高质量的小麦种子总RNA的快速提取方法
如何提取出高质量RNA？一文带你“扫雷”
如何提取出⾼质量RNA？⼀⽂带你“扫雷”RNA，核糖核酸，是动植物细胞、部分病毒及类病毒的遗传信息载体，如今已成为⼤量⽣物学科研⼈员重点研究领域，RNA提取技术作为分⼦⽣物学研究中的基本技术,对研究材料进RT-PCR、cDNA⽂库的构建、蛋⽩质的体外翻译等均需要提取⾼质量的RNA。
然⽽RNA很是“娇弱”，⼀不⼩⼼就会提取失败。
究其原因主要是RNase的内外源性污染。
RNase是⼀种相对稳定遍布我们⽣活的⼀种核酸内切酶，⽐如我们的双⼿、实验仪器、周围环境，甚⾄样品本⾝都有RNase的存在，它能催化RNA⾼效降解,因此能否有效防⽌RNase 的污染，是提取⾼质量RNA的关键。
本⽂以植物为试材, 介绍⼆种常⽤的植物组织RNA的提取⽅法———试剂盒法和trizol法。
在提取RNA之前，准备⼯作是必须要进⾏的，这决定了RNA提取的成败与否。
⼀、仪器准备和消毒⾸先是实验器具和仪器的清理和消毒，需要⽤到的器材和溶液有：研磨棒、研钵（有研磨仪的可不⽤研磨棒和研钵）、剪⼑、镊⼦、钢珠、液氮、RNase free的离⼼管和圆底EP管、DEPC ⽔（1ml DEPC加1000 ml⽆菌⽔）、DEPC处理⽔（DEPC⽔经湿热⾼温灭菌后的⽔）。
将上述的⾦属制品和研磨棒、研钵先⽤0.5mol/L NaOH冲洗⼲净后放⼊DEPC⽔中浸泡过夜，⽤锡箔纸包住，以180°⾼温灭菌4 h，即完成准备⼯作。
⼆、取样从植物取50mg-80mg样品，快速⽤DEPC处理⽔清洗表⾯，将灭菌后的剪⼑和镊⼦将样品剪成⼩块加钢珠装⼊RNase free的圆底EP管中，放⼊液氮罐中以-80°保存预冷。
三、提取⾸先介绍的是试剂盒法，试剂盒法是⼀种由专业试剂⽣产公司⽣产出来装有⼀整套RNA提取试剂的试剂盒⼦，有擎科、天根、TAKALA等众多牌⼦试剂盒，优点是简单快捷⽅便，对于⼩⽩来说易上⼿，缺点是成本⾼，此外试剂盒法主要针对⼤众样品，对于⼀些特殊样品效果可能⼀般。
一种快速高质量植物总RNA提取方法介绍
一种快速高质量植物总RNA提取方法介绍
刘文宝
【期刊名称】《山东蔬菜》
【年(卷),期】2007(000)002
【摘要】植物总RNA的提取方法很多，但是多数步骤烦琐，耗时较长，而且最后RNA的提取质量不高。
采用Trizol法虽然所提RNA的质量较高，但是价格昂贵。
本实验室在长期实践中摸索出一套快速高质量的植物总RNA的提取方法，现介绍如下：
【总页数】1页(P48)
【作者】刘文宝
【作者单位】山东省农业科学院科技开发总公司,济南,250100
【正文语种】中文
【中图分类】S6
【相关文献】
1.一种用于黄曲霉高质量总RNA提取方法与应用 [J], 林剑青;王成成;肖春华;陈国华;贺竹梅
2.活性污泥高质量总RNA提取的一种有效方法 [J], 黎秋华;李平;陈忠正;吴锦华;梁世中
3.棉花高质量总RNA提取的一种有效方法 [J], 窦道龙;王冰山;唐益雄;王志兴;孙敬三
4.半夏块茎高质量总RNA提取的一种有效方法 [J], 黄月琴;徐有明;薛建平
5.油菜种子高质量总RNA提取的一种有效方法 [J], 丁勇;刘英;杨鸯鸯;甘莉
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(完整版)总RNA提取的原理、步骤
总RNA提取的原理、步骤1.原理及方法（异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法）TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中。
当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。
水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。
2.简易步骤细胞或组织，加入0.4ml TRIZOL试剂后匀浆↓室温静置5分钟↓加入1/5 TRIZOL试剂体积量的氯仿，剧烈震荡混匀↓室温静置5分钟，12000g 4℃离心l5分钟↓将上清液转移至新的离心管中，加入与上清液等体积的异丙醇，颠倒混匀↓室温静置10分钟，12000g 4℃离心l0分钟，弃上清↓向沉淀中加入1ml的75%乙醇清洗沉淀，12000g 4℃离心5分钟↓弃上清保留沉淀，干燥↓沉淀物溶解于11μl的DEPC处理水中↓注意：以上操作应在生物安全柜内完成，以防止污染。
注意事项①全程配戴一次性手套。
皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。
培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。
②使用灭菌的，一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA，避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。
③在TRIZOL中，RNA是隔离在RNA酶污染之外的。
而对样品的后续操作会要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。
玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小时。
