胰蛋白酶抗原修复液
石蜡切片免疫组化中抗原修复方法的选择和注意事项
石蜡切片免疫组化中抗原修复方法的选择和注意事项免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）是一种通过抗原抗体特异性反应来检测并定位蛋白的方法，目前广泛应用于组织病理学诊断。
其中，抗原修复（Antigen repair，AR）是免疫组化过程中不可忽略的关键步骤。
原因是组织经福尔马林等固定液固定和石蜡包埋后，抗原决定簇与核酸易发生交联，引起蛋白质空间结构的改变，导致抗原决定簇被封闭，使抗原与抗体的结合点减少，从而令抗原的阳性检测率及着色强度相对减弱。
这种交联在高温加热或是蛋白酶水解的作用下会发生可逆反应，恢复蛋白的原有构象，这一过程就是抗原修复。
一AR常用的方法是否进行AR、采用什么方法进行AR 要按抗体说明书的要求决定，不同的抗体选择适合该抗体的AR方法，有的要求高温修复，有的要求酶消化。
➤微波法方法：切片于抗原修复液中经微波炉内微波辐射5-20min。
它是利用微波每秒以24亿5千万次的快速运动产生瞬间热。
微波辐射可以使各物质分子作极性运动，促进形成的醛键断裂开。
分子间运动所产生的瞬间热可导致甲醛固定后的蛋白的变性。
该法的特点是：产热迅速，容易操作，但也容易引起抗原修复液的沸腾，使得修复液温度不稳定。
➤高温高压法方法：切片于抗原修复液中在高压锅中加热至沸腾，盖上压力阀至喷汽后持续1-5min。
该法利用高压和高热来促进醛键的断裂，当加热至开锅，加上高压阀后，汽体喷出，此时的温度在100℃-120℃之间，而高压也易使蛋白变性。
➤真空负压法方法：切片于抗原修复液中在预先调至95℃的真空负压干燥箱中真空负压处理5-10min。
这是一种操作简单，效果特佳，温度恒定，能一次性处理大量切片的方法。
该法特点是分子在失重的情况下四处飘游，可以增加各分子间的碰撞机会，而且恒定的温度能保证使甲醛固定的蛋白发生变性又不会使抗原修复液达到沸点。
➤酶修复法方法：0.10%胰蛋白酶或0.40%胃蛋白酶在室温或37℃消化切片15-30min。
抗原修复方法及注意事项
抗原修复方法及注意事项在免疫组织化学（IHC）和免疫细胞化学（ICC）等实验技术中，抗原修复是一个至关重要的步骤。
它对于提高抗原的检测敏感性和特异性，获得准确可靠的实验结果具有重要意义。
接下来，让我们详细了解一下抗原修复的方法以及在操作过程中需要注意的事项。
一、抗原修复的概念抗原修复，简单来说，就是通过一系列的处理方法，使在组织固定和处理过程中被封闭或破坏的抗原决定簇重新暴露出来，从而能够与抗体发生特异性结合，被检测到。
二、抗原修复的方法（一）热诱导抗原修复（HIER）这是目前应用最为广泛的方法之一。
1、水浴加热法将切片浸泡在装有修复液的容器中，然后置于水浴锅中加热。
通常温度设定在 95 100℃，时间一般为 15 20 分钟。
2、高压加热法把切片放入装有修复液的高压锅中加热。
这种方法能在较短时间内达到较好的修复效果，一般加热 2 3 分钟，压力维持在 10 13 个大气压。
3、微波加热法将切片放入装有修复液的容器中，然后放入微波炉中加热。
加热时间和功率需要根据具体情况进行调整，一般为 5 15 分钟。
（二）酶消化法常用的酶包括蛋白酶 K、胃蛋白酶、胰蛋白酶等。
酶的浓度和作用时间需要根据组织类型和抗原特性进行优化。
（三）非加热抗原修复法例如使用某些化学试剂，如尿素等，来实现抗原修复。
三、抗原修复液的选择常见的抗原修复液有柠檬酸盐缓冲液（pH 60）、EDTA 缓冲液（pH 80 90）和 TrisEDTA 缓冲液（pH 90）等。
不同的修复液对于不同的抗原和组织具有不同的效果，需要根据实验条件进行选择。
四、抗原修复的注意事项（一）组织切片的准备切片的厚度要适中，一般为 3 5 微米。
过厚的切片可能导致修复不均匀，过薄的切片则容易在操作过程中受损。
（二）修复液的配制要严格按照配方准确配制修复液，确保 pH 值和浓度的准确性。
同时，修复液要新鲜配制，避免长时间存放导致失效。
（三）温度和时间的控制这是抗原修复的关键因素。
重组胰蛋白酶用途
重组胰蛋白酶用途胰蛋白酶是一种由胰腺分泌的消化酶，主要负责分解蛋白质，帮助人体消化食物。
然而，传统的胰蛋白酶存在一些问题，例如耐酸性差、容易被胃酸破坏等。
为了克服这些问题，科学家们利用基因重组技术成功地合成了重组胰蛋白酶，这种酶具有更好的酸碱稳定性和抗胃酸能力。
重组胰蛋白酶在医药领域和食品工业中有着广泛的应用。
重组胰蛋白酶在医药领域有着重要的应用。
由于其具有更好的稳定性和抗胃酸能力，重组胰蛋白酶被广泛应用于治疗胰腺功能不全引起的消化不良症状。
胰腺功能不全是由于胰腺分泌的胰酶不足，导致食物中的蛋白质无法充分消化。
重组胰蛋白酶可以作为替代治疗，帮助患者消化食物，减轻胃肠道不适症状，并促进营养吸收。
重组胰蛋白酶在食品工业中也有着重要的应用。
