高效液相色谱法 HPLC
高效液相色谱法
2．高效液相色谱法与气相色谱法的比较
（l）气相色谱法：分析对象仅占有机物总数的20％。 高效液相色谱法：分离和分析占有机物总数近80％的那些 高沸点、热稳定性差、离子型化合物及摩尔质量大的物质。
（2）气相色谱：流动相与组分不产生相互作用力，仅起运 载作用。 高效液相色谱法：流动相对组分可产生一定亲和力，并参与 固定相对组分作用的剧烈竞争，流动相对分离起很大作用， 相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数；
高压输液泵应符合下列要求：密封性好，输出 流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速 更换溶剂及耐腐蚀。
高压输液泵
常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。 恒流泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱 柱引起阻力变化无关； 恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力 而变化，故保留时间的重视性差。 目前主要使用恒流泵，又称机械泵，它又分机械注射泵和机械 往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。
（四）检测系统
两种基本类型的检测器： 溶质型检测器：它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应， 属于这类检测器的有紫外、荧光、安培检测器等。 总体检测器：它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应， 属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。 （l）紫外检测器 （2）荧光检测器 （3）示差折光率检测器 （4）电化学检测器
高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography，HPLC
§1
概 述
Introduction
一、高效液相色谱法概述
高效液相色谱法（HPLC）吸取了气相色谱与经典液相色谱优 点，并用现代化手段加以改进。
引入了气相色谱的理论;
在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器; 具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点;
hplc高效液相色谱法
HPLC高效液相色谱法简介高效液相色谱法（HPLC）是一种利用液体作为流动相，通过高压输液系统，将样品中的各组分在固定相和流动相之间进行分配或吸附等作用而实现分离和检测的色谱技术。
HPLC具有分离效率高、灵敏度高、选择性强、分析速度快、样品适用范围广等优点，已成为化学、生物、医药、环境等领域中最重要的分析方法之一。
本文将简要介绍HPLC的基本原理、仪器组成、常用的色谱模式和应用领域，以期对HPLC感兴趣的读者有所帮助。
一、HPLC的基本原理HPLC的基本原理是利用样品中的各组分在固定相和流动相之间的不同亲和力，使其在色谱柱内以不同的速度移动，从而达到分离的目的。
固定相是填充在色谱柱内的颗粒状物质，可以是固体或涂于固体载体上的液体。
流动相是通过高压泵送入色谱柱的溶剂或溶剂混合物，可以是极性或非极性的。
样品是通过进样器注入流动相中，并随流动相进入色谱柱。
当样品中的各组分经过固定相时，会发生吸附、分配、离子交换、排阻等作用，导致它们在固定相中停留不同的时间。
这个时间称为保留时间（retention time），通常用tR表示。
保留时间是反映样品组分在色谱柱内分离程度的重要参数，不同的组分有不同的保留时间。
当样品组分从色谱柱出口流出时，会被检测器检测到，并产生一个信号。
这个信号随时间变化而变化，形成一个色谱峰（chromatographic peak）。
色谱峰的位置反映了样品组分的保留时间，色谱峰的面积或高度反映了样品组分的含量或浓度。
将检测器信号随时间变化而绘制出来，就得到了一条色谱图（chromatogram）。
色谱图上可以看到不同的色谱峰，每个峰对应一个样品组分。
通过比较保留时间和色谱峰面积或高度，就可以对样品进行定性和定量分析。
二、HPLC仪器组成HPLC仪器主要由以下几个部分组成：溶剂供给系统（solvent delivery system）：负责提供恒定压力和流速的流动相，并将溶剂混合成所需比例。
高效液相色谱法
第八章高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatograph)第一节概述（Generalization）以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。
HPLC是20世纪70年代初发展起来的一种新的色谱分离分析技术。
具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）的特点，适用于高沸点、热不稳定有机及生化试样的分离分析。
HPLC基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、或数据处理系统记录色谱信号再进行数据处理而得到分析结果。
高效液相色谱法按固定相不同可分为液－液色谱法和液－固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液－液色谱）和吸附色谱法（液－固色谱）等。
目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。
将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，具有固定液不易流失的特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。
C18（ODS）是最常使用的化学键合相。
根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。
《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用HPLC法，在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。
一、高效液相色谱法的特点目前经典LC主要用于制备，若用于分析则采用脱机或非连续检测。
经典LC填料缺陷，通常是填料粒度大、范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻力大，谱带展宽加大。
它存在致命弱点：速度慢、效率低和灵敏度低。
HPLC填料（高效固定相）颗粒细、直径范围窄、能承受高压。
高效液相色谱法(HPLC)
4.离子对色谱法：将一种（或数种）与溶质离子电荷相 反的离子（称对离子或反离子）加到流动相或固定相中， 使其与溶质离子结合形成离子对，从而控制溶质离子保 留行为的一种色谱法。
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5.离子色谱法：用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相，以电导检测器检 测组分含量，用抑制柱消除强电解质背景离子对电导检测器的干扰。（与离子交换 色谱法不同的是分离组分的检测器不同）
1．分离原理 液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，都是根据物质在两种互不相 溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。所不同的是液液色谱的分配是 在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的差速迁移，提高 了分离效率，从而能分离各种复杂组分。
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2、固定相 (1)担体(表面多孔型) 它是30～ 40μm的玻璃微球，表面附着一层厚度为 1 ～ 2μm的多孔硅胶。由 于固定相仅是表面很薄一层，因此，传质速度快，加之是直径很小的均匀球体，装 填容易，重现性好，现已广泛使用！ 但表面积小，柱容量低，需用高灵敏度检测器。
高效液相色谱法(HPLC)
High Performance Liquid Chromatography
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§3- 1 高效液相色谱法概述
一、定义 以高压输出液体为流动相，以小粒径填料填充色谱柱的色谱分析方法。
高效液相色谱法是继气相色谱之后，70年代初期发展起来的一种以液体做 流动相的新色谱技术.