塑料器皿可以在0.5 M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。
④用TRIZOL抽提RNA时要戴手套和护眼罩。
避免接触皮肤和衣服。
在化学通风橱完成操作。
避免呼吸道吸入。
如无例外，所有的操作应该在15 -30°C的条件下完成，试剂亦在15 -30°C的条件下。
⑤75%乙醇(用DEPC处理过的水配制：将水加入无RNA酶的玻璃瓶中，加入DEPC至0.01% (v/v)。
总RNA的提取及相关实验方法
总RNA的提取（Trizol法提取）在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。
若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。
在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。
1.提取组织RNA时，每50～100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10 ╳106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；2.将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟；3.在上述EP管中，按照每1ml TRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟；4.取上层水相置于新EP管中,按照每1ml TRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放置10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟；5.弃上清，按照每1ml TRIZOL加1ml 75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清；6.让沉淀的RNA在室温下自然干燥；7.用Rnase-free water 溶解RNA沉淀。
PCR实验室常用DNA聚合酶有三种：TaKaRa Taq TM，TaKaRa E X Taq TM和Pyrobest TM DNA Polymerase。
TaKaRa Taq TM是一般的DNA聚合酶，保真性较差，但价钱便宜，一般用于基因表达的检测等。
TaKaRa E X Taq TM是具有Proof reading 活性的耐热性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的PCR产物3’端附有一个“A”碱基，如果希望直接将产物克隆到T-vector可以用此酶。
Pyrobest TM DNA Polymerase也是具有Proof reading活性的耐热性DNA聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的PCR产物为平滑末端。
高质量的小麦种子总RNA的快速提取方法
高质量的小麦种子总RNA的快速提取方法小麦是世界上最重要的粮食和观赏作物之一，其种子中的总RNA是研究其基因表达调控和功能的重要组成部分。
因此，开发一种高质量的小麦种子总RNA的快速提取方法对于小麦基因研究具有重要意义。
本文将介绍一种适用于小麦种子的总RNA提取方法，该方法具有高效性、稳定性和可靠性。
步骤1：材料准备准备小麦种子样品和所需试剂：三氯化锁（CLC）、Tris-HCl缓冲液、氯化钠溶液、乙酰丙儿酮（AAP）等。
步骤2：杀菌处理将采集来的小麦种子用3%CLC溶液进行杀菌处理，不过多地暴露在紫外线下，避免对总RNA的降解。
步骤3：样品研磨将杀菌处理后的小麦种子样品浸泡在液氮中，然后用液态氮研磨成细粉。
步骤4：总RNA提取将研磨粉末加入Tris-HCl缓冲液，加入适量CLC，混合均匀。
然后用3 M氯化钠溶液调节pH值，并加入相同体积的混合液中。
混合液在4℃下孵育20分钟，然后通过低速离心将混合液分为两个相分离层。
将上层液体转移到一个新离心管中。
步骤5：沉淀及洗涤使用等体积的异丙醇将上层液体和等体积氯仿进行沉淀，按照1:1的比例加入混合溶液中。
离心20分钟，然后将上层液静置20分钟。
将上层液体过滤到新管中。
步骤6：沉淀剩余在新管中加入等体积的异丙醇进行沉淀，离心15分钟。
将上层液体倒入洗涤液管中即可。
步骤7：沉淀洗涤使用70%乙醇进行沉淀洗涤，将乙醇缓慢注入离心管中，并离心10分钟。
将上层液体倒入洗涤液管中即可。
步骤8：总RNA溶解最后一次用丙酮溶液洗涤沉淀，将乙醇彻底洗去，然后将离心管中的沉淀用PCA溶液溶解。
通过以上步骤，我们可以得到高质量的小麦种子总RNA。
这种方法具有许多优点，如简单快速、高提取率和优质的RNA产量。
此外，它还具有较强的适应性，可应用于其他植物种子的总RNA提取。
总之，高质量的小麦种子总RNA的快速提取方法对于小麦基因研究具有重要意义。
本文介绍的方法简单高效，可在小麦基因研究和相关领域中得到广泛应用。
小麦总RNA的小量快速提取