在食品加工过程中，重组胰蛋白酶可以用作蛋白质降解剂，帮助改善食品口感和消化性。
例如，在面包、饼干等面点制作过程中，添加适量的重组胰蛋白酶可以使面团中的蛋白质分解成小分子肽和氨基酸，提高面点的柔软度和口感。
另外，在奶制品加工中，重组胰蛋白酶也可以用来促进乳清蛋白的水解，提高乳制品的消化性和营养价值。
重组胰蛋白酶还在生物工程领域有着广泛的应用。
由于其具有较高的催化活性和稳定性，重组胰蛋白酶被广泛用于蛋白质工程和基因工程中的相关研究。
在蛋白质工程中，科学家们可以利用重组胰蛋白酶对目标蛋白质进行酶切，得到特定的片段或产物，从而进行蛋白质结构和功能的研究。
在基因工程中，重组胰蛋白酶可以用于对基因进行定向剪切、连接和修饰等操作，促进基因工程的进展。
总结起来，重组胰蛋白酶作为一种改良的消化酶，在医药领域和食品工业中有着广泛的应用。
它可以作为治疗胰腺功能不全的替代治疗药物，帮助患者消化食物，改善胃肠道症状。
同时，在食品加工中，重组胰蛋白酶可以用来改善食品口感和消化性，提高食品的质量。
此外，重组胰蛋白酶还在生物工程领域有着重要的应用，用于蛋白质工程和基因工程的研究。
随着科学技术的不断进步，相信重组胰蛋白酶将会在更多领域发挥重要作用，为人类的健康和生活质量带来更多的福祉。
Hanks液和胰蛋白酶液配置说明书
Hanks液是常见的平衡盐溶液(BSS)之一。
D-Hanks液则是无钙镁离子的Hanks液。
BS S与细胞生长状态下的pH值、渗透压及无菌状态一致，且配方简单，是组织培养基本用液，常用于配制培养基及其他用液，或洗细胞等，细胞在BSS中可生存几个小时。
胰蛋白酶(胰酸)溶液是一种常用的细胞消化液，原代培养时用于处理组织块，使细胞分离下来。
传代时用胰蛋白酶使培养细胞离开所贴附的培养瓶表面，并分散成单个细胞。
胰蛋白酶主要采自牛或猪的胰脏，呈白色粉末状，易潮解，应在低温干燥处保存。
胰酶的活力常用一份胰酶解离酪蛋白的份数表示，常用胰酶活力为1：125或1：250。
本实验室一般用1：250(GRC公司生产)。
胰蛋白酶对细胞的分离效果与细胞的类型、特性和瓶壁表面特性有关。
一般来说浓度大、温度高(勿高于37℃)、作用时间长，则对细胞分离能力大。
但超过一定程度会损伤细胞，导致细胞传代后不能贴壁或死亡。
胰酶在pH 8.0、37℃时消化能力最强。
溶液中的Ca2+、Mg2+和血清会降低胰酶活力，所以配制胰酶时须用无Ca2+、Mg2+的D-Hanks液。
当消化结束时，可加入少量血清或含血清的培养基以终止胰酶作用。
细胞传代使用的胰酶浓度是0．25％或0．2％。
用于原代细胞培养消化组织块则为0．1％或0．125％。
------ 来自司徙镇强主编〈细胞培养〉（P41页）NaCL--------------- 8.00gKCL --------------- 0.40gCaCL2 ------------- 0.14gMgSO4.7H20 ------0.20gNa2HP04.H2O------ 0.06gKH2PO4 ------------0.06gNaHCO3 ------------0.35g葡萄糖------------- 1.00g酚红--------------- 0.02g加水至1L，用NaHCO3调PH至7.2~7.4Hank's液不能高压，滤膜除菌。
抗原修复方法及注意事项
抗原修复方法及注意事项柠檬酸缓冲液高温高压抗原修复法(强烈推荐)1.适用范围：适用于大量中性福尔马林固定石蜡包埋组织切片的抗原修复。
其效果优于微波修复和直接煮沸修复，使免疫组化结果更加可靠2.仪器设备：市售不锈钢家用压力锅，大小尺寸可根据需要而定(内径18cm为好)；1000-1500w电炉一台；不锈钢或耐高温塑料切片架。
3.所需试剂：0.01m柠檬酸型缓冲液，ph=6.0±0.14.操作步骤：（1）常规组织切片用二甲苯脱蜡，用梯度酒精水合，然后用蒸馏水浸泡使用。
（2）取一定量pH=6.0的柠檬酸盐缓冲液（800-1500ml）放入高压锅中，高温加热至沸腾；将脱蜡和水合的组织切片放在不锈钢或耐高温塑料切片架上，放入沸腾缓冲液中。
盖上锅盖，关闭压力阀，继续加热直到蒸汽喷射，并从蒸汽喷射开始计时。
1-2分钟后，压力罐离开热源并冷却至室温（稍冷后，可在自来水龙头下加速）。
取出载玻片，用蒸馏水清洗两次，然后用PBS（pH=7.2-7.4）清洗两次，每次3分钟（2分钟）×3’。
（3）按照试剂盒的操作步骤操作。
5.注意事项：(1)加热时间长短的控制很重要，从组织切片放入缓冲液到高压锅离开火源的总时间控制在5-8分钟为好，时间过长可能会使染色背景加深。
(2)必须使用不锈钢或耐高温塑料切片架，不能使用铜架，以防缓冲液ph值增高而导致掉片。
(3)高压锅离开火源后必须等缓冲液冷切后，才能把切片取出。
(4)为防止组织脱落，玻片必须经清洁处理后，涂覆poly-l-lysine(（5）缓冲液的用量必须确保所有切片都能被浸泡，使用过的柠檬酸缓冲液不能重复使用。
