肿瘤干细胞培养技术
肿瘤的细胞培养实验研究
肿瘤的细胞培养实验研究引言：细胞培养实验是现代生物医学研究中不可或缺的实验手段之一，它为了研究和分析生物体的细胞行为和生理过程提供了一种可控、可重复的实验环境。
在肿瘤方面，细胞培养实验可以帮助科研人员更深入地了解肿瘤细胞的生长、分化、生理功能以及药物对肿瘤细胞的影响。
本文将介绍肿瘤的细胞培养实验研究的基本过程、方法和应用。
一、肿瘤细胞培养实验的基本过程肿瘤细胞培养实验的基本过程主要包括细胞的收集、传代培养、细胞的鉴定和使用。
1.细胞的收集：肿瘤细胞可以通过肿瘤组织切片、原发培养物或小鼠移植瘤等方式收集。
为了避免细胞外污染，收集的过程需要在无菌条件下进行。
2.传代培养：收集到的肿瘤细胞需要在适当的培养基中进行传代培养，以保证细胞的生长和繁殖。
培养基中通常含有人工合成的营养物、生长因子和其他必需的成分。
3.细胞的鉴定：细胞的鉴定通常包括细胞学形态学观察、免疫细胞化学染色和细胞分子学鉴定等。
这些方法可以帮助科研人员确认培养的细胞是否为肿瘤细胞。
4.使用肿瘤细胞：经过鉴定的肿瘤细胞可以用于研究肿瘤发生机制、药物筛选、肿瘤模型制备以及其他科学研究。
二、肿瘤细胞培养实验的方法在肿瘤细胞培养实验中，常用的方法包括传统的贴壁培养法和悬浮培养法。
1.贴壁培养法：贴壁培养是最常见和最简单的肿瘤细胞培养方法。
在此方法中，肿瘤细胞会附着到培养皿的底部，并在培养基中生长繁殖。
这种方法适用于肿瘤细胞具有附着性的类型，如肺癌细胞、结肠癌细胞等。
2.悬浮培养法：悬浮培养法适用于肿瘤细胞具有悬浮生长的类型，如白血病细胞、淋巴瘤细胞等。
在此方法中，肿瘤细胞会悬浮在培养基中，并通过摇床等设备进行培养。
三、肿瘤细胞培养实验的应用肿瘤细胞培养实验在肿瘤研究中有着广泛的应用。
以下是其中的几个方面：1.研究肿瘤发生机制：通过细胞培养实验，科研人员可以对肿瘤细胞进行生长、增殖、分化、凋亡等方面的研究，从而深入了解肿瘤发生的机制。
2.筛选抗肿瘤药物：通过细胞培养实验，科研人员可以在体外模拟人体内的环境，研究不同药物对肿瘤细胞的毒性和治疗效果，从而筛选出潜在的抗肿瘤药物。
肿瘤干细胞的分离培养及其在肿瘤治疗中的应用
肿瘤干细胞的分离培养及其在肿瘤治疗中的应用随着医学技术的不断前进，对肿瘤治疗的研究也越来越深入。
其中，肿瘤干细胞的研究备受关注。
肿瘤干细胞是指在肿瘤中所存在的一小部分细胞，能够不断分裂增殖，并给予肿瘤再生的可能性。
因此，肿瘤干细胞的分离与培养以及在肿瘤治疗中的应用，成为了当今医学研究的热点话题。
一、肿瘤干细胞的分离方法目前，分离肿瘤干细胞的方法主要包括紫杉醇浸润法、细胞表面标记法、限制稀释法等。
其中，限制稀释法是较为常用的一种。
限制稀释法是将单个肿瘤细胞样本通过连续的稀释、培养与观察，逐渐筛选出肿瘤干细胞。
它通过观察单个细胞的生长、分裂、增殖情况，来得出大量肿瘤细胞当中的干细胞。
虽然这种方法过程复杂、费时费力，但是它能够筛选出更加纯度高的肿瘤干细胞。
二、肿瘤干细胞的培养方法早期肿瘤干细胞的培养，主要采用血清补充的液体培养基进行细胞的培养。
但是在这种培养条件下，肿瘤干细胞很容易分化。
因此，近年来，越来越多的实验室采用无血清培养条件进行肿瘤干细胞的培养，以维持肿瘤干细胞的稳定状态。
无血清培养条件下，需要选择不同种类的培养基，添加多种生长因子与细胞基质，来模拟肿瘤干细胞自身的生长环境。
同时，还需注意对细胞的密度、温度、pH 值、CO2浓度等生理性因素的控制。
三、肿瘤干细胞在肿瘤治疗中的治疗应用肿瘤干细胞的研究在肿瘤治疗中，具有重要的应用价值。
首先，肿瘤干细胞作为肿瘤治疗的靶点，开启了新的临床治疗途径。
其次，肿瘤干细胞可以用于评估肿瘤药物的治疗效果，这一评价标准能够更为准确反映药物的实际效果。
