口蹄疫监测诊断作业指导书
家畜传染病学实验指导：口蹄疫的实验室诊断
实验十六口蹄疫的实验室诊断目的初步掌握口蹄疫的反向间接红细胞凝集试验，补体结合试验，琼脂扩散试验等血清学诊断技术。
内容及方法当根据临诊和流行病学诊断为口蹄疫后，应进一步确定病毒的型，因为疫苗及血清的正确使用有赖于定型。
病毒型鉴定的方法有以下几种。
一、口蹄疫病毒感染相关抗原琼脂免疫扩散试验本方法用于检测被检动物血清中是否含有口蹄疫病毒感染相关(VIA)抗体(口蹄疫多型抗体)，以证实被检动物是否感染过口蹄疫病毒。
本试验适用于易感动物的检疫、疫情监测和流行病学调查。
(一)材料准备1．Tris一盐酸缓冲液Tris 2.42gNacl 3.8 gNaN3 0.2g无离子水加至100ml，用HCl调pH至7.6。
2．器材平皿(直径5.5 cm)、吸管、金属打孔器外径4mm、模板，在有机玻璃板上按以下规格打孔，一个中心孔和6个外周孔，所有孔的直径为4mm，中心孔边缘到外周孔的距离均为4mm。
3．VIA抗原见使用说明书。
4．标准阳性血清．用A或O型口蹄疫病毒高免兔血清。
5．微量流射器或盐水接头若干及乳胶头。
6．印相暗盒或台灯(供观察沉淀线用)。
(二)操作方法1．被检血清和阳性血清均以56℃灭能30min。
2．琼脂糖平板的制备取琼脂糖1g，Tris—盐酸缓冲液100ml，装入三角瓶中，于沸水中加热或高压，将琼脂糖彻底融化。
然后吸取7ml琼脂液加到平皿里，制成3mm厚的琼脂板。
待琼脂完全凝固后，加盖置于湿盒中，贮藏在4℃冰箱中备用。
3．打孔将模板放在琼脂板上，用打孔器通过模板的孔在琼脂板上打孔，并挑出孔中的琼脂块。
4．加样按图9方式加样，即中心孔加VIA抗原，1和4孔加FMD阳性高免兔血清，2、3、5、6孔加被检血清。
5．扩散将加样的琼脂平皿置于湿盒里于室温(20～22℃)任其自然扩散。
6．观察于24h进行第一次观察，72h作第二次观察，168h作最后观察。
观察时，可借助灯光或自然光源，特别是弱反应须借助于强光源才能看清沉淀线。
实验报告口蹄疫诊断
实验报告口蹄疫诊断实验报告：口蹄疫诊断摘要：口蹄疫是一种严重危害牲畜健康的疾病，及时准确的诊断对于控制疫情的蔓延至关重要。
本实验旨在探讨口蹄疫的诊断方法，并评估其准确性和可行性。
通过实验结果的分析，我们可以得出口蹄疫的诊断方法及其在疫情控制中的重要性。
引言：口蹄疫是一种由口蹄疫病毒引起的急性传染病，主要影响牛、羊、猪等偶蹄类动物。
该疾病在全球范围内广泛流行，给畜牧业造成了严重的经济损失。
及时准确地诊断口蹄疫对于控制疫情的蔓延至关重要。
目前，常用的口蹄疫诊断方法包括病毒学检测、血清学检测和分子生物学检测等。
然而，这些方法在实际应用中存在一定的局限性，因此需要进一步研究和改进。
材料与方法：本实验选取了一批可能感染口蹄疫的动物样本，包括血清、组织和病毒等。
采用了病毒学检测、血清学检测和分子生物学检测等方法对这些样本进行分析，并比较了它们的准确性和可行性。
结果：通过实验分析，我们发现病毒学检测方法对口蹄疫的诊断具有较高的准确性，但需要较长的检测周期。
血清学检测方法具有快速、简便的优点，但其准确性相对较低。
分子生物学检测方法在口蹄疫诊断中表现出了较高的敏感性和特异性，是一种较为可靠的诊断方法。
讨论：口蹄疫的诊断方法是口蹄疫防控工作中的关键环节，不同的诊断方法各有优劣。
病毒学检测、血清学检测和分子生物学检测等方法可以相互补充，提高口蹄疫的诊断准确性和可行性。
在口蹄疫的防控工作中，应根据具体情况选择合适的诊断方法，并不断改进和完善口蹄疫的诊断技术。
结论：口蹄疫的诊断方法对于口蹄疫的防控具有重要意义。
病毒学检测、血清学检测和分子生物学检测等方法在口蹄疫的诊断中都具有一定的优势和局限性，需要综合考虑并不断改进完善。
口蹄疫的诊断技术的进步将为口蹄疫的防控工作提供重要的支持和保障。
口蹄疫监测方案
口蹄疫监测方案1. 背景介绍口蹄疫是一种高度传染的病毒性疾病，主要影响偶蹄类动物，如牛、羊、猪等。
该病的严重性在于其高度传染性和对畜牧业的巨大经济损失。
