最新植物组培外植体消毒详解
附录4植物组织培养中外植物表面的消毒-苏教版选修1生物技术实践教案
附录4：植物组织培养中外植物表面的消毒1. 背景外植物表面的杂菌、病毒等微生物对于植物组织培养非常不利，它们会繁殖并感染外植物，造成组织失去生长能力，从而导致培养失败。
所以在植物组织培养过程中，对于外植物表面进行消毒是必不可少的环节。
2. 消毒步骤2.1 选择适宜的消毒剂消毒剂的选择至关重要，不同的消毒剂对于不同的微生物有不同的消毒效果。
但总的原则是：选择高效广谱的消毒剂，并严格按照说明书使用。
•原液消毒剂常用的有石灰作为消毒剂，石灰的作用是增加培养环境的碱度，增加微生物的灭菌率。
•75%酒精酒精具有快速杀灭菌的作用，对于大部分的微生物有效。
•过氧化氢过氧化氢是一种氧化性消毒剂，可以对细菌、病毒等具有破坏作用。
常用浓度为0.5%。
2.2 材料准备一些常见的材料包括：•消毒液：按照说明书配制消毒液；•安全剪刀和镊子：用于在消毒盘中拿取（转移）外植物；•换酒精棉或棉签：用于在操作过程中对镊子、剪刀等工具进行消毒。
2.3 操作步骤•步骤1：将待消毒的组织（或植株）用干净的剪刀切割成小块，接下来严格实行消毒操作；•步骤2：取出消毒液，倒入消毒盘中准备使用；•步骤3：将需要消毒的部分逐一刀除，镊子夹取，浸泡消毒液内约5min，或按要求局部消毒；•步骤4：消毒后再挑开，洗2~3遍净草,放入干净培养瓶中即可。
3. 注意事项为了确保消毒的效果，需要注意以下几点：•操作前必须认真阅读消毒剂说明书，按说明书的要求配制消毒液；•操作时要佩戴手套，避免消毒剂对皮肤造成损害；•注意安全，要将消毒液、手套等放在固定的地方，以免造成不必要的伤害；•操作时保证环境清洁，避免再次感染。
4. 结束语对于植物组织培养实验，消毒步骤是必不可少的环节，正确地进行消毒可以最大限度地避免微生物对于实验结果的影响。
希望通过这个附录，对大家关于植物组织培养中的消毒有更深入的了解。
组培实验室常见消毒方法优劣比较
组培实验室常见消毒方法优劣比拟组培实验室是生命科学及相关学科实验室建设中必备的实验室。
组培实验室的消毒是实验室一般治理工作的重要环节，直接关系着组培实验的成功与否和组培幼苗的质量上下。
组培实验室的消毒一般又可分为环境消毒、培养基消毒和外植体的消毒。
培养基的消毒主要是在高压灭菌锅中进行，在此不再赘述。
环境消毒和外植体的消毒则有多种方法，这些方法各有优劣，使用不当时还会对人体产生损害，为此，笔者特对这些典型方法进行分析比拟，为组培实验室的科学治理提供一些参考。
1 组培实验室的环境消毒保持组培实验室的空气清洁度是减少组培污染的重要条件，用于实验室消毒的常规消毒方法包含紫外线照耀法、甲醛熏蒸法、新洁尔灭(苯扎溴铵溶液)法等，比拟新的方法有中草药消毒法。
1.1 紫外线照耀法紫外线是波长在10-400 nm之间辐射光的总称，能引起细菌、病毒等微生物遗传物质的结构发生变化，从而影响DNA复制、RNA转录和蛋白质的翻译，导致病菌或病毒死亡。
此外，紫外线辐射所产生的臭氧和各种自由基可损伤蛋白质和酶分子，导致功能改变。
紫外线消毒具有广谱性，可杀灭细菌、病毒、真菌、支原体等各种微生物。
紫外消毒具有较高的杀菌效率，且由于未使用化学药剂，消毒过程中不会产生对人体和环境有害的副产物。
该技术运行维护简单，费用较低。
采纳室内悬吊式紫外线消毒时，室内安装紫外消毒灯的数量为每平方不少于1. 5 W，照耀时间不少于30 min。
但需要指出的是，过量的紫外线照耀对人体有肯定的危害乃至致癌作用。
紫外线作用于中枢神经系统，可出现头痛、头晕、体温升高等病症。
