体外细胞培养
体外培养细胞的基本形态
体外培养细胞的基本形态
体外培养细胞的基本形态通常可以分为以下几种：
1. 悬浮细胞：这种细胞没有任何附着物质，完全悬浮在培养基中。
悬浮细胞的形态通常呈现为圆形、椭圆形或不规则形状。
2. 基质附着细胞：这种细胞会附着在培养基的底部或其他附着物质上。
它们通常呈现为扁平的形状，并且会伸出像触角一样的细胞突起。
3. 单层附着细胞：这种细胞生长在平坦的基质上，形成一个单细胞层。
其形态通常呈现为扁平的形状，并且细胞之间呈现较为规则的排列。
4. 多层附着细胞：这种细胞会从单层细胞增殖而来，形成多层细胞堆叠的结构。
上层细胞通常会呈现较为扁平的形状，下层细胞则呈现更加立体的形态。
除了这些基本形态，不同类型的细胞在体外培养时还可展现出不同的特征形态。
需要注意的是，体外培养条件可能会对细胞形态产生影响，所以在实验过程中需要综合考虑培养条件对细胞形态的影响。
简述体外培养细胞的形态特征及其生长阶段
简述体外培养细胞的形态特征及其生长阶段体外培养细胞是指将细胞从其天然环境中取出，放入培养基中，在合适的条件下维持和增殖的细胞。
体外培养细胞的形态特征和生长阶段与细胞类型有关，但有一些共同的特征和阶段。
一般来说，体外培养细胞具有以下形态特征：1. 形态多样性：不同类型的细胞在体外培养中表现出不同的形态特征。
有的细胞呈悬浮生长，形成单个或成团的细胞群；有的细胞附着在培养器皿底部，形成单层或多层薄片。
2. 细胞大小和形状：体外培养细胞的大小和形状也变化多样。
有的细胞较小且呈圆形或椭圆形；有的细胞较大且呈扁平形或长条形。
3. 细胞分裂：体外培养细胞通常通过有丝分裂进行细胞增殖。
在分裂前，细胞会经历一段生长期，增加体积和细胞器数量，然后进入分裂期。
体外培养细胞的生长阶段包括以下几个阶段：1. 悬浮细胞的生长阶段：悬浮细胞通常分为四个生长阶段：lag期（适应期）、log期（指数期）、stationary期（平台期）和decline期（衰亡期）。
在lag 期，细胞正适应培养基的环境，准备开始增殖。
在log期，细胞开始快速增殖，细胞数呈指数增长。
在stationary期，细胞增殖速度减慢，细胞数趋于稳定。
在decline期，细胞死亡速度超过增殖速度，细胞数开始下降。
2. 附着细胞的生长阶段：附着细胞的生长阶段通常分为三个阶段：附着期、增殖期和平衡期。
在附着期，细胞接触到培养器皿表面，并开始附着。
在增殖期，细胞开始增殖并形成单层或多层细胞。
在平衡期，细胞增殖速度减慢，细胞数趋于稳定。
总结起来，体外培养细胞的形态特征和生长阶段是多样的，但都遵循一定的规律。
了解这些特征和阶段有助于科学家更好地控制和利用体外培养细胞，促进生物医学研究的发展。
transwell共培养原理
一、Transwell共培养介绍Transwell共培养是一种常用的体外细胞培养技术，通过使用Transwell孔膜插入式细胞培养皿，可以模拟细胞间相互影响的情况，从而更好地研究细胞间信号传导、细胞迁移和细胞间相互作用等生物学过程。
本文将结合Transwell共培养的原理、应用和操作步骤，对该技术进行详细介绍。
二、Transwell共培养的原理Transwell共培养的原理是利用Transwell孔膜插入式细胞培养皿，使得上下室中的细胞可以通过孔膜进行相互作用。
孔膜的直径通常在3-12微米之间，可以根据实验需要选择不同直径的孔膜。
上下室中的细胞可以分别种植在孔膜的两侧，从而实现细胞间的共培养。
三、Transwell共培养的应用1. 模拟体内细胞间相互作用：Transwell共培养可以实现不同类型细胞之间的相互作用，如免疫细胞与肿瘤细胞、上皮细胞与间质细胞等，从而更好地模拟体内情况。