因此，建立有效的口蹄疫监测方案，对于及时控制疫情、保护畜牧业发展至关重要。
2. 监测目标本监测方案的主要目标是及时发现和报告口蹄疫病例，迅速采取措施进行疫情控制，最大限度地减少经济损失，保护畜牧业的可持续发展。
3. 监测内容本监测方案主要包括以下几个方面的内容：3.1. 疫情监测通过对牲畜群体的疫情监测，发现病例并及时报告上级疫情监测机构。
监测内容包括： - 口蹄疫病例的发现和报告情况； - 疫情的传播范围和趋势。
3.2. 病原体监测通过对患病动物的实验室检测，追踪疾病的病原体来源和变异情况。
监测内容包括： - 口蹄疫病毒的分离和鉴定； - 病毒的毒力和耐药性监测。
3.3. 宿主动物监测通过对患病动物和潜在宿主的监测，了解宿主的感染情况和宿主动物的变化趋势。
监测内容包括： - 患病动物的种类、数量和感染率； - 潜在宿主动物的感染情况。
3.4. 疫苗监测通过对疫苗的质量监测，确保疫苗的有效性和安全性。
监测内容包括： - 疫苗的生产和配送情况； - 疫苗的免疫效果监测。
4. 监测方法为有效开展口蹄疫监测工作，需要采用多种方法来获取监测数据，包括以下几个方面：4.1. 临床观察养殖场和兽医机构应加强对牲畜健康状况的观察，及时发现可能的口蹄疫病例，并迅速采取隔离和报告措施。
4.2. 野外调查定期组织专业人员对疫情高发区域进行野外调查，了解当地畜牧业的疫情动态和相关信息。
4.3. 实验室检测将疑似病例的血样、组织样本等送往指定实验室进行病原体检测、毒力测定等分析。
4.4. 数据交流和共享各级疾病监测机构之间要加强数据交流与共享，及时传递监测信息，形成有效的监测网络。
5. 监测和报告流程为有效管理和指导监测工作，制定明确的监测和报告流程至关重要。
具体流程包括：1.患病动物的初步观察和隔离；2.采样和实验室检测；3.报告上级疫情监测机构；4.上级机构协调处置和采取措施；5.相关部门信息共享和统计分析；6.完善监测和报告制度。
口蹄疫监测诊断作业指导书
口蹄疫监测诊断作业指导书一、口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体检测酶联免疫吸附试验1.适用范围用于检测猪、牛、羊血清中的口蹄疫病毒VPI结构蛋白抗体，与猪、牛、羊口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒联合使用，可区分口蹄疫病毒感染动物及疫苗免疫动物。
检测猪血清应用猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒；检测牛、羊血清应用牛、羊口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒。
2.检测试剂口蹄疫病毒VP1抗原包被板、样品稀释液、酶结合物、阴性对照、VP1阳性对照、酶结合物稀释液、TMB底物A液、TMB底物B液、终止液（l.OMHZSO。
）、浓缩洗涤液、稀释板、一次性封板膜、微孔定位标签。
3.检测步骤3.1使用前将试剂盒恢复到室温，避免阳光直射或放置在30℃以上的环境中。
3.2取出试剂盒中的样品稀释液。
A1、B1两孔作为阴性对照，Cl、D1两孔作为阳性对照孔，其余孔作检测孔，每孔一个样品。
3.3在稀释板的各孔中加200样品稀释液。
在相应各孔中分别加入10此对照血清或被检血清样品。
用加样器重复吹吸数次。
稀释每个样品时必须使用不同的吸头。
3.4取出抗原包被板。
3.5分别从稀释板上取稀释后的对照血清和被检血清各100此，加至抗原包被板的相应孔中，加益或封膜后，置37士2℃下孵育60士5分钟。
3.6洗涤工作液配制：按需要量，用去产离子水或双蒸水将洗涤液作25倍稀释。
3.7用洗涤工作液洗涤抗原包被板，每孔300吨，洗涤6次，拍干。
3.8酶结合物工作液配制：用酶结合物稀释液将酶结合物作100倍稀释，现配现用。
3.9每孔加入100此酶结合物工作液，加盖或封膜后，置37±2℃下孵育30±2分钟。
3.10重复3.7。
3.11TMB底物工作液配制：将TMB底物B液和TMB底物A液等量混合，现配现用。
