发聚合反应。
SDS
十二烷基硫酸钠，用于变性蛋白质并促使其 带负电荷。
发展新型分离技术
随着生物技术的不断发展，可以发展新型的蛋白质分离技术， 如二维电泳、毛细管电泳等，以提高蛋白质分离的分辨率和准
确性。
应用多维度分析
在后续实验中，可以将SDS-PAGE与其他蛋白质分析技术相结 合，如质谱技术、免疫学检测等，进行多维度分析，更全面地
了解蛋白质的性质和功能。
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白质带负电荷，从而在电场中向正极移动。
聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质，能够根据蛋白质分子量的不同
03
对其进行分离。
蛋白质的分子量测定
通过比较标准蛋白的迁移率和已知分 子量的标准蛋白，可以大致测定出待 测蛋白质的分子量。
蛋白质的迁移率与其分子量的对数成 反比，因此可以通过计算待测蛋白与 标准蛋白的相对迁移率来推算其分子 量。
甘氨酸
作为分子量标准品。
Tris-HCl缓冲液
维持电泳过程中的pH值稳定。
所需的仪器和设备
电源
为电泳提供电力。
凝胶板
放置凝胶的框架。
垂直电泳槽
提供电泳所需的基 本结构。
移液器
精确添加试剂和溶 液。
紫外透射仪
检测蛋白质条带。
实验前的准备事项
清洗电泳槽和相关器具，确保无残留物。 准备好所需的试剂和溶液，并确保其在有效期内。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）CHANG X C[实验目的]（1）掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。
（2）SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术。
[实验原理]电泳是指带电颗粒在电场的作用下发生迁移的过程。
许多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白质、核苷酸、核酸等都具有可电离基团，它们在某个特定的pH值下可以带正电或负电，在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷极性相反的电极方向移动。
电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。
电泳过程必须在一种支持介质中进行。
最初的支持介质是滤纸、醋酸纤维素膜和硅胶，这些介质适合于分离小分子物质，操作简单、方便。
但对于复杂的生物大分子则分离效果较差。
凝胶作为支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展，使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。
最初使用的凝胶是淀粉凝胶，但目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。
蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE）分为“连续系统”和“不连续系统”两种电泳系统，在本实验中选用不连续系统。
“不连续系统”最大的优点在于大大提高了样品分离的分辨率。
这种电泳的主要特点是：①使用两种不同浓度的凝胶系统；②配制两种凝胶的缓冲溶液成分及pH不同，并且与电泳槽中电泳缓冲液的成分、pH也不相同。
在本实验中，电泳凝胶分为两层：上层胶为低浓度的大孔胶，称为浓缩胶或成层胶，配制此层胶的缓冲液是Tris-HCl，pH6.7；下层胶则是高浓度的小孔胶，称为分离胶或电泳胶，成胶的缓冲液是Tris-HCl，pH8.9；电泳槽中的电极缓冲液则是Tris-甘氨酸，pH8.3。
可见，凝胶浓度、成胶成分、pH与电泳缓冲系统各不相同，形成了一个不连续系统。
实验二聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-PAGE鉴定免疫球蛋白
将制备好的凝胶放入电泳槽，加入电泳缓冲液， 拨除梳子。用微量移液器点样。 5、电泳
样品在浓缩胶时，低电压（60~80V，起始电流不超过10~15mA）， 进入分离胶后，提高电压（100~200V，电流不超过30mA），当 指示剂溴酚蓝前沿距离胶1~2mm，终止电泳。最好在低温下进行。
6、染色与脱色
2、在一塑料盒里加入少量转膜液，将滤纸与胶浸泡 于其中5-10min；PVDF膜浸入甲醇中2min
3、制备“夹心饼”：（膜可比滤纸稍大，防止短路） 提起滤纸平放在盒盖上，用洁净15ml离心管压走多 余的buffer，以不滴水为宜，平铺在半干转印槽上， 再将湿润的膜（实验室统一剪角标记）放在该层滤纸 上；接下来将已切角的胶平铺在膜上，在最上层再铺 上滤纸并压走多余液体。
四肽链结构
所有Ig的基本单位都是四条肽链的对称结构。两条重 链（H）和两条轻链（L）。
三、试剂与器材
1、30%的丙烯酰胺
2、10%SDS 3、TEMED 4、10%过硫酸铵
5、5xSDS-PAGE电泳缓冲液
6、浓缩胶缓冲液（PH6.8）
6.0 g Tris , 48mL 1mol/L HCl,加水至100ml.