2. 研究细胞迁移和浸润：通过在孔膜上涂覆ECM或采用Transwell迁移实验可以模拟细胞的迁移和浸润过程，对细胞迁移机制进行研究。
3. 评价药物渗透性：可用于评价药物在肠道、肾小球等组织中的渗透性，以预测其在体内的分布和代谢情况。
四、Transwell共培养的操作步骤1. 准备Transwell孔膜：选择合适直径的Transwell孔膜，并在使用前进行灭菌处理。
2. 细胞培养：分别将上下室的细胞分别种植在Transwell孔膜的两侧。
3. 培养条件：放置Transwell共培养皿于细胞培养箱中，保持适宜的pH值和温度，并定期更换培养基。
4. 实验操作：根据实验的目的，可进行细胞迁移实验、信号传导实验等操作。
5. 结果分析：对实验结果进行统计分析，观察上下室细胞的形态及细胞指标的变化。
五、Transwell共培养技术的发展趋势随着生物医学研究的不断深入，Transwell共培养技术也在不断发展。
未来，Transwell共培养技术有望应用于疾病模型的构建、靶向药物筛选等领域。
体外培养细胞的基本形态
体外培养细胞的基本形态
体外培养细胞的基本形态取决于细胞类型和培养条件。
然而，大多数体外培养细胞在适当的条件下通常会形成两种基本形态：
1. 悬浮细胞：某些细胞类型以单个细胞的形式悬浮在培养基中生长。
这些细胞通常是圆形或卵圆形的，且没有固定的形态。
它们可以自由地在培养基中移动和增殖，且不依赖于外部支持（如培养皿表面）。
2. 贴壁细胞：其他一些细胞类型具有贴壁的生长习性，需要附着在培养皿表面或其他细胞支持基质上生长。
这些细胞通常呈扁平或纺锤形，并沿着支持基质表面附着。
它们可以形成单层或多层细胞，紧密地粘附在一起。
此外，还有一些细胞类型可以形成三维结构，例如球状聚集体或器官样结构。
这些细胞可以在体外条件下自组装成立体结构，并模拟组织或器官的形态和功能。
细胞体外培养里面加人血清白蛋白的意思
细胞体外培养里面加人血清白蛋白的意思细胞体外培养是一种在实验室中培养和繁殖细胞的技术。
在这个过程中，培养基中通常会添加一定比例的人血清，以提供细胞所需的营养物质和生长因子。
而在一些特定的实验条件下，为了满足细胞对特定蛋白质的需求，人血清白蛋白会被添加到培养基中。
1. 细胞体外培养的基本概念细胞体外培养是一种用于研究细胞生长和生物学特性的重要技术。
通过培养细胞体外，研究人员可以更方便地对细胞进行操作和观察，从而揭示细胞的生理、代谢和分化等方面的特性，并为医学研究和药物开发提供重要的实验数据。
2. 人血清在细胞培养中的作用人血清作为一种含有多种生长因子、蛋白质和营养物质的营养液，在细胞培养中起着至关重要的作用。
它可以为细胞提供所需的营养物质，促进细胞的生长和繁殖。
另外，人血清中还含有一定比例的生长因子和激素，可以调节细胞的代谢和生长，对细胞的分化和功能发挥起着重要作用。
3. 人血清白蛋白的添加意义人血清白蛋白是一种重要的蛋白质成分，其在细胞培养中的添加不仅可以提供额外的营养物质，更重要的是可以模拟细胞在体内的生长环境，促进细胞的正常生长和功能发挥。
在一些特定的实验条件下，例如神经细胞的培养、癌细胞的研究等，人血清白蛋白的添加可以更好地满足细胞对特定蛋白质的需求，促进细胞的正常生长和功能发挥。
4. 添加人血清白蛋白的培养基配方和使用注意事项在进行细胞培养实验时，如果需要添加人血清白蛋白，一般可以根据实验的具体要求在培养基中添加适当比例的人血清白蛋白，例如0.5、1等。
在添加人血清白蛋白时，需要严格控制培养基的成分和比例，以确保细胞在最适宜的生长环境中。
另外，在培养过程中要注意对人血清白蛋白的保存和使用，避免因保存不当或者污染导致细胞培养失败。
