基因工程的基本原理和技术-完整版
第1节基因工程的基本原理和技术
一、基因工程的工具
二、基因工程的操作步骤
类型检测内容方法结果显示
二、例题及练习
【典例1】►(2011·浙江卷)将ada(腺苷酸脱氨酶基因)通过质粒pET28b导入大肠杆菌并成功表达腺苷酸脱氨酶。
下列叙述错误的是()。
A．每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒
B．每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点
C．每个限制性核酸内切酶识别位点至少插入一个ada
D．每个插入的ada至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子
【训练1】►下列有关基因工程中限制性核酸内切酶的描述，错误的是()。
A．一种限制性核酸内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列
B．限制性核酸内切酶的活性受温度影响
C．限制性核酸内切酶能识别和切割RNA
D．限制性核酸内切酶可从原核生物中提取。
基因工程基本工作原理
基因工程基本工作原理
基因工程是一种通过改变生物体的基因来改变其性状和功能的技术。
基本工作原理包括以下几个步骤：
1. 选取目标基因：确定想要改变的性状或功能，并找到与其相关的基因序列。
2. 获得DNA序列：获取包含目标基因的DNA序列，可以通
过从细胞中分离DNA或使用现有的DNA库等方法来获得。
3. 基因克隆：将目标基因的DNA序列插入到一个DNA载体（如质粒）中。
质粒是一种环状DNA分子，可以在细胞中自
我复制。
4. DNA转化：将载有目标基因的质粒导入细胞中。
这可以通
过多种方法实现，例如化学处理、电穿孔或使用病毒载体等。
5. 基因整合：目标基因被细胞摄取后，可以将其整合到细胞的染色体中。
这个过程中，目标基因会与宿主DNA进行互补配对，并与染色体连接成一条连续的DNA链。
6. 表达和转录：一旦目标基因被整合到细胞的染色体中，细胞可以开始利用这个基因来合成特定的蛋白质。
这个过程涉及到基因的转录（将DNA转录成RNA）和翻译（将RNA转化为
蛋白质）。
通过以上步骤，基因工程可以实现对生物体基因的改造和定制，
从而赋予其新的性状和功能。
这项技术在农业、医学、工业等领域有着广泛的应用，例如改良作物、生产药物和生物材料等。
基因工程(基因工程的主要技术与原理分子杂交技术)
Southern杂交主要用来判断某 一生物样品中是否存在某一基因， 以及该基因所在的限制性酶切片 段的大小。（DNA水平）
Southern杂交也可检测目的基 因的拷贝数。
CK 1 2 3 4 5
Southern bloting
这种检测方法与其它免疫学方法的不同是，一方面 可以避免非特异性的免疫反应，而且更关键的是可以 检测出目标蛋白质的分子量，从而直观的在滤膜上显 示出目标蛋白。
五、Dot blot hybridization
1、原理：
在Southern杂交的基础上发展起来的用于 快速检测特异核酸分子的杂交技术。将核酸 样品直接转移到适当的滤膜上，然后进行杂 交检测。
凝胶
3）转移并固定到滤膜上
通过毛细管渗吸或电转移或真空转移的方式，将凝 胶上的DNA转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上。最后 通过80℃处理或紫外线照射将DNA固定在滤膜上。
Southern blotting 装置示意图
4）探针的制备及杂交
预杂交：将结合了DNA分子的滤膜先与特定的预 杂液进行预杂交，也就是将滤膜的空白处用鱼精 DNA或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜 本身对探针的吸附。
当用一个标记的核酸分子与核酸样品杂交, 便可查明该样品中是否存在与该标记核酸分 子具有同源性的核酸分子。这个标记的核酸 分子称为探针(probe)，可以是DNA，也可以 是RNA，或合成的寡核苷酸。
二、基本过程
1、核酸印迹（Nucleic acid blotting): 将核酸样品（DNA、RNA或蛋白质）在凝胶
在1975年，由英国的E. Southern首先设计发明的， 因此又称为Southern杂交（Southern blotting)。
基因工程的原理和技术
合成子链的原料
DNA聚合酶
催化合成DNA子链
引物
使DNA聚合酶能够从3’端开始连接 脱氧核苷酸
PCR技术依据的原理：
DNA双链复制的原理（遵循碱基互补配对原则） DNA热变性的原理 前提条件：有一段已知目的基因的核苷酸序列
基本条件：
• 含待扩增目的基因片段的DNA模板； • 根据目的基因双链各一端序列片段合成
如：抗虫基因、抗病基因、人胰岛素基因、人干扰素基因等
基因工程的操作步骤
❖第一步：获取目的基因 （1）目的基因：