4、转膜：（半干转）（PVDF膜0.22UM） 半干转移中，一般恒流（1-1.5mA/cm2，60-90min），
恒压的话15v 60分钟就可以了。 5、关闭电源，用镊子夹取PVDF膜，转移到塑料盒中，加入
5%脱脂奶粉4℃封闭过夜。 6、弃去封闭液，用TBST洗膜3次，每次5min 7、加入一抗，室温平缓摇动2h； 8、废弃液体用TBST洗膜3次，每次5min； 9、加入二抗，室温下孵育1h； 10、废弃液体用TBST洗膜3次，每次5min； 11、显色 在DAB中显色约10-30min，待蛋白质带的颜色
SDS-PAGE,聚丙烯酰胺凝胶电泳详解
SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE
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一、什么是SDS？
十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS) 是一种阴离子去污剂。它在水溶液中以单体 （monomer）和分子团（micellae）的混合形 式存在。
蛋白带迁移距离 Rf= ————————
溴酚蓝迁移距离
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蛋白带迁移距离 固定前的凝胶长度
Rf= ————————— X ————————— 干燥后的凝胶长度 溴酚蓝迁移距离
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2、作图 以已知蛋白质分子量的常用对数值为纵坐
标，Rf为横坐标绘图
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3、通过测定未知蛋白质的Rf值，便可在标 准曲线上读出他的分子量
还原SDS电泳 非还原SDS电泳 带有烷基化作用的还原SDS电泳
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（2）根据缓冲系统和凝胶孔径的不同
连续电泳 不连续电泳
（3）根据电泳的形式
圆盘电泳 垂直电泳
平板电泳 水平电泳
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2、操作 （1） 制备分离胶 （2） 制备积层胶(堆积胶）
当蛋白质的分子量在15KD— 200KD之间时，电泳迁移率与分子量 的对数呈线性关系
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3、影响SDS电泳的关键因素 （1） 溶液中SDS单体浓度（>1mmol/L) 大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1： 1.4 （2） 样品缓冲液的离子强度（不>0.26) 低离子强度的溶液中，SDS单体才具有较 高的平衡浓度。
sds-page蛋白凝胶电泳原理
sds-page蛋白凝胶电泳原理
SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）是一种常用的蛋白质分离
和分析技术。
其原理基于蛋白质的电荷密度和分子质量。
1. SDS（十二烷基硫酸钠）：在SDS-PAGE中，SDS被用作
溶胀剂。
SDS能够与蛋白质中的氢键和疏水作用相互作用，
使蛋白质的二级、三级结构被破坏并线性展开。
SDS与蛋白
质发生作用后，每个蛋白质分子上的SDS数量差不多是相同的，即每个氨基酸上有约2.7个SDS分子。
2. 聚丙烯酰胺凝胶：SDS处理后的蛋白质在凝胶中呈均匀线
性状。
聚丙烯酰胺是一种电泳凝胶，可形成细小的孔隙结构。
这些孔隙可以分离不同分子质量的蛋白质。
3. 电泳过程：在凝胶上形成一个电场，蛋白质带有负电荷，向阳极迁移。
溶胶中的离子也会随之迁移，以维持电中性。
由于SDS已经使蛋白质的结构线性化，其迁移速度主要取决于分
子质量。
较大分子所需的孔隙更大，迁移速度更慢，较小分子则迁移更快。
4. 可视化和测量：分离结束后，可以通过染色剂（如Coomassie Brilliant Blue）将蛋白质染色。
染色剂与蛋白质结合，形成蓝色或紫色的带状条纹，使蛋白质带的位置可见。
在染色后，可以使用图像分析软件测量带的强度和相对迁移距离，从而推断蛋白质的分子质量。
通过SDS-PAGE，可以将不同分子质量的蛋白质分离开来，
并进行定量分析。
它是一种常用的蛋白质研究技术，在生物化学、生命科学和临床诊断等领域得到广泛应用。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳知识讲解
S D S-聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳该技术首先在1967年由Shapiro建立，1969年由Weber和Osborn进一步完善。
一、原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺 (简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条区带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。
SDS是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。
因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。
这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。