总结：细胞体外培养是一种重要的实验技术，而人血清白蛋白的添加则可以进一步优化培养环境，满足细胞对特定蛋白质的需求，促进细胞的正常生长和功能发挥。
在进行细胞培养实验时，研究人员需要根据实验的具体要求合理添加人血清白蛋白，并严格控制其成分和比例，以获得准确可靠的实验结果。
第一节-体外培养的概念
第一节体外培养的概念一、基本概念体外培养（in vitro culture），就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。
组织培养：是指从生物体内取出活的组织（多指组织块）在体外进行培养的方法。
细胞培养：是指将活细胞（尤其是分散的细胞）在体外进行培养的方法。
器官培养：是指从生物体内取出的器官（一般是胚胎器官）、器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法。
二、体内、外细胞的差异和分化1、差异：细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。
因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。
实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。
2、分化：体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的改变，细胞分化的表现和在体内不同。
细胞是否表现分化,关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。
第三节细胞培养的无菌环境一、无菌室无菌室的结构：一般由更衣间、缓冲间、操作间三部分组成。
无菌室的消毒和防污染：为保持无菌状态，经常消毒是必要的，通常采用每日（使用前）紫外照射（1－2小时），每周甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）和每月新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。
实际工作中，要根据无菌室建筑材料的差异来选择合适的消毒方法。
此外，还应注意防止无菌室的污染。
造成无菌室污染的可能包括：送入无菌室的风没有被过滤除菌；进出无菌室时，能使外界空气直接对流进无菌室的操作间；等。
体外培养细胞的生长与增殖过程(1)
体外培养细胞的生长与增殖过程(1)
一、细胞的生长与增殖过程
细胞生长和增殖是细胞学和生物学中的重要研究内容。
细胞生长指细
胞体积增大，细胞形态变化和代谢活动的增强，是细胞分裂的前提；
细胞增殖指细胞数目的增加，是细胞分裂的结果。
二、体外培养细胞的生长与增殖
体外培养细胞是指将体内原生质体外培养至固定形态的细胞，其能够
在无机溶液和特定的营养物质条件下，维持正常的生长和增殖过程。
在体外培养的细胞中，常常可以观察到以下过程：
1. 细胞贴附和生长：细胞在培养皿上吸附，贴附并向周围扩散，经过
一段时间的培养，细胞的生长速度逐渐增加。
2. 细胞周期：细胞生长的过程不是一直进行，而是依照细胞自身的周
期进行。
一个细胞周期包括G1期、S期、G2期和M期。
其中，S期是DNA合成期，M期是有丝分裂期。
3. 细胞增殖：在适宜的培养条件下，细胞会不断地分裂，增殖数量逐
渐增多。
4. 细胞凋亡：当细胞在生长分化后达到一定阶段，其代谢均衡将失调，细胞停止生长且出现自我消亡迹象，即细胞凋亡。
三、体外培养细胞的应用价值
体外培养细胞技术是现代生命科学研究中非常重要的一部分。
它可以用于细胞生长、发育、增殖与凋亡的机制研究；提供大量、一致的细胞材料，可以用于生物工程、医学检测和药物筛选等。
