BDRhapsodyTM单细胞分析系统

Fra Baidu bibliotek服 PCR 偏差 – BD 分子标签
当对序列读取进行计数时，PCR 扩增偏差可导致基因定量不准确。BD 的分子标签专利技术为单个细胞的单个基因 分配了独特的分子索引，也称为“分子条形码”。实验者可借此克服扩增偏差，更准确地计算转录水平。
为您的实验定制工作流程
对于不同用户和实验，单细胞实验工作流程往往需要不同程度的样本操作、质量和通量。BD 仪器选项可以根据具 体需求进行配置。BD FACS 分选机（如 BD FACSMelody™）是 BD Rhapsody 系统上游样本富集的良好选择。BD Rhapsody 扫描仪提供自动化细胞计数和细胞样本活性测试，帮助用户制备适用于卡式芯片单细胞捕获的最佳浓度的样本。扫描仪 提供了卡式芯片上微球捕获细胞的计数。BD Rhapsody 上样台轻巧便携，可在实验室内轻松移动。同样还提供生物信息 学途径和可视化工具。这些工具包括 UMI 分析算法和可视化工具，即使没有经验的用户也可分析和理解单细胞数据。
● 储存 - 从样本中得到的完整 cDNA 可在磁性微球上稳定存储，允许将珍贵样本保存长达 16 周。这可使用户在时间 允许的情况下灵活地对样本进行测序，并通过对储存的微球池进行等分或分样来实现同一样本的多个测定。
● 分样—在磁性微球上储存的 cDNA A 可以分成一个或多个等分试样，并使用定制或预先设计的组合（panel）进行扩 增。通过提供对部分样本进行测序的选项和对样本不同组合（panel）进行测试的灵活性，分样可降低成本。
BD Rhapsody 单细胞分析系统能够对成千上万个单细 胞的数百个表达基因进行数字定量，提供足够灵活的定制 测定法以满足任何实验需要，其有效系统可缩短实验时间 和降低测序成本。
这种全新的分析系统克服了传统检测的局限性，例如 微阵列和大量细胞 RNAseq，这些检测通过实现对各个细胞 之间的微妙差异的观察，依赖于对多个细胞的平均检测。 用户可以鉴定和表征新型和罕见细胞类型，其进一步帮助 理解从免疫学到肿瘤学等多个领域内的生物学过程。
由于与高通量实验方法相关的测序成本，单细胞实验往往非常昂贵。BD Rhapsody 单细胞分析系统设计有多个功能， 可以更有效地利用测序来降低实验成本。
● 靶向测定 - 由于检测灵敏度的提高，特定的基因组合方法可使用少量的时间和成本，帮助产生类似于全转录组分 析（Whole Transcriptome Analysis，WTA）测定的结果。这种方法还提高了 UMI 计数效率，从而极大程度的节省了 实验时间和成本。
可选 – 在 BD 流式分选仪 上进行细胞分选
样本
通过 BD Rhapsody 进行单细胞 mRNA 捕获和扩增
在 Illumina 平台上进行 测序
BD 基因组数据分析
图 3. 实例：BD Rhapsody 工作流程，包括细胞分离（FACS 可选），细胞捕获和分子标签、测序和数据分析。
更有效的测序可以更低的成本实现更高的通量
系统组件包括： ● BD Rhapsody 扫描仪 ● BD Rhapsody 上样台 ● BD Rhapsody 卡式芯片 ● 分子标签试剂和文库制备 ● 特定应用的靶向检测试剂盒（panel）
BD Rhapsody 单细胞分析系统如何工作？
图 1 显示了该系统如何实现对数百个基因的基因表达水平进行数字化定量。其采用新的平面阵列微孔用于细胞捕获 并进行基于微球的 3'RNAseq 测定。
微孔
条码标记微球 细胞
mRNA 条码标记微球 裂解后的细胞
在微孔中，一个细胞 与一个条码标记微球 匹配
裂 解 细 胞 将 mRNA 与微球上条码标记的 捕获寡核苷酸杂交
微球回收
cDNA 合成
图 1.
开始 - 细胞捕获和分离步骤
BD Rhapsody 卡式芯片可以在 磁性的寡核苷酸条形码标记微球上 实现单细胞捕获和 mRNA 转录子的 分子标签。然后将这些微球合并到 单个管中用于 cDNA 扩增和文库构 建。
评估 BD Rhapsody 的性能
为了确定 BD Rhapsody 单细胞分析系统的技术性能，将人 293T 和 小鼠 NIH / 3T3 细胞的 1：1 混合物以不同浓度上样到 BD Rhapsody 卡式 芯片上。储存的 cDNA 分子普遍扩增并进行低通量测序（每个细胞约 8,700 个读数）。在测序数据中检测到 1,109 个细胞的上样条件下，每个 细胞中，来自每个细胞的平均 99.4％的分子经检测仅为人或小鼠，这表 明微孔之间的串扰非常小。在测序数据中检测到 1，000 个或更少细胞 的上样密度下，多重态发生率接近零，并且在 15，000 个细胞下小于 5％。
图 4.使用 BD Rhapsody 的微孔之间的最小串扰和低多重态率
分数
小鼠 UMI
人 小鼠
人 UMI 单细胞分 数 平均单细 胞纯度
细胞数
使单细胞测序效率更高
靶向方法对单细胞分析的益处通过使用竞争产品的 WTA 测定和 BD Rhapsody 免疫反应组合（panel）（人）在 相似的测序深度下对外周血单核细胞（PBMC）进行表达谱 分析来证明。虽然两种测定方法的 t-SNE 表达谱分析都显 示了已知 PMBC 细胞类型的聚类结果，靶向组合（panel） 显示了比 WTA 更高的灵敏度（读数/细胞）和 UMI 计数效 率。BD Rhapsody 测定实现了与竞品 WTA 测定类似的聚类 性能，而测序读数降低了近 10 倍（靶向读数 2k vs. WTA 读 数 20k）。与使用 WTA 方法不同，靶向组合（panel）避免 了对多个高表达基因的测序如核糖体蛋白或低表达变异 性，从而提高测定效率。
从卡式芯片中回收的结合了 mRNA 的微球
微球 反转录
cDNA 结合在微球上，标记有细胞标记和分子标签
微球
测序和构建单细胞基 因表达谱
Univ = Universal sequence
UMI = Unique molecular index
CL = Cell label dT = oligo(dT)
BD RhapsodyTM 单细胞分析系统
平行分析数千个单细胞内数百个基因的表达水平
数千个单细胞数百个基因的平行分析
单细胞 RNAseq 正在改变我们对细胞的理解。 BD Rhapsody™单细胞分析系统基于 BD 在细胞生物学领域 40 年的专业技术，满足您的实验需求，在单细胞水平理解细 胞形态和功能。
使用靶向引物组合（panel）扩增 cDNA
微球 通用寡核苷酸 多重 PCR 1
BD Rhapsody PCR 1 引物*
通用寡核苷酸
多重 PCR 2
BD Rhapsody PCR 2 引物*
文库正向引物 读序 1 最终扩增
文库反向引物
测序接头
测序接头和文库索引 读序 2
图 2. mRNA 捕获和文库制备步骤。