小麦总RNA的小量快速提取Abstract: The total RNA was isolated from young roots, stems and leaves of wheat seedlings by CTAB and urea method. The results showed that the total RNA isolated by CTAB method displayed clear bands of 28S rRNA and 18S rRNA on 1% (w/v) agarose gels; the value of A260/A280 approached 2; and RT-PCR analysis demonstrated that total RNA had high quality. Total RNA was successfully isolated from leaves and stems through urea method, but not from roots, indicating that CTAB method is superior to urea method. At the same time, the liquid nitrogen was not used in present study,thus save the cost of experiments.Key words: wheat; total RNA; isolation高质量RNA的提取是分子生物学研究的重要一环,直接影响cDNA文库的构建､基因克隆以及表达分析等｡小麦是重要的农作物,其RNA提取方法较多[1-5]｡尽管这些方法提取的RNA质量较好,但都要使用液氮,提高了试验成本｡本研究采用CTAB和尿素法分别提取小麦幼苗的根､茎和叶组织的总RNA,为小麦总RNA的提取提供了一条新途径｡1 材料与方法1.1植物材料小麦杂交品种郑麦9023购于荆州市农资大市场,播种于温室,在苗期分别取根､茎和叶组织用于RNA的提取｡1.2方法1.2.1RNA提取液成分CTAB法RNA提取液成分:20 g/L CTAB,20 g/L PVP,100 mmol/L Tris-HCl(pH值8.0),25 mmol/L Na2EDTA(pH值8.0),2.0 mol/L NaCl,混匀灭菌,用前每100 mL提取液加入2 mL 2-巯基乙醇｡尿素法RNA提取液成分:7 mol/L 尿素,50 mmol/L Tris-HCl(pH值8.0),10 mmol/L Na2EDTA(pH值8.0),3.5 mol/L NaCl,1 g/L SDS｡1.2.2RNase灭活离心管和移液器吸头用1 mL/L DEPC水浸泡24 h;研钵等用少量的无水乙醇灼烧,然后用锡箔纸包装;Tris试剂用灭菌的1 mL/L DEPC水配制,其他试剂均用未灭菌的1 mL/L DEPC水配制;最后,将以上所有试剂或物品高压灭菌40 min｡1.2.3尿素法提取RNA步骤①取0.2 g材料,加入研钵中,加入2 mL提取液,迅速充分研磨;②快速分装到两支1.5 mL的离心管中,于4℃､12 000 r/min离心15min;③取上清液,加1/3体积的3 mol/L NaAc(pH值5.3),1/5体积的氯仿/异戊醇(24∶1),混匀后冰浴20 min;④于4℃､12 000 r/min离心15 min;⑤取上清液加入等体积冰浴冷却的异丙醇,冰浴10 min;⑥于4℃､5 000 r/min离心10 min;⑦沉淀溶于5 mL含有1g/L SDS的TE缓冲液中,加入8 mol/L LiCl至终浓度2.5 mol/L,冰浴3 h;⑧于4℃､12 000 r/min离心10 min;⑨70%(V/V)乙醇洗涤沉淀两次,空气干燥后溶于DEPC处理水中,保存于-70℃冰箱中备用｡1.2.4CTAB法提取RNA步骤①将提取液置于65℃水浴锅中温浴30 min,将研钵放在烘箱中低温烘热;②取0.2 g材料于研钵中,加入2 mL提取液,迅速充分研磨,然后快速分装到两个1.5 mL离心管中,轻轻混匀,置于65℃水浴锅中10 min;③加入等体积的氯仿/异戊醇,混匀后在4℃,12 000 r/min条件下离心10 min,吸取上清液;④重复上述步骤,并在合并的上清液中加入1/4体积的8 mol/L LiCl溶液并混匀,4℃过夜;⑤4℃ 10 000 r/min离心20 min,弃上清液;⑥加入50 μL的灭菌DEPC 水溶解RNA,再加入1/10 体积的3 mol/L NaAc和2倍体积的无水乙醇,于-70℃放置30 min;⑦于4℃､12 000 r/min离心20 min,弃上清液,用70%(V/V)的乙醇清洗沉淀,吹干后加入30 μL的灭菌DEPC水溶解,保存于-20℃冰箱中备用｡1.2.5总RNA完整性检测1) 琼脂糖凝胶电泳检测:电泳槽用1 mL/L DEPC水浸泡24 h,用1×MOPS作为电泳缓冲液｡取2 μL RNA溶液于10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测,电压为90V｡2)紫外分光光度计检测:取4 μL RNA溶液,用分光光度计测定A260和A280的值｡每种组织取3份RNA溶液样品,求平均值｡3)RT-PCR分析:使用Promega cDNA第一链合成试剂盒,合成cDNA第一链｡反应完成后,将合成产物稀释5倍,取1 μL用于RT-PCR的模板cDNA｡根据小麦actin 基因(AB181991)设计1对引物,左引物为:5′CAAGGCGGAGTACGATGAGT 3′,右引物为:5′TTGTGCCAAAAGGAAAAGCT 3′｡