同时，体外培养细胞还可以用于稳定细胞株的制备，对于生产生物制品、鉴定生物影响因素等方面也有重要的应用价值。
综上所述，体外培养细胞的生长与增殖过程是研究生物学和生命科学的重要方向，其应用价值在现代生命科学研究和工业生产中日益引人注目，具有广泛的应用前景和开发潜力。
细胞培养流程
细胞体外培养实验流程一、细胞复苏1.准备：紫外照台30min,准备好高压灭菌好的吸管、移液管、离心管、废液缸、培养瓶、培养基含FBS,水浴箱开启到37℃,75%乙醇清洗双手,培养基用前37℃温育20min,酒精擦拭后放入无菌操作台,点燃酒精灯;2.灼烧离心管管口、塞子和滴管,用滴管取5mL培养基加入离心管中;3.戴好防护用具,从液氮中取出冻存管后立即放入37℃水浴箱中,轻轻摇晃冻存管,保证细胞1min内融化;以75%酒精擦拭冻存管外部,移入无菌工作台;4.用吸细胞液的从冻存管中将细胞悬液完全吸出加入到已装有培养基的离心管中,塞子塞离心管,2000rpm,离心4min,弃上清;5.往离心管中加培养基含FBS5mL,用吸细胞悬液的滴管轻轻吹打,使细胞混匀,将离心管中的细胞悬液全部吸出加入到培养瓶中,培养瓶平放,轻轻晃动,使细胞均匀贴壁,标记好细胞名称、日期、培养人,放入37℃,5%的CO2恒温培养箱培养;6.收拾所用物品,75%酒精喷洒消毒;注意：1.离心时转速太高,离心时间过久都易对细胞造成伤害;2.滴管一定要严格分开,不能混用,防止细胞污染;3.DMSO常温下对细胞毒性较大,故冻存细胞复苏后应立即洗涤冷冻保护剂;二、细胞换液1.将培养瓶从CO2培养箱中取出,倒置显微镜下观察细胞生长状态判断生长情况,并确证未发生污染后转入无菌操作台内;2.准备：紫外照台30min,准备好高压灭菌好的吸管、移液管、离心管、废液缸、培养瓶、培养基含FBS,水浴箱开启到37℃,75%乙醇清洗双手,培养基用前37℃温育20min,酒精擦拭后放入无菌操作台,点燃酒精灯;3.酒精灯外焰灼烧培养瓶瓶口、瓶塞和滴管,培养瓶倾斜,吸出旧液,尽量吸净;4.吸取培养基含FBS5mL,加到培养瓶中FBS终浓度为10%;若死细胞较多则可以先用PBS洗一次,再加培养基;5.将培养瓶与瓶盖过火,旋紧瓶塞后回旋半圈,平放回CO2培养箱;6.收拾所用物品,75%酒精喷洒消毒;注意：1.打开和盖紧培养基、培养瓶前后均需旋转灼烧瓶口和瓶盖;2.各滴管一定要严格分开,不能混用;3.将PBS注入到培养瓶中,应将液体打到没有细胞的那一面;4.培养液以没过细胞为宜;5.细胞溶液变黄或死细胞过多时换液;6.倒掉培养瓶中的培养液,瓶口应尽量远离废液缸,以免造成污染三、细胞计数和活力测定一细胞计数细胞数/mL=4大格细胞总数/4×104×稀释倍数1.紫外照台30min,75%酒精棉签清洁盖玻片及计数板,用干纱布或棉签再擦一遍,放好盖玻片;2.用滴管从已经吹打混匀的细胞悬液中吸出少许,滴加在盖玻片边缘,使悬液充满盖玻片和计数板之间,静置3min;3.观察计数：压线的记左不计右,记上不记下,成团细胞只记为1个;先用4×倍镜找出大位置,再用10×镜计数;4.计数完用75%酒精棉签擦洗盖玻片和计数板;二细胞活力测定1. 紫外照台30min,吸取细胞悬液加入试管中;2. 加入%台盼兰染液,染色2～3min;3. 吸取少许悬液涂于载玻片上,加上盖片;4. 镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数,计细胞活力;死细胞能被台盼兰染上色,镜下可见深兰色的细胞,活细胞不被染色,镜下呈无色透明状;注意：1.细胞计数时盖玻片下不能有气泡,也不能让悬液流入旁边凹槽中;2.