由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。
SDS—PAGE 可分为圆盘状和垂直板状、连续系统和不连续系统。
本实验采用垂直板状不连续系统。
所谓“不连续”是指电泳体系由两种或两种以上的缓冲液、pH 和凝胶孔径等所组成。
1．样品的浓缩效应在不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(Tris—Gly，pH8.3)、浓缩胶缓冲液(Tris—HCl，pH6.8)、分离胶缓冲液(Tris—HCl，pH8.8)，两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。
在这种条件下，缓冲系统中的HCl 几乎全部解离成Cl－，两槽中的Gly (pI＝6.0，pK a=9.7)只有很少部分解离成Gly 的负离子，而酸性蛋白质也可解离出负离子。
6-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
8. 接通电源，进行电泳，开始电流恒定在120V，当进 入分离胶后改为180V，溴酚蓝接近凝胶边缘时，停止电泳 9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝 胶板做好标记后放在大培养皿内，加入考马斯亮蓝染色染 色液，染色40分钟左右 10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱 色液脱色，直到蛋白质区带清晰 *剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分 11.实验结果分析
常见问题及解决办法
1.纹理和拖尾现象：由于样品溶解不好引起 的，克服的方法可以在加样前离心，增加一 些增溶辅助试剂如尿素 2.蛋白带过宽，与邻近泳道的蛋白带相连是 由于加样量太多，可以减少上样量 3.电泳时间比正常要长。可能由于凝胶缓冲 系统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓冲 系统地PH和被分离物质的等电点差别用蒸馏水洗净晾干, 准备2 1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干 将玻璃板用蒸馏水洗净晾干 净的小烧杯 2.把玻璃板装入主体，用楔形插板夹紧， 2.把玻璃板装入主体，用楔形插板夹紧， 把玻璃板装入主体 将主体放入制胶器内， 将主体放入制胶器内，旋转手柄夹紧主体
配
分离胶( 分离胶(12% ddH2O 30%Acr Buffer 10%SDS 10%Ap TEMED 3.4ml 4.0ml
（7）10%过硫酸铵(AP) （8）TEMED（四甲基乙二胺） （9）样品溶解液： SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+ 溴酚蓝 （2mg）+甘油（2g）+ 0.05mol/L pH8.0Tris-HCl （2ml），最后定容至10ml。 （11）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上 述固定液250ml，过滤后备用 （12）脱色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水 定容至1000ml （13）电极缓冲液（内含0.1%SDS，0.05mol/LTris0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘 氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容 至1000ml
SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳实验报告
总蛋白质相对分子质量的测定——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法一、实验目的1. 学会SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法原理。
2. 掌握用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子质量的操作技术二、实验原理聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶作为载体的一种区带电泳。
该凝胶由丙烯酰胺(acr)和交联剂N, N-甲叉双丙烯聚酰胺(bis)聚合而成。
聚丙烯酰胺凝胶电泳利用电泳和分子筛的双重作用分离物质。
arc和bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但在具有自由基团体系时就能聚合。
引发自由基团的方法有化学法和光化学法两种。
化学法的引发剂是过硫酸铵Ap，催化剂是四甲基乙二胺(TEMED)；光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸铵，在紫外光照射下引发自由基团。
采用不同浓度的arc, bis, Ap, TEMED使之聚合，产生不同孔径的凝胶。
因此可以按分离物质的大小，形状来选择凝胶浓度。
聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)有圆盘(disc)和垂直板(vertical slab)型之分，但两者的原理完全相同。
由于垂直板型具有板薄，冷却，分辨率高，操作简单，便于比较和扫描等优点，因而为大多数实验室采用。