而在液相色谱中，流动相液体也与固定相争夺样品组分分子，为提高选择性 增加了一个因素。还可选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大 分离的选择性（能同时选择固定相和流动相） 。
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②液相色谱固定相类型多,如离子交换色谱和排阻色 谱等，作为分析时选择余地大；而气相色谱是不 可能的。 ③ 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般 有利于色谱ห้องสมุดไป่ตู้离条件的选择。
高效液相色谱法
（2）化学键合固定相 ） B. 极性键合相 极性键合相指键合有机分子 中含某些极性基团，与空白硅胶相比， 中含某些极性基团，与空白硅胶相比，其极性 键合相表面能量分布均匀，是一种改性的硅胶， 键合相表面能量分布均匀，是一种改性的硅胶， 常用的极性键合相有氨基、氰基等。 常用的极性键合相有氨基、氰基等。氨基键合 相是分离糖类最常用的固定相，常用乙腈-水 相是分离糖类最常用的固定相，常用乙腈 水
二、液相色谱的流动相
1. 流动相特性
（mobile phases of LC） ）
（2）化学键合固定相 ）
化学键合固定相是应用最广的色谱法。 化学键合固定相是应用最广的色谱法。将固定液的官能团键
合在载体上形成的固定相称为化学键合相，其特点是不流失， 合在载体上形成的固定相称为化学键合相，其特点是不流失， 一般认为有分配与吸附两种功能。 一般认为有分配与吸附两种功能。 a. 硅氧碳键型： 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 硅氧硅碳键型： 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂， c. 硅碳键型： 硅碳键型： d. 硅氮键型： 硅氮键型： ≡Si—C ≡Si—N
4.6
高效液相色谱法
高效液相色谱法(high pressure Liquid 高效液相色谱法 chromatography，HPLC)是利用物质在两 ， 是利用物质在两 相之间吸附或分配的微小差异达到分离的目的。 相之间吸附或分配的微小差异达到分离的目的。 当两相作相对移动时， 当两相作相对移动时，被测物质在两相之间做 反复多次的分配， 反复多次的分配，这样使原来微小的差异产生 了很大的分离效果，达到分离、 了很大的分离效果，达到分离、分析和测定一 些理化常数的目的。 些理化常数的目的。
高效液相色谱法（hplc）
高效液相色谱法(HPLC)一．概述色谱法是一种应用范围相当广泛的分离分析技术，它已有近百年的发展史。
二十世纪五、六十年代石油及石油化工的突起促使了GC技术大发展，而七、八十年代生命科学、生化、制药工业的发展推动了HPLC的迅速发展。
目前除分析化学外，生物化学，石油化学，有机化学，无机化学等学科都普遍采用色谱技术。
现代高效液相色谱仪，以其高效，快速和自动化等特点成为当代分析仪器中发展最快的仪器。
HPLC已成为操作方便、准确、快速并能解决困难分离问题的强有力的分析手段。
1．HPLC的特点（1）适用范围广已知有机物中仅20%不经预先化学处理，可用GC分析；而其余80%有机物可用HPLC分析。
HPLC适于分离生物、医学大分子和离子化合物，不稳定的天然产物，种类繁多的其它高分子及不稳定化合物。
（2）流动相及固定均与样品分子作用，而GC仅固定相与样品分子作用。
（3）具有独特性能的柱填料（固定相）种类较多，具有多种分离方式，适于各种化合物分析。
（4）分离温度较低，提高了分离效率。
（5）具有一些独特的检测器：电化学，示差折光，可见紫外吸收及荧光检测器等。
（6）样品易回收。
2．HPLC分类按分离机理分为四类：吸附色谱（液固）：通过试样组分对活性固体表面吸附亲合力的不同实现分离。
对具有不同官能团的化合物和异构体有较高选择性，早期应用较多，现在大多可用正相键合相色谱替代，常用硅胶柱。
分配色谱：不同溶质分子按其在固定相和流动相中分配系数不同得到分离。
现代分配色谱即化学键合相色谱，是将各种不同的有机基团通过化学反应键合到硅胶表面，具有很好的化学稳定性和热稳定性。
大部分分离问题都可用键合相色谱解决。
离子交换色谱：以离子交换剂为固定相，试样中电离组分与交换剂基体相反电荷的离解部位亲合力不同而分离。
用于分离无机或有机离子。
固定相为阴（阳）离子交换树脂，流动相为电解质溶液。
分子排阻色谱：按物质分子量大小进行分离。
不仅对高聚物，对分子量差别较大的低聚物或小分子化合物也可进行分离。
高效液相色谱HPLC简介.ppt
种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不
同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。
2
操作过程图示
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色谱分离的机理
分离是一个 物理的过程。
固定相(Stationary Phase) 流动相(Mobile Phase) 样品 (溶解于流动相中的溶质)
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项目 进样方式 流动相 分离原理 检测器
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液-液分配色谱
