鳕鱼皮胶原蛋白肽铜螯合物的制备条件

鳕鱼皮胶原蛋白肽铜螯合物的制备条件陈晓刚;陈忻【摘要】为提高鳕鱼皮的附加值，采用正交试验法探讨鳕鱼皮胶原蛋白肽与硫酸铜螯合反应条件，制备鳕鱼皮胶原蛋白肽铜。

结果表明：制备鳕鱼皮胶原蛋白肽螯合铜的最佳条件是胶原蛋白肽与硫酸铜的质量比为3．5∶1，pH 7．0，反应温度50℃，反应时间40 min，该条件下铜离子的螯合率为34．35％。

%The preparation conditions of copper chelate from collagen peptide of cod skin were optimized by the orthogonal design to improve addition value of cod skin.The copper chelation rate from collagen peptide of cod skin under the optimum preparation conditions of 3.5:1 of collagenpeptide/copper sulfate ratio,pH 7.0,50℃ and for 40 min can re ach 34.35%.【期刊名称】《贵州农业科学》【年(卷),期】2015(000)001【总页数】5页(P154-158)【关键词】鳕鱼皮;胶原蛋白肽;铜螯合物;制备条件【作者】陈晓刚;陈忻【作者单位】佛山科学技术学院理学院化学与化工系，广东佛山 528000;佛山科学技术学院理学院化学与化工系，广东佛山 528000【正文语种】中文【中图分类】S986.5;TS254铜是动物体所必需的微量元素之一，在动物体内参与血红蛋白的合成和某些氧化酶的合成与激活。

铜的缺乏会影响动物对铁的利用，从而产生贫血[1]。

铜是饲养动物必需的微量元素，有重要的营养生理功能，同时对动物的免疫系统及抗氧化应激也有强烈影响。

但不同铜源的生物利用效率不同[2]。

铜元素的总利用率较低，但其促进幼小动物生长作用明显，故饲料中铜元素超量添加的情况比较普遍，从而造成动物粪便中铜排泄量高，污染环境以及资源浪费等问题[3]。

因此，寻找一种新型的铜源，促进动物的生长，减少资源的浪费，是人们当前关注的重点。

传统观点认为，蛋白质是一类种族特异性很强的大分子，蛋白质实质上就是氨基酸，蛋白质被消化成游离氨基酸后才能被吸收利用。

但早在1921年Boegland就提出了小肽转运的可能性，由于人们受传统蛋白质消化吸收理论的影响，对小肽完整吸收的观点难以接受。

Newey等[4]在肠道静脉中检测到Gly-Gly的存在，首先提出肽可以被完全转运的确切证据。

Hara等[5]指出，蛋白质在消化道中的消化终产物大部分是小肽，且小肽能完整地通过肠粘膜细胞而进入体循环，随后小肽的I型和Ⅱ型载体分别被克隆。

随着研究的不断深入，小肽能被完整吸收的观点逐渐被人们认识和利用。

目前，在新型的铜源研究上主要采用氨基酸螯合铜离子。

如张小燕[6]和李亚萍[7]以蛋白粉为复合氨基酸源对复合氨基酸铜螯合物的合成工艺条件进行了初步的探讨；王永秋等[8]以L-天门冬氨酸为原料，合成了L-天门冬氨酸螯合铜，运用正交设计试验对影响L-天门冬氨酸螯合铜反应的条件进行研究；梁柏林等[9]以鸡羽毛为原料，用微波法合成了复合氨基酸铜，在微波功率400 W配位比3∶1条件下反应30 min，得到的复合氨基酸螯合率为93.8%；林娜妹等[10]以甘氨酸为原料，与乙酸铜进行室温固相反应得到水合甘氨酸螯合物，所得产物螯合率为98.27%。

但较少见肽螯合铜离子的报道。

小肽能以完整形式被机体吸收进入循环系统，从而被组织利用合成蛋白质或直接成为生理活性物质。

小肽不仅能被小肠粘膜吸收利用，且其合成分子蛋白的速度远远高于氨基酸。

从天然蛋白源制得的肽-铜离子螯合物可以作为食品添加剂、化妆品添加剂、动物饲料和有机肥料等产品应用到工业化生产中，与一些金属离子补充剂比较，无毒副作用，具有更优良的生物学效价，有很大的商业价值[11]。