主要是指编码蛋白质的基因,例如，与生物抗 逆性相关的基因、与优良品质、生物药物和 保健品、毒物降解以及工业用酶相关的基因 等，也可以是一些具有调控作用的因子。
基因工程的操作步骤
❖第一步：获取目的基因 从生物中直接获取
④目的基因的检测与鉴定。
含有目的基因的表达载体只有进入受体细胞,并且维 持稳定和表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物 中的转化。
❖第三步：将目的基因导入受体细胞 ——转化
转化：目的基因进入受体细胞内,并在受体 细胞中维持稳定和表达的过程，称为转化
• 将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
基因操作的基本步骤
1. 提取目的基因 2. 目的基因与运载体结合 基因表达载体的构建 3.将目的基因导入受体细胞 4.目的基因的检测与鉴定
温故知新 基因工程的操作步骤
①目的基因的获取； ②表达载体的构建；
为什么要有这一步
③将目的基因导入受体细胞；
④目的基因的检测与鉴定。
基因工程的原理：“按照人们的愿望,进行严格的设计， 通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗 传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物 产品。
基因工程的原理和技术
基因工程的基本原理：
让人们感兴趣的基因（即目的基因）在宿主细 胞中稳定和高效的表达。根据不同的实验目的，目 的基因可以有很多种，如抗虫基因、抗病基因、抗 除草剂基因、人胰岛素基因和人干扰素基因等。因 此表达的产物各不相同。通过基因工程的基本操作 ，就能实现目标。
二、基因操作的基本步骤
第三步：将目的基因导入受体细胞
选择的关键是分析基因工程的最终目的，按转基因的目的来选择：
基因工程的 最终目的
得到大量特 殊蛋白质
得到转基因动物 得到转基因植物
常用的受 体细胞
大肠杆菌 等微生物
受精卵 植物体细胞
导入的方法
Ca2＋处理法 显微注射法 农杆菌转化法
将目的基因导入微生物细胞
常选细菌 作受体细胞的原因：它 们繁殖力极强，生长速 度很快，短期内就会产 生大量后代，所以把目 的基因转入这些细菌， 就能在短时间内得到大 量的目的基因产物。
细菌的检测：
将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中 是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的 菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。
无表达产物
无表达产物
有表达产物
无表达产物
多细胞生物的检测： 将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体， 检测这些个体是否表现出相应的性状。
例：抗虫棉检测
用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不 出现中毒症状，说明未摄入目的基 因或摄入目的基因未表达。
例：下列有关基因表达载体的构建说法正确的是( C ) A．限制性核酸内切酶的功能是切割各种DNA分子 B．基因工程中经常用到的酶只有DNA连接酶和限制性 核酸内切酶 C．将目的基因与载体结合的过程，实际上就是不同来 源的DNA重新组合的过程 D．具有粘性末端的目的基因片段插入质粒的切口处， 先形成磷酸二酯键，再形成氢键
基因工程基本原理及技术
【知识点】高中生物：基因工程核心知识汇总基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
一、基因工程的概念基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，又叫做DNA重组技术。
二、基因工程的原理及技术● 原理：基因重组技术● 基因工程的基本工具1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶(限制酶)(1)来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的。
(2)功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，因此具有专一性。
(3)结果：经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端。
2.“分子缝合针”——DNA连接酶(1)两种DNA连接酶(E•coliDNA连接酶和T4DNA连接酶)的比较：①相同点：都缝合磷酸二酯键。
②区别：E•coliDNA连接酶来源于T4噬菌体，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来;而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。