固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定 液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性 （反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反； 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用； 化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的 游离羟基上。反相键合相色谱柱最常用的就是ODS柱，也就是C18柱。
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液相色谱类型
• 正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。 • 反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。用的最多，约占60～70％。
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色谱柱简介
• 正相柱------固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能团胺基团，如（NH2） 和氰基团（CN）的键合相填料。 由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他极性基团极性较强，因此，分离 的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色 谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷，氯仿，二氯 甲烷等。
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检测器简介（二）
◆ 电导检测器（ECD） 原理：监测溶液的电导率变化的检测器。 特点：选择性检测器、测量时要求恒温、对流动相的组成变化有明显响应、 灵敏度低（10-3g）。适用于离子型化合物。
HPLC
高效液相色谱法
2 仪器组成 高效液相色谱仪由输液泵、进样器、 色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成。
高效液相色谱法
泵
洗脱分等度洗脱和梯度洗脱二种。梯 度洗脱，可用两台泵或单台泵加比例阀实 现程序控制。
高效液相色谱法
进样器 手动进样器(六通阀式进样器) 自动进样器：在程序控制器或微机控制下， 可自动进行取样、进样、清洗等一系列动 作，有几种比较典型的自动进样装置：圆 盘式自动进样器、链式自动进样器、坐标 式自动进样器等，操作者只需将样品按顺 序装入贮样室内即可。
高效液相色谱法
④包覆聚合物(Polymer encapsulated) 包覆聚合物是在无机载体如硅胶、石墨化 碳或氧化锆的表面形成固载化的有机聚合 物薄层，聚合物薄层表面还可键合上C18、 C8、NH2、CN等，色谱过程中仅聚合物层 与流动相和组分接触，因而兼顾了无机载 体的刚性和有机聚合物的化学稳定性。
高效液相色谱法
3、电化学检测器(Electrochemical detector，ECD)： 电化学检测器是测量物质的电信号变化，对具 有氧化还原性质的化合物，如含硝基、氨基等有机 化合物及无机阴、阳离子等物质可采用电化学检测 器。包括极谱、库仑、安培和电导检测器等。前三 种统称为伏安检测器，用于具有氧化还原性质的化 合物的检测，电导检测器主要用于离子检测。其中 安培检测器(amperometric detector，AD)应用较广泛， 更以脉冲式安培检测器最为常用。
高效液相色谱法
缺点：只适用于能够产生荧光的物质 的检测，适用范围不如紫外检测器。影响 因素较多，对溶剂的纯度、pH值、样品浓 度、检测温度等需很好地控制。 适用范围：具有天然荧光的物质可以 直接检测，也可通过荧光衍生化使原本没 有荧光的物质转变成荧光衍生物后测定， 从而扩大了荧光检测器的适用范围。主要 用于氨基酸、多环芳烃、维生素、甾体化 合物及酶等的检测。
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1）硅胶： <>无定型硅胶 最早使用，传质慢、柱效低 <>薄壳型硅胶 直径为30~40μm的玻璃珠表面涂布一层1~2μm 厚的硅胶微粒，孔径均一、渗透性好、传质 快，但柱容量有限。 <>全多孔球型硅胶 粒度一般为5~10μm，颗粒和孔径的均一性都比 前两种好，柱容量大，为当今液固色谱固定相 的主体，也是键合固定相的主要基质。
2．进样系统 a 隔膜进样（高分子有机硅胶垫→进样室） >GC系统压力较小，可以 >HPLC系统压力太大，须停泵进样（早期） b 阀进样：不必停泵，六通阀
3．分离系统-色谱柱 >直径4~6mm,柱长10~30cm,多为不锈钢材料 >柱效评价：色谱系统适应性试验 R，n，fs（拖尾因子） >色谱柱维护 >预柱和预饱和柱
（二）反相键合相固定相
1．分离机制：疏溶剂理论 正相——流动相与溶质排斥力强， 作用时间↑， k↑，组分tR↑ 反相——流动相与溶质排斥力弱， 作用时间↓， k↓，组分tR↓
二、HPLC与GC差别
1．分析对象的区别 GC：
适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品； 但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型 及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可 检测。(占有机物的20%)