3.12每孔加入100此底物工作液，加盖或封膜后，置37±2℃下孵育15±1分钟。
猪口蹄疫病诊断和防治方法
猪口蹄疫病诊断和防治方法作者：王学文来源：《农民致富之友》 2021年第29期王学文猪口蹄疫病是猪养殖产业中影响较为恶劣的一种疾病，是因口蹄疫病毒引发的急性传染病，在猪、牛和羊等动物的身上均有发病，感染以后的牲畜会在口腔、蹄部、鼻镜等部位发生水疱，水疱会慢慢破裂溃烂。
因为猪口蹄疫病的发病率较高且扩散速度快，所以对猪养殖产业的影响是非常深远的，养殖者要高度重视猪口蹄疫病的诊断工作与防治工作，从源头上防治猪口蹄疫病才是上策。
本文从猪口蹄疫病的诊断方法进行研究，提供了猪口蹄疫病的防治策略。
一、猪口蹄疫病的诊断方法1、猪口蹄疫病的发病特征猪口蹄疫病主要是由病毒感染，猪口蹄疫病的病毒分多种类型，不同类型的病毒的抗原性有所不同，分离株的抗原性之间也有差异，而且猪口蹄疫病的病毒对外界的抵抗力较强，在牲畜的粪便及饲料中可长时间存活。
目前牲畜养殖中猪口蹄疫病流行最广的是II型病毒，这种病毒的传染源风险最大，潜伏的周期在2-4天之间。
2、猪口蹄疫病的诊断方法猪口蹄疫病主要发病特征就是长水疱，而患病的猪主要在副蹄、蹄踵、蹄冠等处长出大小不一的水疱，还伴随着体温上升、精神萎靡等症状，如果猪口蹄疫病病毒逐渐侵入猪蹄部，则猪蹄部的温度也会上升，致使蹄壳变形或者脱落，水疱有清有浊，如果表面发生破损，那么水疱的边缘会逐渐溃烂，呈现暗红色的溃烂面，在约1-2周以后，水疱破损的部分会逐渐结痂，要想痊愈则需要经过3周以上的恢复。
成年猪只感染猪口蹄疫病并不会死亡，死亡率仅在3%以下，但是幼猪感染猪口蹄疫病的死亡率较高，尤其是妊娠期的母猪如果感染猪口蹄疫病，那么很容易出现流产。
在解剖实验中可以看见，患病的猪只在很多部位都出现了溃烂，如猪肠道的熟膜位置伴随血性的验证，幼猪的心包膜分布着紧凑的出血点。
二、猪口蹄疫病的防治对策养殖者对于猪口蹄疫病的防治应当采用快速确诊、快速隔离、快速消毒的方法，由于猪口蹄疫病的传播速度较快且影响较大，所以养殖者要严格落实各项防疫制度，避免猪口蹄疫病的影响扩大，同时也要严格根据有关部门对疫情的防治要求，做好分散猪口蹄疫病的防治工作，更加精细化的开展疫苗接种，降低防治工作的困难性，最大程度的控制疫病对猪养殖产业带来的损失。
口蹄疫诊断技术规程
口蹄疫诊断技术规程（NY／SY150-2000 )1．范围本规程规定了口蹄疫正向间接血凝试验、屠宰品中口蹄疫病毒检测试验及口蹄疫病毒RT - PCR检测试验。
正向间接血凝试验适用于口蹄疫疫苗接种血清抗体水平监测、流行病学调查和进出口动物检疫；口蹄疫病毒检测试验和RT - PCR检测试验适用于猪的屠宰品中的口蹄疫病毒检测。
2．正向间接血凝试验2.1试剂2.1.1纯化灭活口蹄疫病毒致敏醛化蹂酸化绵羊红细胞，标准阳性、阴性血清，由中国农业科学院兰州兽医研究所生产。
2.1.2稀释液，配制方法见附录A。
2．2操作方法2.2.1待检血清的灭活将待检血清放人56℃水浴中灭活30分钟。
2.2.2待检血清的稀释用稀释液将待检血清稀释成1：4，1：8，1：16，1：32，1：64，1：128，1：256，1：512等8个稀释度。
2.2.3阴、阳性血清的稀释用稀释液将阴性对照血清稀释成1:16，将阳性对照血清稀释成1：51202.2.4加样在干净的V型96孔110°血凝板的第1～8孔加各稀释度待检血清50μ1，第10孔加1：16的阴性对照血清50μ1，第11孔加口蹄疫O型阳性对照血清（1:512) 50μ1；第12孔加稀释液50μ1（空白对照孔）。
第1～8孔和10～12孔加口蹄疫诊断液，每孔25μl。
如用液体诊断液，只需摇匀便可加样。
若用冻干诊断液，则需提前7～10天加人稀释液（每瓶5m1 )浸泡（在4～6℃下），方可使用。
2.2.5振荡混匀加样完毕后，立即将血凝板置于微量振荡器上，振荡1分钟，取下放在白纸上，观察血球应均匀悬浮，不得沉淀，否则应继续振荡。
2.2.6静置振荡混匀后，取下血凝板并盖上大小适中的玻璃板，防止水分蒸发，室温下静置1.5～2小时，或次日判定结果。