活力测定可以和细胞计数合起来进行,但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用;四、细胞传代1.配完全培养基：基础培养基:FBS=1:92.取出细胞,显微镜下观察细胞形态和密度,确定细胞生长状况,是否需要传代 ;3.紫外照台30min,75%酒精擦拭双手,将预热后的培养基、PBS、胰酶培养基等用酒精擦拭后移入超净台,将废液缸喷足酒精移入超净台,取酒精棉放入超净台;4.点燃酒精灯,将培养瓶用75%酒精擦拭后移入工作台,将瓶口和瓶盖过火灼烧;5.在确定细胞生长状况良好且没有污染的情况下,用适量PBS清洗细胞表面,并弃去PBS;6.加入1mL %胰酶消化细胞,此时可将细胞置于37℃细胞培养箱内消化;胰酶以铺平培养瓶底部为宜;倒置显微镜下观察,若胞质回缩,细胞之间不再连接成片,表明此时细胞消化适度一般2-5min;立即弃去消化液加入3mL完全培养基终止消化;注意更换吸管7.用吸细胞液的滴管轻柔吹打,保证培养瓶底的每个角落都吹打到,斜坡处不能忽略,把培养瓶中所有细胞悬液用吸细胞液的滴管移入离心管中,再用滴管吹打混匀细胞悬液;8.取一滴细胞悬液进行计数,计算好细胞传代培养时稀释倍数细胞传代密度不低于5×105个/mL;9.传代：先用滴管吹打混匀细胞悬液,按一定比例稀释,标记好细胞名称,传代培养时间,培养员,细胞个数,平放入CO2培养箱继续培养;10.收拾所用物品、用75%酒精喷洒操作台;附：培养细胞若需给动物注射,在消化后用PBS清洗3-5次后收集细胞并计数,用PBS清洗细胞是为防止给动物注射时残留的FBS造成动物炎症;注意：1. 对于难消化的细胞在用胰酶消化前,先用1～2mL 4 ℃PBS冲洗一遍,较易消化的细胞不需要此步骤;2. 一定要防止细胞过消化因过消化,使细胞成团,不均匀,且对细胞伤害很大,影响细胞贴壁和导致生长状态差等;过消化特征：a.在没有加入完全培养基终止消化前就有成团细胞从培养瓶壁上脱落,胰酶里出现很多悬浮物,为掉下来的细胞;b.培养瓶底板上本身为白茫茫细胞贴壁生长,而过消化后细胞脱壁掉下来,则可见培养瓶底板有一片片空隙;出现过消化时立即加入含FBS的培养基终止消化;3. 把试管中细胞悬液转移到培养瓶中时,每次滴管在试管中取液时都要轻柔吹打液体,以防止细胞成团不均,用力吹打和气泡产生对细胞都有伤害,影响在培养瓶中生长;5. 一般细胞生长铺至瓶底约80%,则可传代或用来做实验,否则细胞进入生长平台期进而缺少营养而状态老化,不易用于后续实验;五、细胞冻存1.选对数增生期细胞证明无支原体污染,在冻存前1天换半量或全量培养基;与冷冻细胞应生长良好且存活率高,约为80-90%致密度;2.配制冷冻保存溶液使用前配制：另取一离心管,加入培养基、FBS10%,逐滴加入二甲基亚砜DMSO至20%浓度,即制成双倍的冻存液,置于室温下待用; 3.依细胞传代培养的操作,收集细胞于离心管中,取少量细胞悬液计数细胞浓度及冻前存活率,一般细胞冻存浓度为1-5×106个/mL;4.离心管管口和管塞过火灼烧,塞好后,2000rpm离心4min,去上清,加适量完全培养基,混匀;5.取与细胞悬液等量的冻存液,缓慢逐滴加入细胞悬液,并晃动试管,制成细胞冻存悬液DMSO最后浓度为5～10％,使细胞浓度为1～5×106cells/mL,混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中,1～2mL/vial,并取少量细胞悬浮液作污染检测;严密封口后,注明细胞名称、代数、日期;6.4℃静置10min,-20℃静置30min,-80℃过夜放置,液氮槽冷冻保存;。