此外，肿瘤干细胞还可以用于评估肿瘤的预后情况，帮助医生选择更加有效的治疗方式。
总之，肿瘤干细胞的研究在肿瘤治疗研究领域，具有非常重要的价值。
分离肿瘤干细胞、培养肿瘤干细胞以及开展针对肿瘤干细胞的治疗策略，将有助于提高肿瘤治疗的效果，为患者带来更好的治疗效果。
肿瘤干细胞培养条件与方法
肿瘤干细胞培养条件与方法
肿瘤干细胞培养条件和方法可能因不同的肿瘤类型和研究目的而有所差异。
以下是一般的肿瘤干细胞培养条件和方法的概述：
1. 肿瘤组织获取：从患者或动物模型中获取肿瘤组织样本。
2. 肿瘤细胞分离：使用适当的方法，如酶消化或机械破碎，将肿瘤组织分离成单个细胞。
3. 细胞筛选：通过特定的标志物或功能特性，如表面标志物表达、干细胞特性等，筛选出肿瘤干细胞。
4. 培养条件：肿瘤干细胞通常需要特殊的培养条件，如无血清或低血清培养基、特定的生长因子和细胞因子、合适的气体环境等。
5. 细胞培养：将筛选出的肿瘤干细胞接种到培养容器中，并提供适当的培养条件，包括温度、湿度、气体环境等。
6. 监测和鉴定：定期观察肿瘤干细胞的生长情况、形态和功能特性，通过免疫荧光染色、流式细胞术等技术鉴定其干细胞特性。
需要强调的是，肿瘤干细胞的培养和研究是一个复杂的领域，需要专业的技术和设备。
肿瘤细胞培养
37℃静置2-4h 6、翻正培养瓶进行培养 7、原代细胞生长
肿瘤个人精准医疗
二、肿瘤细胞的培养
1、原代培养
这种方法采用前述的组织消化分散法，将妨碍细胞生长的细胞间质包括基 质、纤维等去除，使细胞分散，形成悬液，易于从外界吸收养分和排出代 谢产物，可以很快得到大量活细胞，细胞也可能在短时间内生长成片。适 用于培养大量组织，原代细胞产量高；但步骤繁琐、易污染，一些消化酶 价格昂贵，实验成本高。
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二、肿瘤细胞的培养
2、传代培养
肿瘤细胞的传代是人们利用培养肿瘤细胞作为进一步研究的靶材料。细胞 性状的好坏直接影响研究的结果。常见肿瘤细胞的传代多指细胞系的传代， 大致分为两种：一种是贴壁型细胞传代；另一种是悬浮型细胞传代。
注意事项：1、细胞没有生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面以前（80%）， 不要急于传代。
肿瘤细胞的培养
一、肿瘤细胞培养技术 二、肿瘤细胞的培养 三、体外培养肿瘤细胞的生物学检测 四、肿瘤细胞的冻存、复苏与运输 五、总结
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一、肿瘤细胞培养技术
1、取材
肿瘤细胞培养材料主要来源于外科手术或活检的瘤组织。取材部位非常重要 体积较大的肿瘤组织中央常有退变或坏死区，取材时应去掉坏死组织，故应 去瘤体的周围瘤组织做培养，癌性转移的淋巴结或癌性胸腹水是较好的培养 材料。取材后应尽快进行培养，如因故不能立即培养，可按正常组织储存方 法保存，将组织剪成1mm3左右的小块，放入培养液中，置4℃保存，但存放 时间不宜超过24h。取材时应注意无菌操作。
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二、肿瘤细胞的培养
干细胞技术在肿瘤治疗中的应用
干细胞技术在肿瘤治疗中的应用随着科学技术的不断进步，干细胞技术已开始被应用于临床治疗中，尤其是在肿瘤治疗中。
干细胞是一类未分化的细胞，具有自我更新和分化成多种细胞类型的潜能，因此被广泛研究并用于临床治疗。
本文将介绍干细胞技术在肿瘤治疗中的应用，包括干细胞移植、干细胞免疫治疗和干细胞治疗耐药性肿瘤等方面。
一、干细胞移植在干细胞移植中，一种或多种类型的未分化干细胞被通过手术移植到患者的体内，以代替已经损坏或死亡的细胞并恢复组织的功能。