(2)与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯键。
DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
3.“分子运输车”——载体(1)载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保存。
②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。
③具有标记基因，供重组DNA的鉴定和选择。
(2)最常用的载体是质粒：它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌染色体之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。
(3)其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒● 基因工程的基本操作程序第一步：目的基因的获取1.目的基因是指：编码蛋白质的结构基因。
基因工程的原理及技术
基因工程的原理及技术导言基因工程是一门重要的生物学分支，通过改变生物体内的基因组成，使其具有特定的性状和功能。
随着基因工程领域的不断发展，人类已经可以利用基因工程技术来改良农作物、研发新药、治疗基因疾病等。
本文将介绍基因工程的基本原理和常用技术。
基本原理基因是生物体内控制遗传信息的载体，基因工程的核心原理是通过改变特定基因的组成及其表达方式来改变生物体的性状和功能。
基因工程的基本原理包括以下几个方面：1.基因克隆：基因克隆是基因工程的重要手段之一。
通过将特定基因从一个生物体中剪切出来，并将其插入另一个生物体的染色体中，实现对目标基因的复制和表达。
常用的基因克隆方法包括限制性内切酶切割和连接、PCR 扩增等。
2.DNA序列分析：DNA序列分析是基因工程研究的基础。
通过对基因组DNA的测序和分析，可以对基因的结构、功能和调控进行深入研究。
DNA 序列分析常用的技术包括Sanger测序、高通量测序、基因芯片等。
3.基因敲除和突变：通过基因敲除和突变技术，可以特异性地删除或改变目标基因，从而观察其对生物体性状和功能的影响。
常用的基因敲除和突变技术包括RNA干扰、CRISPR-Cas9系统等。
4.基因表达和调控：基因的表达和调控是生物体内基因功能发挥的关键环节。
基因工程可以通过改变基因的启动子、增强子等序列，实现对基因表达和调控的精确操控。
常用的基因表达和调控技术包括质粒转染、转基因技术等。
常用技术基因工程领域有多种常用技术，以下列举几个代表性的技术：1.质粒转染技术：质粒转染技术是一种常用的基因工程技术，通过将外源基因表达载体（质粒）导入宿主细胞，实现基因的表达和功能研究。
该技术广泛应用于基因治疗、农作物遗传改良、疫苗研发等领域。
2.转基因技术：转基因技术是将外源基因导入到目标生物体中，实现特定性状的引入或改良。
转基因技术在农作物育种和药物研发中发挥了重要作用，成功开发出了多种转基因作物和转基因药物。
3.CRISPR-Cas9系统：CRISPR-Cas9系统是一种先进的基因编辑技术，具有高效、精确和可编程的特点。
基因工程精选全文完整版
– 可直接表达不含任何原核序列的外源 蛋白（原核表达载体）
– 以融合蛋白的形式进行表达（原核基 因融合表达载体）
表达载体
真核表达载体含有：
– 原核基因序列 – 真核转录单位
真核表达载体：有两类
– 不带病毒复制子 – 带病毒复制子
质粒（plasmid）
存在于细菌等细胞质中 双链环状DNA分子 大约 1-200 Kb 具有自主复制和转录能力 不能独立存活 在子细胞中保持恒定的拷贝数 并表达其遗传信息
质粒（plasmid）
在细胞内的复制分两种类型
严密控制型
松弛控制型
(stringent control) (relaxed control)
基因工程操作流程
基因重组示意图
基因工程上游技术基本过程
选择载体 获得目的基因 目的基因与载体的重组 重组载体的转化 重组子的筛选与鉴定
载体（vector）
质粒（plasmid） 噬菌体（phage） 病毒（virus）
载体的条件
分子小（ 10 Kb） 有限制酶酶切位点 可自主复制 有足够的copy数 带筛选的标志
法将允许克隆人体器官
法国总理若斯潘（2000年9月28日） 表示：
– 法国政府将允许对人体器官克隆技术 进行用于医疗目的的研究
基因工程技术
上游技术（upstream）
– 重组子的构建 – 工程菌的构建及高效表达
下游技术（downstream）
– 工程菌大规模发酵最佳参数的确定 – 新型生物反应器的研制 – 高效分离介质及装置的开发 – 分离纯化的优化控制 – 生物反应器等一系列仪器、仪表的设计制造 – 超滤、反渗透技术的应用