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第一讲体外细胞培养的基本技术●体外细胞培养条件和基本技术●体外细胞培养●体外培养物的生长生物学●细胞系和细胞株●培养物的冷冻与复苏●培养物的污染、检测和排除●一、体外细胞培养条件和基本技术体外细胞培养的优缺点优点：简化细胞的生长环境，方便施加实验因素，便于观测实验结果，便于获得均一细胞群，能够进行大规模生物制品的生产。
体外细胞培养不足之处：培养对象脱离了机体的整体支配和调控，细胞间在一定程度上失去组织联系及相互作用。
体外培养条件下的生长发育情况与在体时的情况存在一定差异，分析实验结果时必须考虑这种差异。
一、体外细胞培养条件（一）、体外培养实验室1. 准备室2. 培养室：基本条件要求：清洁、无菌、干燥、不通风，并具有适宜的光线。
空气调节用中央空调或分体式空调机。
室顶安装紫外灯等消毒装置。
3. 缓冲室4. 其他实验室（二）、体外培养的设备和器具设备：1. 超静工作台，生物安全柜，净化室 2. 培养箱：温度，湿度，pH值3. 倒置显微镜4. 水净化装置：去离子水净化装置，石英玻璃蒸馏器，超纯水装置 5. 冰箱 6. 离心机7. 冷冻保存装置8. 高压蒸汽消毒装置：电热干燥箱，pH计，天平培养器具：1. 过滤除菌装置：Zeiss 滤器，抽滤式玻璃简易型滤器，针头式加压塑料小滤器2. 培养器皿：（1）溶液瓶（2）培养瓶（3）培养皿（4）多孔培养板（5）离心管3. 移液器4.筛网：金属筛网（不锈钢网、铜网），尼龙筛网（三）培养用液•水和平衡盐溶液（balanced salt solution, BSS)水：离子交换水，蒸馏水平衡盐溶液：主要成分：无机盐和葡萄糖常用BSS: PBS ，Ringer Earle ，D-Hanks，Hanks •培养液：1.天然培养液：1）血清：小牛血清,胎牛血清（fetal bovine serum, FBS）,马血清，2）水解乳蛋白，3）胚胎渗出液2.合成培养液：合成培养基的种类MEM，RPMI 1640，McCoy 5A，HAM F12等3.无血清培养基：干粉型培养基的配制：1）. 制备高质量的去离子水(玻璃三蒸馏水)或超纯水2）. 加温水至15-30℃之间3）. 加干粉入水中，搅拌令之溶解4）. 加NaHCO3 5）. 加水至最终量6）. 必要时用1N HCl或1N NaOH调节pH，因滤过时pH 可能受影响7）. 用0.22um或小于此微孔滤膜滤过消毒•其他用液：消化液等1.消化液：胰蛋白酶、EDTA溶液2.pH 调整液：NaHCO3溶液、HEPES溶液3.抗生素液：青链霉素常用的生长培养液：基本培养基80-90％血清(多用小牛血清) 10-20 ％抗生素(多用青霉素100单位／毫升和链霉素100微克／毫升一、细胞体外培养的其它条件一）、无污染的气、液相环境：1、O2 （5%CO2 + 95% 空气，O2: 21%）2、CO2- pH3、液相环境-渗透压二）、温度三）、生长基质1、多聚赖氨酸：0.05mg/ml 2、纤维连接蛋白：1mg/ml 3、胶原：1~3mg/ml 4、层粘连蛋白：5~10 g/ml一、清洗和消毒1.1玻璃器皿的清洗：浸泡→刷洗→酸浸→冲洗浸酸液：强液：63克重铬酸钾，1000毫升浓硫酸，200毫升蒸馏水。
次强液：120克重铬酸钾，200毫升浓硫酸，1000毫升蒸馏水。
弱液：100克重铬酸钾，100毫升浓硫酸，1000毫升蒸馏水。