这是一种广泛应用于肿瘤治疗中的治疗方法，可用于恢复因癌症治疗而导致的非造血细胞的缺陷和免疫系统的功能，通过提高治疗的效果和减少治疗后的不良反应，以改善患者的生存率和生存质量。
在干细胞移植中，研究人员通常使用的干细胞类型是造血干细胞和淋巴细胞。
造血干细胞可以分化成一个或多个血细胞系列的血细胞，包括白细胞、红细胞和血小板。
淋巴细胞则是免疫系统的主要细胞组成部分，可以分化成效应细胞和记忆细胞，以激发和保持免疫反应。
二、干细胞免疫治疗干细胞免疫治疗是应用干细胞的一种新型治疗方法，旨在改善免疫系统对肿瘤的反应。
在干细胞免疫治疗中，研究人员通常使用的干细胞类型是免疫干细胞和肿瘤干细胞。
免疫干细胞可以从患者或捐赠者体内获取，并在实验室中培养和扩增。
此后，这些免疫干细胞可以重新注入到患者体内，以增加免疫系统对肿瘤的反应。
肿瘤干细胞则是从患者或捐赠者体内获取的未分化细胞，这些细胞具有分化成多种细胞类型的潜能，可以通过适当的刺激和诱导分化成免疫干细胞。
在肿瘤干细胞分化后，它们可以被使用在干细胞免疫治疗中，以增强免疫系统的对肿瘤的反应。
三、干细胞治疗耐药性肿瘤肿瘤的耐药性是指肿瘤细胞在作用于其上的化疗、放疗、免疫治疗等治疗手段后不再受治疗影响，导致治疗的难度加大。
干细胞的优势在于它们可以定向分化成给定细胞类型，并因此用于治疗耐药性肿瘤。
研究人员利用干细胞为药物输送增加了非常有前途的传递方式，如包括导向药物输送、控制释放、检测和修复损伤组织等。
那些肿瘤干细胞的研究套路-序章与实验方法介绍
那些肿瘤⼲细胞的研究套路-序章与实验⽅法介绍近年来，肿瘤⼲细胞（Cancer stem cells，CSCs）逐渐成为肿瘤研究中的热点，2014年以来发表在⾼影响因⼦的各领域顶级期刊上的⽂章超过了数百篇。
再来看看2018年的国⾃然基⾦项⽬，肿瘤⼲细胞的项⽬也有37项之多，不管肿瘤⼲细胞的概念过去存在多少争议，越来越多的SCI⽂章都在发表肿瘤⼲细胞相关的研究，本系列将以⼏个篇幅详细介绍⼀下肿瘤⼲细胞的基本概念、研究思路、实验⽅法和论⽂套路。
序章肿瘤⼲细胞是指⼀类具有⼲细胞的特征，包括休眠、DNA修复机制激活、ABC药物转运蛋⽩⾼表达、以及对细胞凋亡的天然抗性的⼀群特殊的肿瘤细胞。
这群特殊的肿瘤细胞还具有以下⼏个特征，第⼀是⾃我更新能⼒，即可以产⽣与亲代完全相同的⼦代细胞；第⼆是分化潜能，即可以分化成不同亚群的肿瘤细胞；第三是⾼成瘤性，即很少量的肿瘤⼲细胞就⾜以在体内起始肿瘤发⽣。
研究表明肿瘤⼲细胞在肿瘤的发⽣起始，转移以及耐药的过程中发挥着重要作⽤，下⾯着重介绍⼀下肿瘤⼲细胞的实验⽅法和⼤体研究思路。
1) 肿瘤⼲细胞分离⽬前主要采⽤FACS（流式细胞分选术）和MACS（磁珠分选）技术，FACS能够通过肿瘤⼲细胞表⾯特殊表⾯标志物的表达（如CD133，CD24，CD44等）进⾏肿瘤⼲细胞的分离，MACS则⼀般利⽤CD133作阳性选择分离细胞。
（附表1：不同肿瘤⼲细胞表⾯标志物）表1 不同肿瘤细胞表⾯标志物2) 肿瘤⼲细胞体外培养采⽤肿瘤⼲细胞微球Oncosphere体系对常规肿瘤细胞系或者病⼈来源的肿瘤⼲细胞进⾏培养： Oncosphere即⼲细胞成球，通过⽆⾎清的⼲细胞培养基在低吸附的培养板上对肿瘤细胞进⾏培养可以得到悬浮的球状细胞团（图1），细胞处于⽆⾎清培养基及超低黏附培养板中，在这种培养条件下，分化的肿瘤细胞渐渐死亡，肿瘤⼲细胞则会存活并增殖形成细胞微球。
图1 肿瘤⼲细胞sphere培养体系观察以乳腺癌与结肠癌为例，Oncosphere培养体系如下：乳腺癌CSC培养体系结直肠癌CSC培养体系DMEM/F-12DMEM/F-12B27 1X B27 1X20ng/ml EGF20ng/ml EGF20ng/ml bFGF20ng/ml bFGF0.4% BSA Penicillin/Streptomycin5ug/ml InsulinPenicillin/Streptomycin3) 肿瘤⼲细胞的鉴定和⼲细胞特性检测除了前述提到的染⾊肿瘤⼲细胞特异性表⾯marker并通过流式细胞术鉴定CSC外，成球能⼒也是肿瘤⼲细胞体外鉴定和反应⼲细胞特性的重要指标。