EDTA抗原热修复1.适用范围：适用于部分中性福尔马林固定、石蜡包埋组织切片的抗原修复。
2.仪器设备：电磁炉、不锈钢锅和耐高温塑料染色架。
3.所需试剂：edta抗原修复液，ph9.04.操作步骤：（1）抗原修复液的配制：根据需要的工作液量，取适量麦新产品mvs-0098，按1:50的比例稀释。
EDTA抗原修复液(50x)
EDTA 抗原修复液(50×)简介：EDTA 抗原修复液(EDTA Antigen Retrieval solution ，50×)是一种常用的抗原修复液，可以有效去除醛类固定试剂导致的蛋白之间的交联，充分暴露石蜡切片等样品中的抗原表位，可以用于石蜡切片、冰冻切片等样品使用多聚甲醛、甲醛或其它醛类试剂固定后的抗原修复。
细胞或组织用多聚甲醛、福尔马林或其它醛类试剂固定后，会导致蛋白之间的交联，遮蔽样品抗原位点，导致免疫染色信号减弱，甚至出现一些假阳性染色结果。
按照每个片子需要10ml 抗原修复液(1×)计算，100ml 抗原修复液(50×)可以用于500个样本的抗原修复。
组成：操作步骤(仅供参考)：(一)石蜡切片1、脱蜡至水①二甲苯3次，每次3～5min 。
②无水乙醇脱水2次，每次3～5min 。
③95%的乙醇，3～5min 。
④90%的乙醇，3～5min 。
⑤80%的乙醇，3～5min 。
⑥70%的乙醇，3～5min 。
⑦蒸馏水冲洗2次，每次3～5min 。
2、抗原修复①用去离子水或双蒸水稀释EDTA Antigen Retrieval solution(50×)至1×。
②将切片浸泡在抗原修复液(1×)中，95℃或沸水加热。
③抗原修复液(1×)使用前需预热。
3、免疫染色洗涤液洗涤1～2次。
4、封闭等后续的免疫染色步骤。
(二)冰冻切片：1、用去离子水或双蒸水稀释EDTA Antigen Retrieval solution(50×)至1×。
编号 名称 IH0304 Storage EDTA Antigen Retrieval solution(50×) 100ml 4℃ 使用说明书 1份2、免疫染色洗涤液洗涤切片5min。
3、将切片浸泡在抗原修复液(1×)中，95℃或沸水加热4、抗原修复液(1×)使用前预热至。
蛋白实验技术——免疫组化实验步骤
蛋白实验技术——免疫组化实验步骤（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉。
2. 水浴锅。
（二）、试剂1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl2.7mmol/L ，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。
2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB，ph6.0，1000ml）：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g。
3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226；2H2O，用10mmol/L NaOH调至ph8.0，加水至1000ml。
4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris 碱，用1N的HCl调至ph8.0，加水1000ml。
5. 酶消化液：a. 0.1%胰蛋白酶：用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。
b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。
7.风裱剂：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（ph9.0–9.5）等量混合 b 油和TBS（PBS）配制。
8．TBS/PBS PH9.0–9.5，适用于荧光纤维镜标本；ph7.0-7.4适合光学纤维标本。
（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟b 无水乙醇中浸泡五分钟c 95%乙醇中浸泡五分钟d 75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：A 抗原热修复a 高压热修复：在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。
将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。
免疫组化实验