RT-PCR反应体系为25 μL:即10×Taq Buffer 2.5 μL(Transgene公司),2 mmol/L dNTP(Transgene公司)2 μL,Taq酶(5 U/μL)(Transgene公司)0.2 μL,各1 μL的双向引物(0.1 μmol/L),模板cDNA 1 μL,ddH2O 17.3 μL,最后滴1滴液体石蜡油｡PCR扩增程序为:95℃3 min;95℃ 1 min,57℃ 1 min,72℃ 1 min(35个循环);72℃ 10 min; 4℃保存｡RT-PCR扩增产物大小为208 bp,于10g/L琼脂糖凝胶中,120V电泳45 min,然后于凝胶成像系统观察､拍照｡2结果与分析2.1RNA完整性检测尿素法和CTAB法都能从小麦幼嫩的根､茎和叶组织中抽提出总RNA,18SrRNA和28S rRNA条带亮,带型完整性较好,结果如下｡从图1分析得到,CTAB法从小麦幼叶､茎和根组织提取的总RNA,带型清晰,其中叶组织有5条带型,说明叶绿体的总RNA也被提取出来｡从图2可以看出,尿素法提取的总RNA,叶和茎组织的质量较好,根组织的RNA降解比较严重,说明尿素法不适合用于提取小麦幼根组织的总RNA｡两种方法的比较分析表明,CTAB法优于尿素法,适合小麦幼叶､茎和根组织的RNA提取｡2.2RNA纯度检测提取的RNA经分光光度计检测表明,大多数RNA纯度较好,结果如表1｡从表1可以看出,用CTAB法提取的小麦幼苗组织总RNA,A260/A280的比值为1.938~2.000,说明提取的RNA纯度较高,而且得率也较高｡而使用尿素法提取小麦幼苗的叶和茎组织的总RNA,A260/A280的比值介于1.948~1.962,说明提取的总RNA纯度较高,且得率也较高｡但是用尿素法提取的小麦幼苗根的总RNA,A260/A280比值为 1.710,说明RNA纯度较低,得率也较低｡以上结果表明,CTAB法提取小麦幼苗各组织总RNA的效果较好,尿素法适合提取小麦幼苗叶片和茎组织的总RNA,不适合于小麦幼苗根组织总RNA的提取｡2.3RNA质量检测为检测CTAB法提取的RNA质量,分别将幼苗的茎､叶和根组织的总RNA反转录合成cDNA,并进行RT-PCR扩增,结果如图3｡从图3分析得到,RT-PCR技术成功扩增出小麦的叶､茎和根组织中的actin基因,说明CTAB法从小麦幼苗的叶､茎和根组织提取的RNA质量较好,能满足RT-PCR技术的要求｡结果也暗示,使用CTAB法提取的小麦幼苗组织的RNA,能满足Real-time PCR､cDNA文库构建等后续研究的要求｡CTAB法是小麦幼苗各组织RNA提取的理想方法之一｡参考文献:[1] 姚红艳,赵双宜,夏光敏. 改良尿素-氯化锂方法提取成熟小麦种子总RNA[J]. 中国生物工程杂志,2003,23(4):86-88.[2] 龚莉桂,沈龙珠,徐子勤. 小麦总RNA的快速提取[J]. 激光生物学报,2002,11(4):301-304.[3] 崔素萍,康振生,赵杰,等. 一种快速提取小麦叶片总RNA的方法[J]. 西北植物学报,2006,26(2):314-318.[4] 刘颖慧,王天宇. 一种快速大量提取禾谷类作物幼苗期总RNA的方法[J]. 麦类作物学报, 2007,27(2):226-228.[5] 南海波. 小麦总RNA的提取[J]. 渤海大学学报,2006,27(1):18-20.。
介绍一种简单高效的植物总RNA提取方法
介绍一种简单高效的植物总RNA提取方法赵双宜,吴耀荣,夏光敏(山东大学生命科学学院,济南250100)摘 要:在液氮中研磨小麦幼叶和不同发育时期的种子,经含0.1%SDS和0.1%十二烷基肌氨酸钠(LDS)的尿素缓冲液裂解后,醋酸钠和氯仿沉淀变性蛋白质,异丙醇沉淀核酸,溶解后经2.5mol/L LiCl沉淀总RNA,洗涤后就可得到高质量的总RNA,其OD260/OD280为2.05～2.10,28S和18S RNA带清晰,叶片总RNA还可得到23S和16S RNA带,产率可达5mg RNA/10g材料。
当使用含1%SDS和1%LDS的尿素缓冲液裂解材料时,则可用于DNA 的分离提取,其分子大小可达50～100kb以上。
关键词:植物RNA分离提取;尿素;氯化锂中图分类号:R522 文献标识码:A 文章编号:0253-9772(2002)03-0337-02Introduction of a Simple and E ffective Methodfor Plant Totle RNA IsolationZHAO Shuang2yi,WU Yao2rong,XIA Guang2min(School of L if e Sciences,S handong U niversity,Ji nan250100,Chi na)Abstract:Wheat leaf and seeds at different development stages had been squashed in liquid nitrogen,then lysised by urea buffer which contains0.1%SDS and0.1%LDS,denaturedprotein had been removed by NaAc and chloroform precipita2 tion,total RNA was further purified by