肿瘤细胞的培养方法
肿瘤细胞的培养方法
肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格，一般常用RPMI、DMEM、McCoy-5A等培养基，血清浓度不高，10%即可，建议最好在原代培养时能加入生长因子或原患者血清（1%~2%）以利细胞生长。
培养方法很多，主要有组织块法、酶消化法、钽网法、脱落细胞法等。
1．组织块法
将取得的瘤组织去除脂肪、结缔组织及坏死部分，在平皿中用Hanks液洗3次，剪碎组织，切成1~2mm3小块，接种于事先涂有鼠尾胶原的培养瓶（或皿）中，37℃、5%CO2或加盖并塞在普通恒温箱中培养。
2．酶消化法
在上述的碎组织块中加入0.25%胰蛋白酶或2000U/ml胶原酶，在37℃水浴中消化30min或更长一些，去除消化液，用洗液洗3次，培养基洗1次后，用完全培养基悬浮，并用吸管吹打分散制成细胞悬液，计数。
以（5~10）x108个/L细胞浓度，在含有10%小牛血清的RPMI、EagleMEM或DMEM中，在37℃、5%CO2下分瓶（或皿）中培养。
3．钽网法
在一张面积约为1cm2的钽网上放入上述剪碎的一块或几块肿瘤组织块（1~2mm3大小），用镊子轻压，使其粘于网上，再把但网放入培养皿中，使网下的组织块与皿壁紧紧接触，于37℃、5%CO2下培养，每隔2~3天换液一次，5天后可见有上皮细胞从网上移出，并能在相当于肿瘤组织部位形成纯净的单层上皮细胞。
4．脱落细胞法
将新鲜的肿瘤组织去除脂肪和结缔组织，洗液洗2次后，用刀片将肿瘤组织切成细薄片，在切割的同时有许多上皮细胞脱落下来，脱落细胞经洗涤后，加入完全培养基，便可获得较纯的上层细胞，于培养瓶（或皿）中，37℃、5%CO2下培养，每隔2~3天换液一次，7~10天上皮细胞逐渐长成单层。
肿瘤干细胞培养技术
肿瘤干细胞培养技术随着干细胞生物学以及肿瘤学研究得不断深入,肿瘤干细胞已成为当前肿瘤研究得热点、肿瘤干细胞得体外培养在肿瘤干细胞研究领域具有不可替代得重要地位,通过分离、纯化及培养肿瘤干细胞可以对其生物学特性如异质性、肿瘤得演化、转移与抗药性等进行研究,为肿瘤得早期诊断与治疗提供了新得思路与策略。
肿瘤干细胞得体外培养多采用无血清培养基(serｕｍｆree meｄium, SF Ｍ),根据不同得细胞类型加入适当得细胞因子联合培养以防止其分化。
肿瘤细胞系或者就是临床肿瘤组织联合采用机械与胶原酶消化肿瘤组织得到单细胞悬液,经过流式细胞仪或者免疫磁珠分选得方法得到肿瘤干细胞使用无血清培养基在饱与湿度得条件下进行体外培养,但值得注意得就是临床肿瘤组３7℃,５％CO２织得获取应该越新鲜越好,最好就是在外科手术后１小时内进行处理否则将影响肿瘤干细胞细胞得活性,不利于体外培养。
无血清培养基有很多种,针对不同得细胞类型有专门得无血清营养液出售。
无血清培养基具有以下得优点:各批产品之间成分相对明确、质量相对一致;便于控制培养得生理环境;特殊细胞类型得优化配方有利于提高细胞得稳定性,使不同类型得细胞能在最有利于各自生长得环境中持续传代培养;依据不同类型得细胞、甚至不同得细胞系(株)都可能有各自得无血清培养基。
总得来说可以分为基础营养基及附加成分两大部分［1］。
基础培养基一般采用人工合成得培养基主要有DMEM、DMEM/F12、UltraＣULTURETM、神经干细胞专用无血清培养基、黑色素瘤专用培养基等其中以DMEＭ/F１2(1:1,Iｎｖitｒoｇen)最为常用。