免疫组化操作步骤（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2. 水浴锅（二）、试剂1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L.2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。
3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226;2H2O,用10mmol/L NaOH调至ph8.0,加水至1000ml.4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至ph8.0, 加水1000ml。
5. 酶消化液：a. 0.1%胰蛋白酶：用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。
b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制7.风裱剂：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（ph9.0–9.5）等量混合b 油和TBS(PBS)配制8．TBS/PBS PH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟b 无水乙醇中浸泡五分钟c 95%乙醇中浸泡五分钟d 75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：A 抗原热修复a 高压热修复在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。
将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
胰蛋白酶抗原修复液
简介：
组织在制作过程中，由于化学试剂的作用封闭了抗原，又由于热的作用致使部分抗原的肽链发生扭曲，致使在免疫组化的染色过程中不能将其显示出来，为了解决上述的问题，利用化学试剂和热的作用将这些抗原重新暴露出来或修正过来的过程称为抗原修复。
柠檬酸盐、EDTA或Tris等缓冲液在热的条件下可以使被福尔马林屏蔽的抗原重新暴露出来，同时又不会对抗原表位造成破坏，从而提高抗原的检出率，降低背景染色，提高诊断的准确率。
在热诱导抗原修复法出现之前，胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶等酶类的诱导的表位修复是最常用的方法。
Leagene 胃蛋白酶抗原修复液能暴露石蜡切片等样品中的抗原表位，从而大大改善免疫染色效果。
通常石蜡切片都需进行抗原修复处理，而冰冻切片可以不进行抗原修复处理，抗原修复可以提高石蜡切片的免疫染色效果，亦可以不同程度的提高冰冻切片的染色效果。
当冰冻切片免疫染色效果不理想时，可考虑进行抗原修复。
按照每个片子需要10ml抗原修复液(1×)计算，100ml抗原修复液可以用于10个样本的抗原修复。
组成：
自备材料：
1、系列乙醇
2、双蒸水或去离子水
3、加热设备
4、免疫染色洗涤液
操作步骤（仅供参考）：
(一)石蜡切片
1、脱蜡至水
①二甲苯3次，每次3～5min。
②无水乙醇脱水2次，每次3～5min。
③95%的乙醇，3～5min。
编号
名称
IH0310 Storage 胰蛋白酶抗原修复液100ml -20℃使用说明书1份
④90%的乙醇，3～5min。
⑤80%的乙醇，3～5min。
⑥70%的乙醇，3～5min。
⑦蒸馏水冲洗2次，每次3～5min。
2、抗原修复：将切片浸泡在胰蛋白酶抗原修复液中，孵育10～25min。
3、免疫染色洗涤液或自来水洗涤1～2次，每次3～5min，彻底漂洗干净。
4、进行后续的免疫染色步骤。
(二)冰冻切片：
1、免疫染色洗涤液或自来水洗涤切片5min。
2、抗原修复：将切片浸泡在胰蛋白酶抗原修复液中，孵育10～25min。
3、免疫染色洗涤液或自来水洗涤1～2次，每次3～5min，彻底漂洗干净。
4、进行后续的免疫染色步骤。
(三)其它样品：
其它样品参考石蜡切片或冰冻切片进行操作。
注意事项：
1、胰蛋白酶抗原修复液恢复至室温后再使用，但应避免反复冻融。
2、浸泡在胰蛋白酶抗原修复液中，最佳孵育时间需根据不同的样品和目的蛋白自行摸索。
3、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期：12个月有效。
相关：
编号名称
CC0130 胰蛋白酶-EDTA溶液(0.25%:0.02%)
DC0032 Masson三色染色液
DF0111 中性福尔马林固定液(10%)
DJ0001 普鲁士蓝染色液(核固红法)
IH0305 柠檬酸钠抗原修复液(50×)
PE0103 Acr-Bis(30%,29:1)
TC1213 总胆固醇(TC)检测试剂盒(COD-PAP单试剂比色法)。