LiCl.The RNA we obtained had shar p bands of28S and18S after agarose gel elec2 trophoresis,23S and16S RNA bands can als o be seen clearl y in leaf RNA extract,the value of OD260/OD280of RNA was2105～2110.5mg RNA can been is olated from10g leaf of wheat.This method can als o been used in high molecular weight DNA is ola2 tion but the concentration of SDS and LDS must be increased to1%.K ey w ords:plant RNA isolation;urea;LiCl 在对植物材料的mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)、Northern印迹、3′-RACE和5′-RACE,特别是高质量cD2 NA文库的构建需要从不同发育阶段的组织中提取高质量的RNA,而未降解的总RNA的提取是其首要的条件[1],虽然现在可以利用异硫氰酸胍、盐酸胍和商品化的试剂盒分离植物总RNA,但异硫氰酸胍和试剂盒价格昂贵,且操作稍有不慎,所分离的RNA就可能发生降解,造成28S和18S带模糊和扩散,难以满足实验的要求。
rna提取的流程和方法
rna提取的流程和方法RNA提取的流程和方法一、RNA 提取流程1、实验准备在RNA提取前，需要准备一些实验用品，如RNA提取试剂盒、干净的Eppendorf管、试剂管盒等。
2、组织采集从实验材料（如组织）中采集适量样品，将其添加到实验管中，并用恰当的液体（如液氮）固定。
3、细胞分离和消化将固定过的样品放置在消化槽中，并加入相应蛋白酶（常用的蛋白酶有 Protease、 DNase I 等）。
待消化完成后，细胞就可以分离出来，得到小分子和线粒体RNA。
4、细胞悬液处理细胞和消化液将放置在分离机中，以速度较快的离心来分离细胞悬液和上清液，获得纯净的细胞悬液，以及细胞内的RNA。
5、病毒筛选针对实验中可能存在的病毒，在RNA提取后期，可以采用专门的病毒筛选技术来检测病毒的存在与否，用以保证实验结果的可靠性。
6、RNA 提取利用加热或冷冻方法来预处理细胞悬液，再加入性质非常活跃的提取试剂，分离出RNA，最后经酶抑制剂处理，即可实现RNA的提取。
7、RNA 质量检测采用实时定量荧光PCR（qPCR）或定量实时荧光 PCR（qRT-PCR）技术，对提取出来的RNA进行质量检测，以确定RNA的质量是否满足后续研究的要求。
8、实验结束实验完成后，将所有的实验用品清洗干净，并完成实验报告记录和记录实验结果，结束实验。
二、RNA 提取方法1、常规方法（1）分离法利用细胞成分的不同溶解度，将细胞内的RNA和DNA分离出来，如甲醇分离法、混合洗涤法、膜过滤法等，然后将DNA除去，即可得到纯化的RNA样品。
（2）磁珠法采用特定的磁珠技术，通过磁场的作用，将RNA结合在磁珠上，然后加入洗涤液，脱除磁珠上的杂质和有害物质，最终得到纯化的RNA样品。
2、新型方法（1）多尺度细胞抗分离法利用细胞的多尺度的抗性，通过不同直径的磁珠把细胞内的RNA 分离出来，可以节约实验时间，并有效提高细胞内RNA的收量、纯度和活性。
（2）膜过滤法采用膜过滤的方法，可以快速准确的将细胞内的RNA纯化，提高RNA的收率，并保护RNA免受外界环境的破坏，为实验提供良好的保护条件。
总RNA的提取及纯化
总RNA的提取及纯化(用于小规模提取rna)实验前的注意事项及准备过程?植物材料量的正确估计，这不仅关系到rna的提取量，还直接影响到下一步rna的纯化质量。
?实验器皿应用depc水或高温处理提取总rna(用invitrogen的trizol提取液)：1.搜集100-200mg非政府,用液氮将非政府材料充份研磨成粉末。
2.待液氮挥发干,立即加入trizol提取液,每100-200mg组织中加入1ml的trizol提取液，涡旋使样品充分裂解，室温放置5分钟。
3.重新加入0.2ml乙醚(chloroform)频繁震荡搅匀15秒钟,室温置放10分钟。
4.4℃，12000rpmVergt10min，迁移上清至代莱2ml的离心管,重新加入0.5ml(或0.5×已经开始体积)的rnase-free水,再重新加入1ml的异丙醇(1:1体积)，充份搅匀,室温置放10分钟结晶。
5.4℃，12000rpm离心10min，去除上清1，沉淀中加入1ml75%的乙醇洗涤rna沉淀，4℃，8000rpm离心15min。
6.去上清，小心不要搅乱结晶，rna空气中晒干约10-15分钟2，重新加入100?l体积的rnase-free水充份熔化3.(兵乓球于-80oc长期留存)。
7.用紫外分光光度计4，5及1%agrose电泳胶检测rna浓度及质量。
（通常产量是1g叶组织可以提取出500μgrna）注意事项:1.异丙醇结晶样品Vergt后勿将灵宝死掉，先将其留存于一整洁的ep管中。
2.潮湿rna时不须要太干，室温置放15分钟即可，中间可以轻弹管底，并使残余液体弹头至管壁上，推动液体尽快溶解。
3.熔化rna样品时先摇铃ep管，等待样品全溶后用枪反反复复吹起喷，并使其充份搅匀。