十二烷基硫酸钠(SDS)是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4g SDS/1g 蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带上了相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质原有的电荷差别。
这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质相对分子质量的对数和迁移率所绘制的标准曲线，可求得未知物的相对分子质量。
三、实验试剂与材料1. 30% Arc-Bis贮存液：30g Arc, 0.8g Bis, 用去离子水定容到100mL，过滤除去不溶性物质，用棕色瓶储存放置在4℃冰箱中。
2. Tris-HCl 1.0M pH=6.8、Tris-HCl 1.5M pH=8.83. 10% 过硫酸铵溶液4. TEMED（商品试剂）5. 2x Sample Loading Buffer：1.52g Tris，20mL甘油，2.0g SDS，2.0mL 2-巯基乙醇，1mg 溴酚蓝，用1M HCl调节pH至6.8，加蒸馏水稀释到100mL.6. 电泳缓冲液(Tris-Glycine缓冲液)：Tris 6.0g，甘氨酸28.8g，SDS 1.0g，用去离子水溶解加入盐酸调节pH=8.3，再定容至1L。
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蛋白质-SDS胶束的特点 （1）形状像一个长椭圆棒 （2）短轴对不同的蛋白质亚基-SDS 胶束基本上是相同的。 （3）长轴的长度则与亚基分子量的大 小成正比。
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胶束在SDS-PAGE系统中的电泳迁 移率不再受蛋白质原有电荷的影响， 而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即 蛋白质或亚基分子量的大小。
当蛋白质的分子量在15KD— 200KD之间时，电泳迁移率与分子量 的对数呈线性关系
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（3） 加样品
样品的处理 在蛋白溶液中加入过量的SDS后，可引起以
下的反应： 蛋白质本身的电荷被屏蔽 氢键断裂 疏水相互作用被取消 多肽被去折叠(二级结构破坏),并形成椭球形
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①还原SDS处理 当加入还原试剂DTT或β-二巯基乙醇后，
蛋白质被完全去折叠，只根据分子量分离。
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（三）凝胶浓度的选择 由于SDS电泳分离并不取决于蛋白
质的电荷密度，只取决于分子解聚后 SDS-蛋白质胶束的大小，因此凝胶浓 度的选择会直接影响分辨率。
不同分子量范围的蛋白质应选用不 同的凝胶浓度.
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（四）分子量测定 1、相对迁移率（Rf） Rf即用每个带的迁移距离除以溴酚蓝 前沿的迁移距离得到的。 测量位置应在蛋白带的中央。
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1、SDS
阴离子去污剂 变性剂 助溶性试剂
断裂分子内和分子间的氢键 分子去折叠 破坏蛋白质分子的二级和三级结构
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2、强还原剂 巯基乙醇（β-mercaptoethanal） 二硫苏糖醇（dithiothreitol，DTT） 使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。
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▪ SDS和还原剂的作用： （1）分子被解聚或组成它们的多肽键 （2）氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负 电荷的蛋白质-SDS胶束。 （3）蛋白质-SDS胶束所带的负电荷大大 超 过了蛋白质分子原有的电荷量，消除 了不同分子之间原有的电荷差异。
蛋白带迁移距离 Rf= ————————
溴酚蓝迁移距离
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蛋白带迁移距离 固定前的凝胶长度 Rf= ————————— X —————————
干燥后的凝胶长度 溴酚蓝迁移距离
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2、作图 以已知蛋白质分子量的常用对数值为纵坐
标，Rf为横坐标绘图
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3、通过测定未知蛋白质的Rf值，便可在标 准曲线上读出他的分子量
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SDS的作用
破坏蛋白质分子之间以及其他物质分 子之间的非共价键，使蛋白质变性而改变 原有的构象，保证蛋白质分子与SDS充分结 合而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。