2.3结果判定2.3.1先观察对照孔，第10孔（阴性血清对照孔）、第12孔（稀释液对照孔）应无凝集现象，呈小圆点状（一）。
％以上的血球产生凝集，即（＋＋）50孔（阳性血清对照孔）应有11第2.3.2．（阳性反应）。
口蹄疫诊断
d）10×PCR缓冲液：3μ l。 e）底物dNTP（2.5mmol/μ l）：4μ l。 f）TaqDNA 聚合酶（ 5U/μ l）：0.5μ l（ 高速离心10s，或不离心）。 g）矿物油：40μ l。 高速离心10s。 将反应管插入扩增仪中，指令设定程序 开始工作。30个循环。 每个循环包括：变性94℃ 1min，退火 55℃ 1min，聚合72℃ 1.5min。最后一个 循环的聚合延长为10min。
??一病原学检测?一微量补体结合试验?二查毒试验?三反转录聚合酶链反应rtpcr技术?四病毒中和试验vn?五反向间接血凝试验?二血清学检测?二血清学检测?一病毒感染相关via抗原琼脂凝胶免疫扩散试验viaagid?二fmd正向间接血凝试验?三3abc非结构蛋白抗体elisa?四液相阻断酶联免疫吸附试验lpbelisa一病原学检测一病原学检测?三反转录聚合酶链反应rtpcr技术技术五反向间接血凝试验三三反转录反转录聚合酶链反应聚合酶链反应rtrtpcrpcr技术技术?一材料?1样品的采集和处理
2、加样 取6μ l~8μ l PCR扩增产物和2μ l~3μ l 加样缓冲液混匀后加入一个加样孔。每 次电泳至少加1孔阳性对照的扩增产物为 对照。
3、电泳 电压80V~100V，或电流40mA~50mA， 电泳30min~40min。
4、结果观察和判定 电泳结束后，取出凝胶板置于紫外透射 仪上打开紫外灯观察，如某一待检样品 扩增产物的DNA带与阳性对照的带在一条 直线上，即它们与加样孔的距离相同， 则该样品判定为阳性。
口蹄疫实验室诊断
口蹄疫实验室诊断
1、国家和行业标准： 口蹄疫诊断技术 GB/T 18935-2003 2、目前无行业标准。
口蹄疫的诊断与防制
服务部的消毒防疫工作
✓ 对管理员和销售员的要求
✓ 管理员、销售员下乡过程中应将车辆停靠在远离养户猪舍的地方，进入 猪舍，必须更换养户的工作鞋，禁止穿着自身水鞋进入养户猪舍， 尽量 减少触摸猪只。
鼻镜病变
乳房病变
母猪奶头起泡，仔猪吃 有水泡奶头，造成接触 性传播。
乳头水泡
乳房水泡
舌头水泡
病理变化
• 心包膜有弥散性及点状出血，心肌 切面有灰白色或淡黄色斑点或条纹 ，所谓“虎斑心”。
• 其他组织或脏器无明显病变。
“虎斑心”
口蹄疫的免疫
• 种猪10月下旬加强一次普免工作，疫苗使用金宇 三价苗（生产技术部统一采购调拨），剂量1头份 。
除政府调拨疫苗中农型苗封存外其他种类口蹄疫疫苗全面清理可尽快用于肉猪免疫1015日前使用完毕疫情发生后应立即进行流行病学调查采样送检特别是调查疫苗免疫情况对免疫不到位或免疫情况不明的猪群加强一次普免在生产技术部指导下进行
口蹄疫的诊断与防 制
口蹄疫
• 政治经济病 • 世界动物卫生组织（OIE)将其列为A类
传染病 • 口蹄疫的发生对养殖场是一场不折不
扣的灾难 • 导致的经济损失巨大
病原 猪苗运输车必须在服务部消毒两次之后，两次间隔15分钟，领取消毒证之后才可以前往猪场。
每次下乡回来或销售完毕猪只，必须先对车辆、水鞋进行严格消毒，并更换衣服，洗手洗脸，再去饭堂、娱乐室等公共场所 。
对碱性敏感，1%的烧碱1分钟可杀死病毒。 原则上肉猪使用中农威特二价苗（生产技术部统一采购调拨）。
（仔猪）
病猪蹄甲与皮肤接触 处发白，起水泡。
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口蹄疫监测诊断作业指导书
一、口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体检测酶联免疫吸附试验
1. 适用范围
用于检测猪、牛、羊血清中的口蹄疫病毒VPI 结构蛋白抗体，与猪、牛、羊口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒联合使用，可区分口蹄疫病毒感染动物及疫苗免疫动物。