附加成分就是指在基础培养基中加入各种不同细胞生长所需得营养成分,包括①营养因子:胰岛素、转铁蛋白与亚硒酸钠、牛血清白蛋白、B27、Ｌ—谷氨酰胺;②细胞因子:白血病抑制因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、血小板衍化生长因子等。
使用无血清培养基培养得细胞经胰酶消化传代后不使用血清终止胰酶得作用,可使用０.1％－0.5%大豆胰酶抑制剂(sｏｙbeaｎ trypsin inhi ｂiｔｏr)。
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肿瘤干细胞培养技术随着干细胞生物学以及肿瘤学研究的不断深入，肿瘤干细胞已成为当前肿瘤研究的热点。
肿瘤干细胞的体外培养在肿瘤干细胞研究领域具有不可替代的重要地位，通过分离、纯化及培养肿瘤干细胞可以对其生物学特性如异质性、肿瘤的演化、转移和抗药性等进行研究，为肿瘤的早期诊断与治疗提供了新的思路和策略。
肿瘤干细胞的体外培养多采用无血清培养基(serum free medium, SFM)，根据不同的细胞类型加入适当的细胞因子联合培养以防止其分化。
肿瘤细胞系或者是临床肿瘤组织联合采用机械和胶原酶消化肿瘤组织得到单细胞悬液，经过流式细胞仪或者免疫磁珠分选的方法得到肿瘤干细胞使用无血清培养基在37℃，5％CO2饱和湿度的条件下进行体外培养，但值得注意的是临床肿瘤组织的获取应该越新鲜越好，最好是在外科手术后1小时内进行处理否则将影响肿瘤干细胞细胞的活性，不利于体外培养。
无血清培养基有很多种，针对不同的细胞类型有专门的无血清营养液出售。
无血清培养基具有以下的优点：各批产品之间成分相对明确、质量相对一致；便于控制培养的生理环境；特殊细胞类型的优化配方有利于提高细胞的稳定性，使不同类型的细胞能在最有利于各自生长的环境中持续传代培养；依据不同类型的细胞、甚至不同的细胞系(株)都可能有各自的无血清培养基。
总的来说可以分为基础营养基及附加成分两大部分[1]。
基础培养基一般采用人工合成的培养基主要有DMEM、DMEM/F12、UltraCULTURETM、神经干细胞专用无血清培养基、黑色素瘤专用培养基等其中以DMEM/F12(1:1，Invitrogen)最为常用。
附加成分是指在基础培养基中加入各种不同细胞生长所需的营养成分，包括①营养因子：胰岛素、转铁蛋白和亚硒酸钠、牛血清白蛋白、B27、L－谷氨酰胺；②细胞因子：白血病抑制因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、血小板衍化生长因子等。
使用无血清培养基培养的细胞经胰酶消化传代后不使用血清终止胰酶的作用，可使用0.1％－0.5%大豆胰酶抑制剂(soybean trypsin inhibitor)。
一、肿瘤干细胞培养中几种常见的细胞因子(一)白血病抑制因子LIF(leukemin inhibitory factor,LIF) 是白介素6(IL-6)细胞因子家族中的一员，是典型的多功能生长因子，具有多种生物学功能：对细胞生长、增殖与分化有着广泛的作用，抑制分化促进干细胞增殖。
胚胎干细胞的体外培养需要添加LIF以抑制其分化，维持其多能性。
LIF可抑制成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor ,FGF)、β转移生长因子(β-transforming GrowthFactor ,TGFβ)和叶酸(Retinoic Acid ,RA)诱导的细胞分化。
(二)干细胞因子(stem cell factor,SCF) 又称肥大细胞生长因子(MGF)，Kit配体(KL)及Steel因子(SLF)，SCF可以诱导干和祖细胞增生。
SCF主要由脑、肝脏、骨髓、胎盘等组织(尤其骨髓)中的基质细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肝细胞产生。