胶塞清洗：胶塞入水中浸泡→2％Na0H煮沸10-20分钟→自来水冲洗→1％稀盐酸浸泡30分钟→自来水冲洗和蒸馏水漂洗2-3次，晾干备用1.2塑料器皿的清洗：2.包装：局部包装；全包装3.消毒：紫外线，干热消毒，湿热消毒，滤过消毒，射线消毒，消毒剂的使用二、体外细胞培养体外细胞培养类型：原代培养，继代培养一）、基本流程：１mm3的植块→植块培养原代培养：↗动物器官或大组织块→洗去血污→剔除多余成分↙组织剪碎→蛋白酶消化→机械吹打→铜网过滤→离心→细胞悬液→调整细胞数→分离细胞培养二）、实验要点：1、常用实验材料的取材：胚胎、组织、人体手术或活检材料2、分散细胞的方法：１）. 机械解离细胞法：吸管吹打法,过筛法,单细胞分离器２). 蛋白酶学处理法: 胰蛋白酶, 胶原酶３). 螯合剂解离细胞法: EDTA , 柠檬酸钠3、接种和培养过程:：１）. 植块培养：接种与培养：优点：比较简单，保留了在体时细胞间的相互作用，因而在体外培养时，植块内细胞容易存活和生长。
２）.分散细胞培养：操作过程:优点：解除了植块内部细胞间的组织关系，从而可以反映出单个细胞的生物学特征。
可实现对单一细胞类型进行细胞生物学研究。
4、讨论和注意事项⏹相对于植块内的细胞，分离散细胞在体外更难以存活和生长。
⏹对于大多数贴壁依赖型细胞来说，如何尽快让接种的细胞贴壁，是决定培养物生长快慢的关键步骤。
可选用生长基质表面；降低浮力。
⏹细胞密度：105个/ml左右，对大多数动物细胞是比较适中的。
三）、原代细胞培养的注意事项1、培养液：培养基的选择，添加剂，培养液的酸碱度，换液。
2、培养的空间：通常培养液与液面上空间的体积比以1:10为宜。
一、原代培养物需要传代的指标:继代培养1、植块培养;2、分离细胞培养物;3、悬浮细胞培养物二、传代的过程1、主要材料：（1）蛋白酶消化液；（2）培养器皿；（3）培养液及平衡盐溶液2、方法：（1）贴壁生长细胞培养物的传代：吸去旧培养液→PBS 或D-Hanks洗→酶消化解离细胞→终止消化→吹打培养器皿底部→收集细胞、洗涤、调整细胞数→接种（2）悬浮培养物的传代：培养物移入离心管→离心、去上清→培养液重悬→接种培养皿→补加培养液三、传代培养的注意事项1、传代的时机与再培养的细胞密度2、传代数与培养物的生长●三、体外培养物的生长生物学一、培养细胞的生长与增殖⏹原代培养期：细胞性状与体内原组织相似性大，异质性。
⏹传代培养期：细胞增殖旺盛（潜伏期、指数生长期、停滞期），逐渐趋向同质化，正常细胞约可传30-50代，应及早冻存。
⏹衰退期：细胞增殖减慢，直至死亡。
二、体外细胞培养物的生长类型:：（黏附型细胞；悬浮型细胞）1、黏附型细胞1）多数培养细胞贴附生长，属贴壁依赖性细胞。
2)体内：粘附全方位，外形具有复杂的立体特征。
体外：多数情况，细胞只有一个附着平面，外形一般与体内时明显不同。
成纤维细胞型：梭形、长条形或不规则多角形，胞体一般铺展很开，成群细胞呈现放射状、旋涡状等走行形式。
起源于中胚层的细胞在体外培养时一般表现为此型，如成纤维细胞、肌肉细胞、骨与软骨细胞以及血管内皮细胞等。
上皮细胞型：扁平、多角形，细胞间相互衔接或呈镶嵌状紧密排列，呈“铺路石样”，形成单层膜。
起源于内、外胚层的细胞体外培养时可能呈现此型，如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等。
游走细胞型：细胞相互分散，一般不形成集落；在器皿壁上生长位置不固定，经常处于较活跃的变形和游走状态，因此外形不规则且不断变化。
主要是具有吞噬作用的单核巨噬细胞细胞系统的细胞，如颗粒性白细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞以及某些肿瘤细胞。
多形细胞型：形态不规则，一般分为胞体和胞突两部分。
胞突为细长形，似丝状伪足。
胞体虽略呈多角形。
主要是神经元和神经胶质细胞2、悬浮型细胞细胞在培养时不粘附于支持物上，而是呈悬浮生长状态，如某些癌细胞和血液白细胞。
细胞悬浮生长时胞体为圆形。