4.测od值时必须每个样品读数3次，挑平均值。
5.样品260nm/280nm比值的多寡与熔化rna的水有关，如果以te为稀释液展开紫外检测，260nm/280nm比值可以更吻合1.9～2.1。
改良的小麦总RNA的提取
改良的Trizol法提取小麦RNA孔版小麦由于富含淀粉、糖类、蛋白质等杂质，在采用传统的Trizol法提取总RNA 过程中，这些物质很容易和RNA一起离心共沉淀下来，严重影响RNA的纯度和产率。
在加入Trizol后增加了一步简短的离心，可以帮助去掉一些无法降解的组织，比如纤维和杂质之类，然后取上清再加入氯仿，可以帮助提高氯仿的效率。
然后就是在加入Trizol后，可以将裂解液放到-80冻存半小时以上，冻融过程中可以再次帮助更加充分的裂解细胞，分离蛋白和RNA。
以及氯仿多次抽提，去除杂质。
Trizol法(基本就是酸性酚抽提法)Trizol中主要有酚，异硫氰酸胍和β-巯基乙醇，一般的trizol试剂在4℃下是油状悬浮液，提高温度，放置一段时间，自然也会分相。
酚能使核蛋白质与核酸解聚，酚可有效的变性蛋白质，但它不能完全抑制RNA酶活性，可与氯仿联合使用增强对RNase的抑制。
异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离，抑制细胞释放出的核酸酶，大大降RNA降解。
β-巯基乙醇主要破坏RNase 蛋白质中的二硫键。
氯仿虽然有变性蛋白质的作用，但是其主要用处是用来分相，实际上是加速有机相和水相的分层。
上层水相，PH 5.1左右，当溶液pH在酸性的时候，DNA 分子就会沉淀在酚与溶液的界面，只有RNA分子留在水相。
而当pH接近中性时，DNA就会溶解在水相，（导致PH中性的大概原因是trizol与样品比例不对，应该尽量保证提取量的前提下使trizol过量）在氯仿中加入少许异戊醇可以减少蛋白质变性操作过程中的气泡，促进分层。
氯仿还可以去除植物色素和蔗糖以及核酸溶液中的酚和抽提过程中的酚。
异丙醇沉淀，优点是容积小且速度快，主要沉淀DNA和大分子rRNA和mRNA，对5sRNA、tRNA及多糖不产生沉淀，所以RNA电泳的标志性三条带中5sRNA带很不清楚，未必是你的RNA降解。
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供试材料为小麦品种济南 １７、豫麦 ３４，２００４ 年 分光光度计检测。
冬种植于中国农业科学院作物科学研究所温室。每 个材料有开花后 １５ｄ 高温胁迫处理和对照、３０ｄ 高温 胁迫处理和对照共 ４ 个样本。
１．２ 主要试剂
１．４ 总 ＲＮＡ 的纯化
（１）总 ＲＮＡ ２５μｇ 加入 １０×Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ １０￣２０μｌ 再加入 ＤＮＡａｓｅ （１Ｕ／μｌ） ３０μｌ，加 ＤＥＰＣ－Ｈ２Ｏ 补足至 １００μｌ。３７℃，３０ｍｉｎ。
Ｍ６１０１），Ｍ－ＭＬＶ 反转录试剂盒为 ＴａＫａＲａ 公司产品 和酚：氯仿：异戊醇，旋涡振荡 ３ｍｉｎ。冰上静置 １０ｍｉｎ。
（编号 Ｄ６１３０），其他试剂均为国产分析纯试剂。
１４ ０００ｒ／ｍｉｎ，４℃，离心 ５ｍｉｎ。取上清到另一个 ２ｍｌ 离
提取缓冲液（１０ｍｌ）：７ｍｌ ＤＥＰＣ－Ｈ２Ｏ 中加入 ０．５ｍｌ 心管用 ５００μｌ 体积比为 ２４：１ 的氯仿：异戊醇，旋涡振 １ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ （ｐＨ９．０）、１ｍｌ ２ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１ｍｌ １０％ ＳＤＳ、 荡 ３ｍｉｎ。１４ ０００ｒ／ｍｉｎ，４℃，离心 ５ｍｉｎ。
摘 要 提取高质量的ＲＮＡ 是从基因表达水平上研究小麦种子发育的必要条件。现有提取方法难以快速得 到高纯度的小麦种子总 ＲＮＡ。本试验将冷酚法和 Ｔｒｉｚｏｌ 一步法相结合，在 ５ｈ 左右就可得到高质量的总 ＲＮＡ。通过琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计检测，提取的总 ＲＮＡ 具有清晰的 ２８Ｓ ｒＲＮＡ、１８Ｓ ｒＲＮＡ 条带， ＯＤ２６０／ＤＯ２８０ 比值在 １．９０￣２．００ 之间。将提取的总 ＲＮＡ 用于反转录，可获得高质量的 ｃＤＮＡ，在 ｃＤＮＡ－ＡＦＬＰ 分析上可得到清晰的条带。说明这种方法获得的总 ＲＮＡ 纯度和完整度非常高，完全满足分子生物学研究的 要求。 关键词 小麦种子， 总 ＲＮＡ 提取
１．２５ｍｌ （２．５ 倍体积）无水乙醇和 ５０μｌ （１／１０ 倍体积） ３ｍｏｌ／Ｌ 的 醋 酸 钠 （ｐＨ５．２）。 旋 涡 振 荡 １ｍｉｎ， 并 在 －８０℃放置 ３ｈ。
２ 结果与分析
２．１ 总 ＲＮＡ 琼脂糖胶电泳检测
（４） １４ ０００ｒ／ｍｉｎ，４℃，离心 ２０ｍｉｎ。弃上清，加入 １ｍｌ ７０％乙醇，轻轻摇动离心管以悬浮洗涤沉淀。短 时离心，弃上清，真空抽干。加入 ５０μｌ ＤＥＰＣ－Ｈ２Ｏ，充
为了研究不同发育时期小麦种子的基因表达情 代谢产物，且在成熟种子中 ＲＮａｓｅ 的活性较高，严重
பைடு நூலகம்
况，提取高质量的 ＲＮＡ 是进行后续研究的重要前提。 干扰了 ＲＮＡ 的提取，利用常规的提取方法或试剂盒
