分生作业

分生作业1一、名词解释1. 断裂基因: 基因是核酸分子中贮存遗传信息的遗传单位，一个基因不仅仅包括编码蛋白质或RNA 的核酸序列，还包括保证转录所必需的调控序列、位于编码区5 ' 端与 3 ' 端的非编码序列和内含子。

真核生物的结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因（split gene）。

2. 单核苷酸多态性：主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。

它是人类可遗传的变异中最常见的一种。

占所有已知多态性的90%以上。

SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。

二、简答题1. 简述真核生物基因组的结构与功能特点。

答：（1）真核生物细胞核基因组的结构和功能。

①：真核生物基因组存在大量的重复序列a) 单拷贝序列（低度重复序列）b) 中度重复序列c) 高度重复序列d) 重复序列的多态性：主要包括单核苷酸多态性和串联重复序列多态性②：真核基因组存在多基因家族和假基因多基因家族：是指由某一祖先基因经过重复和变异所产生的一组基因。

假基因：是指与某些有功能基因结构相似，但不能表达有功能基因产物的某些基因。

（2）真核生物细胞器基因组的结构和功能真核生物有两类细胞器能携带遗传物质：线粒体和叶绿体大多数细胞器基因组是环状DNA，某些低等真核生物（如草履虫、衣滴虫和几种酵母）的线粒体DNA是线状分子。

线粒体基因组的大小差异比较大，从1万至数百万bp不等。

高等动物线粒体基因组具有独特的特点：母系遗传；线粒体DNA损伤后不易修复，突变率高，可能与衰老及某些疾病有关；遗传密码与通用遗传密码存在差别。

2. 试述双向凝胶电泳技术的基本原理。

答：蛋白质组研究的发展以双向电泳技术（2-DE）作为核心。

原理简明：是利用蛋白质的带点性和分子量大小的差异，通过两次凝胶电泳达到分离蛋白质的技术。

第一向电泳是依据蛋白质的等电点不同，通过等电聚焦电泳（isoelec-tricfocusing，IEF）将不同净电荷的蛋白质在PH梯度介质中外加电场作用形成分离的蛋白质区带。

然后将凝胶包埋在SDS-PAGE凝胶板上端，根据蛋白质分子量的不同，在垂直或水平方向进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），即第二向电泳。

在IEF中，蛋白质因等电点不同而被分离，在SDS-PAGE中，不同分子量的蛋白质相互间被分离开。

我是雷锋（分子生物作业2）1.分子克隆技术包括哪些基本步骤？答：分子克隆技术的基本步骤大致包括：①目的基因的获取；②载体的选择；③目的基因与载体连接；④重组DNA导入受体细胞；⑤重组体的筛选等；即分、切、接、转、筛等过程。

2.目的基因和载体连接主要有哪些方法？答: 答：目的基因与载体构建成重组体的方法主要有：1).粘性末端DNA分子的连接2). 平末端连接法3).通过同聚尾连接。

3.简述分子克隆中常用的工具酶及其作用。

在分子克隆技术中，常用的工具酶主要有：1.限制性核酸内切酶，它是一类能识别和切割双链DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶；2.DNA聚合酶Ⅰ，它具有3种酶活性：1)5'→3'聚合酶活性；2)3'→5'核酸外切酶活性；3)5'→3'核酸外切酶活性；3.反转录酶，其功能主要有：1)逆转录作用2)核酸酶H的水解作用3)依赖DNA的DNA聚合酶作用；4.DNA连接酶，它在DNA重组中的主要功能是催化两个互补粘性末端或平末端双链DNA分子的5'磷酸基团与3’羟基形成磷酸二酯键，将具有相同粘性末端或平末端的两条双链DNA片段连接起来，实现DNA的体外重组；5.碱性磷酸酶，它的作用是催化去除DNA、RNA或dNTP上的5'-磷酸基团；6.末端脱氧核糖核苷酰转移酶，其功能主要有：1)在载体或目的基因3'末端加上互补的同质多聚尾，形成人工粘性末端，便于DNA重组连接。

2)用于DNA 3'末端的同位素探针标记；7.核酸酶S1，其作用是除去双链DNA的粘性末端以产生平末端、除去cDNA合成时形成的发夹结构以及分析RNA的茎环结构和DNA-RNA分子的杂交情况等。

4.举例说明载体应具备的基本要素。

答: 载体应具备以下特征：1)能自我复制并具有较高的拷贝数，并有适宜的分子量，一般应< 10 kb；2)带有遗传筛选标记；3)有适当的限制酶切位点，便于外源基因的插入和筛选。

5.简述双抗生素筛选和蓝白斑筛选的原理。

答：1.双抗生素筛选的原理是：因大多数质粒载体带有抗生素抗性标记的特征（如Ampr 、Tetr等），当带有完整抗性基因的载体转化无抗性细菌后，被转化的阳性菌获得抗生素抗性基因而存活并形成噬菌斑，未转化菌不能存活，但应排除未重组的空载体。

2.蓝白斑筛选的原理：某些质粒载体带有大肠杆菌乳糖操纵子的lacZ基因，该基因含一段编码β-半乳糖苷酶氨基末端145个氨基酸α-肽的DNA片段，IPTG可诱导此片段合成，此片段能与宿主细胞所编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内α-互补，形成完整的β-半乳糖苷酶。