SCF是一种作用于最早期造血干祖细胞的造血细胞因子，在维持造血及肥大细胞存活、促进造血细胞增殖和分化、调控各系造血细胞的生长发育过程中起着重要作用。
(三)表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF) 是含有53个氨基酸的多肽, 早期研究中发现其有剌激表皮细胞生长的作用,是表皮细胞培养的最常用的添加因子之一。
EGF可显著促使细胞分裂、增殖，在一定浓度范围内(5~20ng/ml),随EGF浓度提高,效应加强。
(四)碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF) 1975年Gospodarowicz 及其同事从牛大脑和垂体中分离纯化出一种分子量为16-18kD由146个氨基酸组成的阳离子多肽，并将其命名为成纤维细胞生长因子。
bFGF具有多种生物学功能，可以促进和调节血管内皮细胞、上皮细胞、和神经胶质细胞等多种起源于中胚层、神经外胚层源性的许多种细胞的增殖和分化。
二、肿瘤干细胞目前肿瘤干细胞已经在多种肿瘤细胞系以及白血病、脑瘤、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤、肝癌、肺癌等多种肿瘤组织中分离鉴定和培养。
不同组织来源的肿瘤特性不同的，培养条件也不完全相同，本章就已有报道的从不同肿瘤细胞系或者肿瘤组织分离的肿瘤干细胞的体外培养体系加以阐述，在实际操作中读者需要经过摸索才能针对不同的肿瘤干细胞建立稳定的体外培养条件。
(一)白血病干细胞ALL急性淋巴细胞白血病干细胞(CD34+/CD10–/CD19–)采用悬浮培养体系培养[2]。
ALL急性淋巴细胞白血病患者来源的骨髓用Ficoll分离得到单个核细胞(MNC)，使用IMDM(Gibco)添加50% FCS(Gibco)和10% DMSO 二甲基亚砜(Manor Park Pharmaceuticals)冻存液将分离得到的MNC在液氮中备用。
培养时以5×105个/mL密度接种在IMDM无血清培养基中，添加了10μg/mL 人胰岛素，200μg/mL转铁蛋白( Sigma-Aldrich)和2% HAS。
使用时以下两组生长因子任选其一：①20ng/mL重组人Fms样酪氨酸激酶3 (rhFlt3) 配体、20ng/mL 重组人白介素3 (rhIL-3)、20ng/mL rhIL-6、20ng/mL rhGM-CSF、20ng/mL rhG-CSF 和50ng/mL SCF。
②20ng/mL rhIL-3、10ng/mL rhIL-7和50ng/mL SCF (R&D Systems)。
每周半量换液一次，培养6周后收集细胞用于细胞遗传学和形态学分析。
(二)乳腺癌干细胞乳腺癌干细胞培养多参考Max Wicha及其同事建立的人乳腺上皮干/祖细胞体外悬浮培养体系[3]，在无血清培养基中乳腺上皮干细胞呈悬浮非分化形式生长，我们称之为乳腺干细胞球。
原代培养时在超低粘附板(Corning)以20000个/mL活性细胞传代时以1000个/mL密度进行培养。
无血清培养基选择无血清乳腺上皮生长培养基MEGM(BioWhittaker)，添加了B27 (Invitrogen)、20ng/ml EGF、20ng/mLbFGF(BD Biosciences)和4μg/mL肝磷脂(Sigma)，不添加牛垂体浸膏。
乳腺干细胞球培养7－10天后用0.05%胰酶和0.53mM EDTA-4Na 消化10分钟(Invitrogen)，收集细胞到离心管中800rpm离心。
离心后得到的细胞需通过40μm滤膜并且在显微镜下观察是否为单个细胞。