适于大量繁殖。
三、培养细胞的生长状况观察一）常规观察1培养液：颜色、透明度等；2细胞生长概况及形态变化：细胞轮廓、折光性、胞内颗粒等；3微生物污染状况：二）细胞生长状况观察1. 细胞计数：细胞计数仪；细胞计数板制备细胞悬液，稀释成合适的浓度；加至细胞计数板中央凹槽处，显微镜下计算四角大方格内细胞总数；按照公式计算悬液中细胞密度。
2. 细胞生长曲线细胞生长曲线是衡量细胞增殖快慢的重要指标。
细胞计数法：MTT（CCK-8）法潜伏期：细胞有生长话动而无细胞分裂。
潜伏期一般为6～24小时。
对数生长期：细胞数随时间成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。
停止期（平台期）：细胞长满瓶壁后，虽有活力但基本不再分裂。
3. 细胞分裂指数（mitotic index, MI）培养物中分裂相数量占全部细胞数量的百分比，统计时，每瓶至少需计数1000个细胞。
一般细胞的MI约为0.1－0.5%。
原代培养物的MI比继代培养物低。
连续细胞系和肿瘤细胞高，可达3%－5%。
4. 细胞周期流式细胞仪测定；同位素标记测定：3H-TdR 掺入法细胞群体倍增时间：培养物中细胞数量翻倍的平均时间。
群体倍增时间通常长于单个细胞周期。
四、细胞活力的检测方法1、台盼蓝排斥试验台盼蓝（Trypan blue）染色使死细胞呈蓝色，活细胞不着色。
计数法得到活细胞比例。
此法简单快速。
注意及时检测，时间过长部分活细胞亦被染色2、克隆（集落）形成试验测定单个细胞增殖能力，克隆形成率高者独立生存能力强。
平板克隆形成试验软琼脂克隆形成试验：多用于检测肿瘤细胞或转化细胞。
利用肿瘤细胞的非锚着生长依赖性，将其悬浮培养于软琼脂内。
可根据其克隆形成率判断细胞的恶性程度，亦可用此法进行亚克隆分离3. 3H-TdR 掺入法3H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷（TdR），在DNA复制时掺入至新合成的DNA链中，从而使子细胞被3H标记，测定3H的放射性脉冲数即可比较细胞增殖活性。
4. 细胞活力测定的MTT比色法⏹MTT（二甲基噻唑二苯基四唑溴盐）是线粒体琥珀酸脱氢酶的作用底物，在活细胞中MTT能被其线粒体脱氢酶还原为formazan颗粒，溶于异丙醇或DMSO之后，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比，因此根据呈现的OD值可反应细胞的代谢水平。
死细胞无此酶活性。
⏹MTT 法简单快速、准确，广泛应用于新药筛选、细胞毒牲试验、肿瘤放射敏感性实验等。
⏹亦常用于测定生长曲线。
●四、细胞系和细胞株一、基本概念细胞系(cell line)：从原代培养物经传代后得来的一群不均一的细胞。
由原先组成原代培养物的所有细胞类型组成，但一般以某种细胞为主。
细胞株(cell strain)：通过选择或克隆化培养，从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊遗传、生化性质或特异标记的细胞群。
如一定标记染色体、对某种病毒的敏感性或抗性、特殊的抗原性等，这些特性在以后的培养中必须持续存在。
有限细胞株（finite cell strain）连续细胞株（continuous cell strain二、建立细胞系（株）的档案1、培养细胞的来源交代细胞供体所属物种、年龄、性别、器官或组织来源。
对肿瘤组织，应说明临床病理诊断结果、组织来源、病例号等。
说明培养基、血清等的使用条件。
2、细胞生物学特性说明细胞的一般形态、特征性结构、生长曲线与分裂指数、倍增时间、集落形成率、染色体特性等。