该酶能催化指示剂底物X-gal 形成蓝色菌落。

当外源基因插入lacZ基因中MCS，lacα-肽基因阅读框架被破坏，细菌内将无β-半乳糖苷酶活性，结果重组克隆呈白色菌落。

6.有哪些常用的探针标记物？答：常用的探针标记物有：1. 放射性同位素标记，常用标记探针的同位素有32P 、3H 、35S 、131I 、125I 等。

2. 非放射性标记，常用的非放射标记物有辣根过氧化物酶（HRP) 、荧光素、生物素、光敏生物素、地高辛(DIG) 等。

7.如何进行探针的标记？答：1. 放射性同位素标记探针的的方法有缺口平移法、随机引物法、末端标记法和反转录标记法等。

2.非放射性标记核酸探针的方法分为化学修饰标记法和酶促反应标记法两大类：①化学修饰标记法是利用标记物分子上的活性基团与探针分子上的某些基团发生化学反应，将标记物直接或间接结合到探针分子上。

化学标记法具有方法简单、成本低、标记方法较通用，也是目前较为常用的标记方法；②酶促反应标记法是将标记物预先标记在单核苷酸分子上，然后利用酶促反应将标记的核苷酸分子掺人到核酸探针分子中。

这种标记法具有灵敏度高的优点，但其标记过程较复杂、成本较高。

8.影响核酸分子杂交的因素有那些？如何进行杂交条件的优化？答：影响核酸分子杂交的因素有:杂交方法的选择、探针的选择、探针的浓度、温度、杂交液的成分、反应时间等。

核酸分子杂交实验条件的优化有：1.探针的选择：针对不同的杂交实验，选择不同的核酸探针，在大多数情况下，可以选择克隆的DNA 或cDNA 双链探针。

但在检测靶序列上的单个碱基改变时应选用寡核苷酸探针，在检测单链靶序列时应选用与其互补的DNA 单链探针或RNA探针。

2.探针的标记方法，选择什么标记方法视灵敏度和显示方法等实验要求和条件而定。

3.探针的浓度：随探针浓度增加，杂交率也增加，在较窄的范围内，随探针浓度增加，敏感性增加。

4.杂交最适温度，在实验前必须首先确定杂交温度。

5.杂交反应时间，一般杂交反应要进行20 h 左右。

6.洗膜温度，杂交后的最终洗膜温度一般应低于Tm 值5~ 12 ℃进行。

7.杂交液的优化,通常用于DNA 杂交的标准杂交液为5×SSC, 1.0%casein , 0.1% 十二烷基肌氨酸，0.02% 十二烷基硫酸钠。

但除了以上成分外，必要的时候可以加一些杂交促进剂。

常用的有硫酸葡聚糖，它能促进DNA 链之间的缔合。

聚合酶链反应分子生物学作业3一、名解1.生物大分子：指的是作为生物体内主要活性成分的各种分子量达到上万或更多的有机分子。

常见的生物大分子包括蛋白质、核酸、脂类、糖类。

2.酚抽提法：最初于1976年由Stafford及其同事提出，通过改良，以含EDTA、SDS及无DNA酶的RNA酶裂解缓冲液破碎细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理获得所需的DNA样品。

3.凝胶过滤层析：凝胶过滤层析也称分子排阻层析或分子筛层析，利用凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。

4.巢式PCR：巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对（而非一对）PCR引物扩增完整的片段。

第一对PCR引物扩增片段和普通PCR 相似。

第二对引物称为巢式引物（因为他们在第一次PCR扩增片段的内部）结合在第一次PCR产物内部，使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。

巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。

因此，巢式PCR的扩增非常特异。

5.Real-time PCR：实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

6.变性：模板DNA经加热至94℃左右5min 聚合酶链式反应时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。

7.复性：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。

8.退火：温度突然降至37-58℃时，变性的DNA单链在碱基互补的基础上重新形成氢键开始复性。

一般退火温度比引物Tm值约低5℃。

二、问答1.根据作用原理生物分子的分离纯化有那几类？答：根据作用原理生物分子的分离纯化可分为：（1）根据分子极性大小和溶解度的不同，如溶剂提取技术、盐析法、分配层析法、分级沉淀法等；（2）根据分子形状和大小不同，如凝胶过滤层析等；（3）根据物质吸附性质不同，如选择性吸附与吸附层析法等；（4）根据分子带电性（电离性质）的差异，如离子交换层析、电泳、等电聚焦法等。

（5）根据配体特异性，如亲和层析。

2.什么原因易引起DNA降解，该如何解决？答：引起DNA降解的原因有：1）材料不新鲜或反复冻融2）未很好抑制内源核酸酶的活性3）提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断4）外源核酸酶污染5）反复冻融。

相应的解决方法有：1）尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融；液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液2）在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量3）细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔4）所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌5）将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融。

3.简述PCR技术的基本原理及其反应体系的一般组成？答：PCR技术的基本原理是DNA的半保留复制，是在模板DNA、引物和四种dNTP 存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促反应。