高质量的总 ＲＮＡ 是 ｃＤＮＡ 构建、ｃＤＮＡ－ＡＦＬＰ、 难以得到高纯度的 ＲＮＡ。其他的改良方法也存在试
法、异硫氰酸胍法和 ＣＴＡＢ 法（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９９３）等， 我们将冷酚法和 Ｔｒｉｚｏｌ 试剂一步法相结合并加以改
也有许多适用于植物组织 ＲＮＡ 提取的试剂盒。由于 进，在 ５ｈ 左右就可获得高质量的总 ＲＮＡ，其纯度、
灌浆期种子含有大量的多糖、蛋白质以及其他次生 完整度都非常高，完全可以满足进一步实验要求。
Ａ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｒａｐｉｄ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｉｇｈ－Ｑｕａｌｉｔｙ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｆｒｏｍ Ｗｈｅａｔ Ｓｅｅｄｓ
Ｌｉ Ｈａｏ１，２ Ｚｈａｎｇ Ｐｉｎｇｐｉｎｇ２，３ Ｚｈａ Ｘｉａｎｇｄｏｎｇ１ Ｈｅ Ｚｈｏｎｇｈｕ２，４ Ｘｉａ Ｘｉａｎｃｈｕｎ２＊
１ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ａｎｈｕｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ａｎｈｕｉ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｅｃｏ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｂｉｏ－ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ， Ｈｅｆｅｉ， ２３００３９； ２ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｗｈｅａｔ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｂｅｉｊｉｎｇ， １０００８１； ３ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ， ４３００７０； ４ ＣＩＭＭＹＴ Ｃｈｉｎａ Ｏｆｆｉｃｅ， Ｂｅｉｊｉｎｇ， １０００８１ ＊ Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ， ｘｉａｘｉａｎｃｈｕｎ＠ｃａａｓ．ｎｅｔ．ｃｎ
（２）加 ０．５ｍｌ 体积比为 ４９：４９：２ 的水饱和酚：氯仿： 异戊醇，旋涡振荡 ３￣５ｍｉｎ。１４ ０００ｒ／ｍｉｎ，４℃，离心 ５ｍｉｎ。取 ０．５ｍｌ 上清到另一个 ２ｍｌ 离心管。加 １ｍｌ Ｔｒｉｚｏｌ，旋涡振荡 ３￣５ｍｉｎ。加 ０．２ｍｌ 氯仿，旋涡振荡 ３￣５ｍｉｎ。１４ ０００ｒ／ｍｉｎ，４℃，离心 ５ｍｉｎ。取 ０．７５ｍｌ 上清 到另一个 ２ｍｌ 离心管。加 ０．５ｍｌ 氯仿，旋涡振荡 ３￣５ｍｉｎ。１４ ０００ｒ／ｍｉｎ，４℃，离心 ５ｍｉｎ。
从电泳结果可看出（图 １），加样孔中没有明显的 亮带，说明蛋白质污染很少。总 ＲＮＡ 的 ２８Ｓ ｒＲＮＡ 和 １８Ｓ ｒＲＮＡ 条带清晰，且两个条带的亮度呈明显 ２：１
分旋涡溶解。
倍比关系；溴酚蓝前面的 ５Ｓ 条带很弱，说明总 ＲＮＡ
其他所有溶液均用 ０．１％ ＤＥＰＣ 处理后高压灭菌。研
（４） １４ ０００ｒ／ｍｉｎ，４℃，离心 １５ ｍｉｎ。弃上清，加
钵和玻璃器皿锡纸包裹，２００℃烘烤 ４ｈ 以上。枪头、 入 １ｍｌ ７０％乙醇，轻轻摇动离心管以悬浮洗涤沉
离心管等均用 ０．１％ ＤＥＰＣ 水浸泡过夜后高压灭菌。 淀，１４ ０００ｒ／ｍｉｎ，４℃，离心 ５ｍｉｎ。弃上清，真空抽干。
０．４ｍｌ ０．５ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、０．１ｍｌ １ｍｏｌ／Ｌ ＤＴＴ，每次现用现
（３）取 ５００μｌ 上清到另一个 ２ｍｌ 离心管加 １．２５ｍｌ
配，混匀后冰浴（陈星等， ２００５； 李宏和王新力， １９９９）。 （２．５ 倍体积）无水乙醇和 ５０μｌ （１／１０ 倍体积） ３ｍｏｌ／Ｌ 的
Ｔｒｉｓ 溶液用高压灭菌的 ＤＥＰＣ－Ｈ２Ｏ 直接配制， 醋酸钠（ｐＨ５．２）。旋涡振荡 １ｍｉｎ，并在 －８０℃放置 ３ｈ。
ＲＴ－ＰＣＲ、ＤＤＲＴ－ＰＣＲ、ＳＳＨ 分析等研究工作的基础。 剂复杂、步骤繁琐、提取时间较长等缺点（龚莉桂等，
目前常用的提取 ＲＮＡ 的方法有 Ｔｒｉｚｏｌ 试剂一 ２００２； 姚红艳等， ２００３； 赵双宜等， ２００２）。
步法（于冰等， ２００４）、冷酚法（奥斯伯等， １９９８）、热酚
为了缩短提取时间，简化步骤，降低实验成本，
Ｔｒｉｚｏｌ 为 Ｓｉｇｍａ 公 司 产 品 （ 编 号 Ｔ９４２４），
（２）加 ３０μｌ ＤＮＡａｓｅ 的 Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，静置 ２ｍｉｎ。
ＲＮＡａｓｅ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡａｓｅ 为 Ｐｒｏｍｅｇａ 公 司 产 品 （ 编 号 加水补足至 ５００μｌ，加 ５００μｌ 体积比为 ４９：４９：２ 的水饱