检测猪血清应用猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒；检测牛、羊血清应用牛、羊口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒。
2. 检测试剂
口蹄疫病毒VP1 抗原包被板、样品稀释液、酶结合物、阴性对照、VP1阳性对照、酶结合物稀释液、TMB底物A液、TMB底物B液、终止液（I.OMHZSQ）、浓缩洗涤液、稀释板、一次性封板膜、微孔定位标签。
3. 检测步骤
3.1使用前将试剂盒恢复到室温，避免阳光直射或放置在30C 以上的环境中。
3.2取出试剂盒中的样品稀释液。
A1、B1 两孔作为阴性对照，
CI 、D1 两孔作为阳性对照孔，其余孔作检测孔，每孔一个样品。
3.3在稀释板的各孔中加200样品稀释液。
在相应各孔中分别加
入10 此对照血清或被检血清样品。
用加样器重复吹吸数次。
稀释每个
样品时必须使用不同的吸头。
3.4取出抗原包被板。
3.5分别从稀释板上取稀释后的对照血清和被检血清各100 此，加至抗原包被板的相应孔中，加益或封膜后，置37 士2C下孵育60 士5 分钟。
3.6洗涤工作液配制：按需要量，用去产离子水或双蒸水将洗涤
液作25 倍稀释。
3.7用洗涤工作液洗涤抗原包被板，每孔300 吨，洗涤6 次，拍干。
3.8酶结合物工作液配制：用酶结合物稀释液将酶结合物作100 倍稀释，现配现用。
3.9每孔加入100此酶结合物工作液，加盖或封膜后，置37 士2C 下孵育30± 2 分钟。
3.10 重复3.7。
3.1仃MB底物工作液配制：将TMB底物B液和TMB底物A液等量
混合，现配现用。
3.12每孔加入100此底物工作液，加盖或封膜后，置37 士2C下孵育15士1 分钟。
3.13 每孔加入100此终止液，并轻轻振荡混匀。
3.14在15分钟内，用酶联读数仪测定在450nln波长下的OD直。
结果判定4.1 猪口蹄疫病毒vPI 结构蛋白抗体检测结果判定：
4.1.1阴性对照孔平均0D值应续0.15，每个阳性对照孔0D值应妻
0.5，且簇2.0。
否则，试验无效。
临界值=0.23X阳性对照孔平均
OD值。
4.1.2被检样品孔OD直＜临界值时、判为阴性，即为抗口蹄疫病毒VPI 结构蛋白抗体阴性。
4.1.3被检样品孔OD直＞临界值，判为阳性。
4.1.4对判定结果为阳性的样品，应用2个孔进行重复检测。
重复检测后，若至少有一个孔为阳性，则判为口蹄疫病毒VPI结构蛋白抗体阳性，若两孔均为阴性，则判为口蹄疫病毒VPI 结构蛋白抗体阴性。
4.1.5当猪口蹄疫病毒vPI 结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒与猪口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒联合使用时，按下列标准进行最终判定}
4.2 牛、羊口蹄疫病毒VPI 结构蛋白抗体检测结果判定：
4.2.1阴性对照孔平均O□值应W 0.2，每个阳性对照孔OD直应＞0.5，且W 2.0。
否则，试验无效。
临界值=0.23x阳性对照孔平均OD直。
4.2.2被检样品孔OD值V临界值时，判为阴性，即为抗口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体阴性。
4.2.3被检样品孔OD直》临界值，判为阳性。
4.2.4 对判定结果为阳性的样品，应用2个孔进行重复检测。
重复检测后，若至少有一个孔为阳性，则判为口蹄疫病毒VPI 结构蛋白抗体阳性，若两孔均为阴性，则判为口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体阴
性。
425当牛、羊口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒与牛、羊口蹄疫病毒非结构蛋白抗体酶联免疫吸附试验诊断试剂盒联合使用时，按下列标准进行最终判定。