10000个单细胞悬液中两个相连、三个相连、多个细胞相连的团块数量应该在30到150之间，如果细胞团大于>100需要重复进行消化和过滤的步骤。
外科手术得到乳腺癌实体瘤中乳腺癌干细胞(CD44 +/ CD24− /low)的培养需要在手术后30分钟内对乳腺癌标本进行处理，在胶原酶(Roche)和透明质酸(Sigma)按1:1比例配成的消化液中37℃消化2小时后通过30μm滤膜后得到单细胞悬液。
以1000个/mL无血清DMEM-F12 (Cambrex), 添加10ng/mL bFGF、20ng/mL EGF、5μg/mL胰岛素和0.4%牛血清白蛋白(Sigma)。
细胞在上述培养基中呈悬浮球状细胞团生长，每隔3天使用胰酶－EDTA消化2分钟后传代[4]。
乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231中分离得到乳腺癌干细胞(CD24− /low /CD44+)，收集细胞500g离心5分钟,使用Hanks’缓冲盐溶液洗涤后以1000个/mL重悬于无酚磺酞的DMEM –F12 (Cellgro) 添加0.4%牛血清白蛋白BSA(Sigma)、5μg/mL牛胰岛素(Sigma)、20ng/mL bFGF ( Sigma)和10ng/mL EGF (Sigma) ，每三天换液一次[5]。
(三)脑胶质瘤临床获得的肿瘤标本使用lympholyte-M (Cedarlane)去除红细胞，在充氧的人工脑脊液中使用胰酶消化成单细胞悬液，总的来说，每份肿瘤标本大概可以获得2－5×106个细胞。
肿瘤细胞使用TSM(tumor sphere medium)肿瘤细胞球培养基，添加20 ng/ml重组人EGF (Sigma)、20ng/ml bFGF (Upstate)、10ng/ml LIF(Chemicon)、1×神经元存活因子NSF(Clonetics)和60μg/ml N－乙酰半胱氨酸(Sigma), 使用60-mm细胞培养板进行培养确保活细胞数量为3 ×106。
原代培养三天后免疫磁珠分选得到CD133+脑胶质瘤干细胞，使用上述细胞培养基培养[6]。
也有学者从临床肿瘤组织获得的单个肿瘤细胞悬液在Neurobasal培养基(Invitrogen)，添加2mM L-谷氨酰胺、N2 (Invitrogen)、B27 (Invitrogen)、20ng/ml hrEGF (Invitrogen)、20ng/ml hrbFGF (Invitrogen)和50mg/ml BSA。
实验中使用的细胞应该在4代之内，分选得到的Nestin+/CD133+细胞即为脑肿瘤干细胞[7]。
大鼠胶质瘤细胞系C6采用SP分选的方法得到脑胶质瘤干细胞[8], 在100-mm 培养盘中(Nunc)使用无血清的DMEM培养，添加了10μg/ml牛胰岛素、100μg/ml 人转铁蛋白、100μg/ml BSA、60ng/ml黄体激素、16μg/ml四甲烯二胺、40ng/ml 亚硒酸钠、63μg/ml N－乙酰半胱氨酸、5μM血小板凝集抑制剂forskolin、50units/ml青霉素、50μg/ml链霉素(GIBCO)、10ng/mlbFGF和10ng/ml PDGF。
大鼠胶质瘤细胞系9L，无血清NSC增殖培养基采用DMEM/F12添加20ng/ml EGF(Peprotech)和bFGF(Peprotech)、50ng/ml肝磷脂、1×B27 (Gibco)。
每隔两天换液一次。
当肿瘤细胞球达到100–200个时使用0.1%胰酶和1×EDTA (Gibco) 37°C消化10分钟。
通过25μm细胞滤膜(BD Biosciences) 以1000个/ml 密度接种在添加促有丝分裂剂的NSC培养基中每隔两天换液一次，18天后可以进行细胞的传代，培养的细胞球即为具有化疗抵抗和侵袭能力的肿瘤干细胞样细胞[9]。