李浩 １，２ 张平平２，３ 查向东 １ 何中虎 ２，４ 夏先春 ２＊
１ 安徽大学生命科学学院， 安徽省生态工程与生物技术重点实验室， 合肥， ２３００３９； ２ 中国农业科学院作物科学研究所， 国家小麦改良中心， 北 京， １０００８１； ３ 华中农业大学植物科技学院， 武汉， ４３００７０； ４ 国际玉米小麦改良中心中国办事处， 北京， １０００８１ ＊ 通讯作者， ｘｉａｘｉａｎｃｈｕｎ＠ｃａａｓ．ｎｅｔ．ｃｎ
分子植物育种 ８７８ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｂｒｅｅｄｉｎｇ
１ 材料与方法
ｂｕｆｆｅｒ，１．２％琼脂糖凝胶，１５Ｖ／ｃｍ 电泳 １５ｍｉｎ，溴化乙
１．１ 植物材料
锭染色 １０ｍｉｎ，在 Ｑｕａｌｉｔｙ Ｏｎｅ 凝胶成像系统下拍照。 （６）取 ２μｌ 总 ＲＮＡ 溶液加入 ２ｍｌ 水，混匀，紫外
Ａｂｓｔｒ ａｃｔ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｑｕａｌｉｔｙ ＲＮＡ ｉｓ ａ ｐｒｅｒｅｑｕｉｓｉｔｅ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｗｈｅａｔ ｓｅｅｄｓ ａｔ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｘ－ ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ． Ｒａｐｉｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ－ｑｕａｌｉｔｙ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｆｒｏｍ ｗｈｅａｔ ｓｅｅｄｓ ｉｓ ｄｉｆｆｉｃｕｌｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｒｅｐｏｒｔｅｄ ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ． Ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔｕｄｙ， ｃｏｌｄ ｐｈｅｎｏｌｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ｔｒｉｚｏｌ ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｅｐ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｆｏｒ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ， ａｎｄ ｈｉｇｈ－ｑｕａｌｉｔｙ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｉｎ ａｂｏｕｔ ｆｉｖｅ ｈｏｕｒｓ． Ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｗａｓ ａｎａ－ ｌｙｚｅｄ ｗｉｔｈ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎｄ ＵＶ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ． Ｃｌｅａｒ ｂａｎｄｓ ｏｆ ２８Ｓ ｒＲＮＡ ａｎｄ １８Ｓ ｒＲＮＡ ｗｅｒｅ ｓｈｏｗｎ ｉｎ ｔｈｅ ＲＮＡ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ａｎｄ ｔｈｅ ｖａｌｕｅ ｏｆ ＯＤ２６０／ＯＤ２８０ ｗａｓ １．９０ ｔｏ ２．００． Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ， ｈｉｇｈ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｃＤＮＡ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ， ａｎｄ ｃｌｅａｒ ｂａｎｄｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔ ｃＤＮＡ－ＡＦＬＰ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｔｈｅｓｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｕｒｉｔｙ ａｎｄ ｉｎｔｅｇｒａｌｉｔｙ ｏｆ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｓａｔｉｓｆａｃｔｏｒｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｍａｎｄｓ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ． Ｋｅｙｗｏｒ ｄｓ Ｗｈｅａｔ ｓｅｅｄｓ， Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