目前，影响铜离子与肽进行螯合反应的因素有物料的质量比、pH、温度和反应时间等，不同的螯合工艺所得螯合产物的螯合率和理化性质有所差异[12]。

鳕鱼(Gadous macrocephalus)是大型冷水性重要经济鱼，贵食用鱼。

近年来随着我国贸易的发展，大量鳕鱼被加工成冷冻鱼片、鱼段、块冻鱼排出口，加工过程中产生的下脚料鳕鱼皮占加工量的7%～8%，而鳕鱼皮干物质中有胶原蛋白50%以上，目前在处理方面还处于初级阶段[13-15]。

为提高鳕鱼皮的利用率，试验采用正交试验法探讨鳕鱼皮胶原蛋白肽螯合铜的制备工艺，分析胶原蛋白肽与硫酸铜的质量比、pH值、温度等因素对铜螯合物产率影响的变化规律，为鳕鱼皮胶原蛋白肽铜螯合工艺条件研究提供参考，进一步提高鳕鱼皮的高附加值利用，减少环境污染，获得良好的经济效益与社会效益，促进海洋水产品深加工产业的发展。

1.1 材料与仪器试材：鳕鱼皮胶原蛋白肽，由中国科学院海洋生物资源可持续利用重点实验室提供。

试剂：硫酸铜(分析纯，广州化学试剂厂)，1-(2-吡啶偶氮)-2-萘酚(PAN)(分析纯，天津市福晨化学试剂厂，EDTA(分析纯，汕头市化学试剂厂)，无水乙醇(分析纯，天津市永大化学试剂有限公司)，盐酸(分析纯，广州市花红化工厂)，氢氧化钠(分析纯，天津市大茂化学试剂厂)。

仪器：85-2控温磁力搅拌器(江苏医疗仪器厂)，KA-100型台式离心机(上海安亭科学仪器厂)，HH-2数显恒温水浴锅(金坛市富华仪器有限公司)，DELTA320精密pH计(梅特勒-托利多仪器厂)，FA2004N电子天平(上海精密科学仪器有限公司)，SHZ-82A恒温水浴加热装置(金坛市富华仪器有限公司)，722-分光光度计(上海棱光技术有限公司)，60目筛网(浙江省上虞市道墟通用纱筛厂)。

1.2 鳕鱼皮胶原蛋白肽铜螯合物的制备鳕鱼皮胶原蛋白肽→溶解→搅拌调节pH→按比例加入铜盐→控制温度、时间→进行螯合→浓缩→无水乙醇提取，析出沉淀→沉淀静置→抽滤→水蒸气干燥→胶原蛋白肽铜螯合物称取一定量的鳕鱼皮胶原蛋白肽和硫酸铜，置于烧杯中，加入100 mL的蒸馏水，充分混合溶解，进行水浴加热；充分反应后，加适量无水乙醇，抽滤，滤渣于100℃水蒸气下烘干，用研钵研磨产物，过60目筛，称重。

用EDTA络合滴定法测定螯合态铜元素的含量。

1.3 溶液的配制EDTA溶液的配制：称取EDTA 3.722 4 g，用热水溶解，稀释定容至500 mL，放置24～48 h后备用。

0.2%PAN指示剂溶液：将0.2 g PAN[1-(2-吡啶偶氮)-2-萘酚]，溶于乙醇，用乙醇稀释定容至100 mL。

1.4 鳕鱼皮胶原蛋白肽铜螯合物制备的单因素试验1.4.1 最适pH的选择称取8 g鳕鱼皮胶原蛋白肽粉末与2 g的硫酸铜粉末，固定反应温度50℃，反应30 min，控制pH 1～12，设定每一个pH为一个反应控制单元，每个单元反应结束后，于最大吸收波长下测吸光度。

1.4.2 反应温度称取8 g鳕鱼皮胶原蛋白肽粉末与2 g的硫酸铜粉末，固定反应时间30 min和pH 7，控制温度分别为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃和80℃，反应结束后，在最大吸收波长下测定吸光度。