HPLC： 适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶 液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分 子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分 子和离子型样品均可检测用途广泛。（占有机物 的80%）
三、化学键合相色谱（CPC）
键合相色谱基本上属于分配色谱，与液液分 配色谱固定相不同的是“固定液”以化学键的形 式与基体结合在一起的。
（一）常规化学键合相
利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面
1．分离机制：分配+吸附（以LLC为基础） 2．特点：
不易流失 热稳定性好 化学性能好 载样量大 适于梯度洗脱
5）其他检测器
化学发光检测器、质谱检测器等
5．附属系统 梯度淋洗(洗脱)装置
洗脱方式有： 1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）
>以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一元泵） >类似GC的等温度洗脱 2）梯度洗脱： 梯度淋洗指在分离过程中使流动相的组成随时 间改变而改变。 >即不断改变溶剂极性（二元泵） >适于分析极性差别较大的复杂组分 >类似GC的程序升温（沸程较长样品）
原理-吸附 特点-峰易拖尾 适用-分离极性化合物
2）高分子多孔小球： 特点：柱选择性好，峰形好，柱效低 适用：分离弱极性化合物
3．流动相
除了最基本的要求之外，主要考虑溶剂强度， 溶解度参数及极性参数等。
二、液液分配色谱法（LLC）
1．分离原理：利用组分在两相中溶解度的差异 2．固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法）缺
一、液固吸附色谱法（LSC） 流动相为液体，固定相为固体吸附剂
1．分离原理：利用组分分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异
分离前提：K不等或k不等
2．固定相
<>分为极性和非极性两类 <>极性固定相：
硅胶、氧化铝和氧化镁、硅酸镁分子筛等，其 中极性硅胶应用最普遍。 <>非极性固定相： 多孔微粒活性碳、多孔石墨化炭黑，以及高分 子多孔微球等。
2．流动相的区别 GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用
力，只与固定相有相互作用。 HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用
力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起 正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改 变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，当 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 也可以增大分离选择性。 3．操作条件差别 GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）
4）电化学检测器：
常用的有电导检测器和安培检测器
电导检测器是测量物质在流动相中电离后所 引起的电导率的变化，组分浓度越高，电 离产生的离子浓度越高，电导率变化就越 大，多用于离子色谱。
安培检测器适用于测定所有在工作电极的电 压范围内发生氧化或还原反应的物质，在 生化样品分析中应用广泛，是迄今最灵敏 的HPLC检测器。
§3-3 高效液相色谱固定相和流动相
高效液相色谱法有许多类型，对于不同类型的 色谱方法所采用的固定相和流动相都有所差异，详 细可参考§3-4各类高效液相色谱法简介
§3-4 各类高效液相色谱法简介
一、液固吸附色谱法（LSC） 二、液液分配色谱法（LLC） 三、化学键合相色谱法（CBC） 四、离子色谱法（IC） 五、空间排阻色谱法（SEC）
§3-2 高效液相色谱仪
1．贮液罐（滤棒，可滤 去颗粒状物质）
2．高压泵（输液泵） 3．进样装置 4．色谱柱——分离 5．检测器——分析 6．废液出口或组分收集器 7．记录装置
1．高压输液系统（泵） 恒压泵：在一定操作条件下，输出压力保持恒 定，流量随系统压力变化而变化。 恒流泵：在一定操作条件下，输出流量保持恒 定，而与系统的压力无关。
高效液相色谱法 HPLC
（High Performance Liquid Chromatography）
§3-1 高效液相色谱法的特点
一、高效液相色谱法 特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。
它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学 键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实 验技术建立的一种液相色谱分析法。 高压：150-350*105 Pa 高效：大于30000塔板/米 高灵敏：10-9g （紫外检测）、10-11g （荧光检测）
4．检测系统 1）紫外-可见吸收检测器UV-Vis： 适用于吸收紫外或可见光的物质 灵敏度较高，应用范围较广 (光电二极管阵列检测器DAD) 2）荧光检测器FLD： 只能分析具有荧光活性的物质 灵敏度高，但适用范围有限 3）示差折光检测器RID： 利用折光率的差别来检测，为通用型 检测器，但灵敏度低，温度要求严格