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二、SDS-PAGE的基本原理
（一）蛋白质分子的解聚 样品介质和聚丙烯酰胺中加入离子
去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的 电泳迁移率主要取决于亚基分子量的 大小，而电荷因素可以被忽略。
（银离子）还原成金属银，以使银颗 粒沉积在蛋白带上。
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（7） 照相，凝胶干燥 （8） 定量测定
55Biblioteka 3、电泳过程中的不正常现象 （1）“微笑”现象 指示剂前沿呈现两边向上的曲线形， 说明凝胶的不均匀冷却，中间部分冷 却不好。
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（2）“皱眉”现象 由于垂直电泳槽的装置不合适引起
的，特别是当凝胶和玻璃板组成的 “三明治”底部有气泡或靠近隔片的 凝胶聚合不完全。
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②带有烷基化作用的还原SDS处理 烷基化作用可以很好地并经久牢固地保护
SH基团，而得到窄的电泳带。
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③非还原的SDS处理 许多样品，如生理体液、血清或尿素，一
般只需用1%SDS在100℃煮沸3分钟，并不 需要加还原剂，此时二硫键不能被断裂，蛋 白并没有完全被去折叠。
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（4） 电泳 （5） 固定
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（6） 染色 考马斯亮蓝（coomassie brilliant blue） ①R-250 三苯基甲烷，红蓝色，每个分子含 有两个SO3H基团，偏酸性，和氨基黑 一样也是结合在蛋白质的碱性基团上。
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②G-250 二甲花青亮蓝，蓝绿色。
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银染色 银染的机制是将蛋白带上的硝酸银
还原SDS电泳 非还原SDS电泳 带有烷基化作用的还原SDS电泳
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（2）根据缓冲系统和凝胶孔径的不同
连续电泳 不连续电泳
（3）根据电泳的形式
圆盘电泳 垂直电泳
平板电泳 水平电泳
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2、操作 （1） 制备分离胶 （2） 制备积层胶(堆积胶）
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分离胶聚合之后
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis， SDS-PAGE
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一、什么是SDS？
十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS) 是一种阴离子去污剂。它在水溶液中以单体 （monomer）和分子团（micellae）的混合形 式存在。
子才能被解聚，SDS才能定量地结合 到亚基上而给出相对迁移率和分子量 对数的线性关系。
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（二）缓冲系统的选择 一般情况下，在被分析的蛋白质稳
定的pH范围，凡不与SDS发生相互作 用的缓冲液都可以使用，但缓冲液的 选择对蛋白质的分离和电泳的速度是 非常关键的。
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电泳缓冲液的种类： 1、磷酸缓冲液 2、Tris-醋酸钠缓冲系统 3、咪唑缓冲液系统： 比磷酸缓冲系统的导电性低，电泳速 度要比后者快一倍。 4、尿素系统： 适用分子量低于15KD的蛋白样品。 5、Tris-甘氨酸系统： 使用最多的缓冲液 6、Tris-硼酸盐缓冲液： 测定糖蛋白的分子量
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三、去污剂的选择 无离子去污剂：Lubro W；Brij35， Tween Triton 阳离子去污剂：cetyltrimethyl ammonium bromide （CTAB） cetylpyyridinium （CPC） 阴离子去污剂：SDS deoxycholate
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四、方法 1、分类 （1）根据对样品的处理方式的不同
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3、影响SDS电泳的关键因素 （1） 溶液中SDS单体浓度（>1mmol/L) 大多数蛋白质与SDS结合的重量比为1： 1.4 （2） 样品缓冲液的离子强度（不>0.26) 低离子强度的溶液中，SDS单体才具有较 高的平衡浓度。
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（3） 二硫键是否完全被还原 当二硫键被彻底还原后，蛋白质分