1.4.3 反应时间称取8 g鳕鱼皮胶原蛋白肽粉末与2 g的硫酸铜粉末，固定反应温度50℃和pH 7，控制反应时间从10 min开始，每隔10 min设定一个反应单元。

每个单元反应结束后，在最大吸收波长下测定吸光度。

1.4.4 鳕鱼皮胶原蛋白肽和硫酸铜质量比称取2 g的硫酸铜粉末，分别按照质量比1∶4，1∶3，1∶2，1∶1，2∶1，3∶1，4∶1称取鳕鱼皮胶原蛋白肽粉末，固定反应温度50℃，反应时间30 min和pH 7，每一个质量比为一个反应单元，每个单元反应结束后，在最大吸收波长下测定产物的吸光度。

1.5 鳕鱼皮铜螯合物制备的正交试验在单因素试验结果的基础上，以铜离子的螯合率作为试验评价的首要指标，以产物的吸光度作为试验评价的次要指标，以反应的pH、反应物的质量比、反应温度、反应时间为考察因素(表1)，每个因素4水平，以L16(44)正交表进行试验。

1.6 鳕鱼皮胶原蛋白肽铜螯合物最大吸收波长的确定[16]称取0.1 g的鳕鱼皮胶原蛋白肽铜螯合物，溶于10 mL的蒸馏水中。

采用紫外可见分光光度法，在可见紫外光区400～680 nm扫描，找出最大吸收波长，测量肽铜螯合物的最大吸收波长。

1.7 鳕鱼皮胶原蛋白肽铜螯合物得率的测定[17]准确称取0.30 g鳌合物粉末于250 mL锥形瓶中，加入50 mL水，滴加2～3滴PAN指示剂，用0.02 mol/L EDTA标准溶液滴定，溶液颜色由紫红变为淡黄色即为滴定终点。

铜离子螯合率计算：螯合率螯合率螯合率式中，C为标准EDTA溶液的浓度，mol/L；V为滴定螯合态微量元素所消耗的EDTA溶液体积mL；M为硫酸铜的摩尔质量，g/mol；m为反应物硫酸铜的质量，g。

2.1 鳕鱼皮胶原蛋白肽铜螯合物的最大吸收波长由图1可知，鳕鱼皮胶原蛋白肽铜螯合物的最大吸收波长约为620 nm，反应过程中产物最大吸收波长变化不大，故试验选取620 nm为最大吸收波长。

2.2 不同因素对鳕鱼皮胶原蛋白肽铜螯合物的影响2.2.1 pH 从图2可知，当pH为6.0～8.0时，曲线出现转折点，由此反映在pH 6.0～8.0时螯合反应速度最快。

螯合反应在pH较低的酸性条件下，氢离子与金属离子争夺供电子基团，不利于鳕鱼皮胶原蛋白铜螯合物的形成；在pH值较高的碱性条件下，羟基与供电子基团争夺金属离子而形成氢氧化物沉淀，试验结果与文献[6]描述一致。

因此，鳕鱼皮鳕鱼皮胶原蛋白肽与铜螯合反应的pH宜在6.0～8.0。

2.2.2 反应温度由图2看出，反应温度在50～70℃，螯合反应的效果较好。

这是因为鳕鱼皮胶原蛋白肽与金属离子的螯合反应为吸热反应。

理论上，反应温度越高对反应越有利，但若反应温度太高，反应时间过短将导致反应不彻底，且温度太高容易破坏蛋白肽及其螯合物；若反应温度太低，则螯合反应速度较慢，螯合率较低[18]。

2.2.3 反应时间由图2看出，时间变化对鳕鱼皮胶原蛋白铜螯合反应的影响不如温度和pH明显，表明螯合反应的速度较快。

同时反应时间在30～50 min的吸光度变化不大，因此，反应时间维持在30～50 min的效果较好。

2.2.4 鳕鱼皮胶原蛋白肽和硫酸铜质量比从图2可看出，随着鳕鱼皮胶原蛋白肽质量的增大，螯合率不断增大，但当鳕鱼皮胶原蛋白肽与硫酸铜的质量比为3∶1～4∶1时，螯合率的变化缓慢，相差不大。