过量辐射会诱发皮肤癌。
紫外辐射对眼睛的损伤特别明显，严峻时可能诱发白内障。
因此，当组培实验室在用紫外消毒期间，工作人员不要呆在正消毒的空间内，切忌用眼睛凝视紫外灯。
特别的，如超净工作台内的紫外灯翻开消毒时，应预防将手长时间暴漏于紫外灯下。
一般在接种室用紫外线消毒后，不要马上进入接种室，此时室内充满高浓度的臭氧，会对人体，尤其是呼吸系统造成损害。
植物表面消毒
植物组织培养外植体选择及其消毒★外植体选择的原则：1、必须含有活细胞。
2、幼嫩组织所含活跃分裂的细胞比例高。
3、母珠必须健康并且无任何腐烂或生病的迹象。
4、母珠必须活跃生长并且不会立即进入休眠。
★外植体的确定选择：1、茎尖（植物组织培养中应用最多，繁殖率高，不易发生遗传变异，但取材有限）；2、茎段（采用嫩茎的切段促进腋芽萌发，取材容易）；3、叶（幼嫩叶片组织通过愈伤组织或不定芽分化产生植株，取材容易，操作方便，但易发生变异）；4、花球和花蕾；5、种子、根、块根、块茎、花瓣等。
★消毒的原则：消毒剂与外植体应接触足够长的时间以除去外植体表面的微生物，但应尽量减少对外植体细胞的破坏。
★消毒方法：冲洗植物材料除去泥土等大的颗粒→浸入70-75％乙醇，有利于植物表面的浸湿→用消毒剂，如：5-20％NaClO溶液（加1滴表面活性剂）表面消毒5-10min→用无菌水冲洗至少3遍→与消毒剂接触过的切面在转移到无菌培养基前应切去，因为消毒剂会杀死外露的细胞从而影响营养吸收→切取外植体，通常为10mm的茎段和直径10mm的叶片部分（太大激素作用减弱，太小则不易成活）。
★消毒注意事项：1、表面消毒剂对植物组织是有害的，应正确选择消毒剂的浓度和处理时间，以减少组织的死亡。
2、在表面消毒后，必须用无菌水漂洗材料3次以上以除去残留杀菌剂。
3、与消毒剂接触过的切面在转移到无菌基质前需将其切除，因为消毒剂会阻碍植物细胞对基质中营养物质的吸收。
4、若外植体污染严重则应先用流水漂洗1小时以上或先种子培养得到无菌种苗，然后用其各个部分建立组织培养。
5、消毒剂用HgCl2效果最好（使用时间在3－8min），但对人的危害最大，用后要用水冲洗至少5次。
实验二 外植体的消毒接种与培养
实验二外植体的消毒接种与培养一、实验目的本次实验主要是为了掌握外植体的消毒、接种和培养技术，了解外植体的形态特征和生长规律，为后续的组织培养和基因转化提供基础。
二、实验原理1.外植体的消毒外植体是指从植物细胞或组织中切取的一小段或一小块，应用于外植体培养中。
外植体在切取和处理过程中容易受到细菌和真菌的污染，所以需要对外植体进行消毒处理。
消毒方法分为物理消毒和化学消毒两种。
物理消毒主要是利用高温烤过或微波消毒，化学消毒则是利用消毒剂进行消毒。
本实验中，我们采用化学消毒的方法，使用70%酒精和0.1%次氯酸钠溶液进行消毒处理。
接种是指将消毒好的外植体移植到培养基上，进行生长和分化。
接种需要注意接种时间、接种方式和接种密度。
外植体的培养主要依靠培养基和培养条件的控制。
培养基的配制和不同植物种类、发育阶段和培养目的有关。
培养条件主要包括光周期、光强度、温度、湿度等。
对不同植物种类和培养阶段，要采取不同的培养条件进行调整。
三、实验操作1. 实验材料和设备氧化锌瓶、脱脂棉、酒精棉球、玻璃针、外植体、琼脂、MS基本培养基、10%蔗糖溶液、0.8%琼脂糖、0.1%次氯酸钠溶液、高温烤箱、显微镜、组织取片剪刀、组织取片镊子。
2. 实验步骤（1）消毒外植体的消毒是外植体培养中的一个必要步骤。
将外植体放入脱脂棉盒中，加入70%酒精或0.1%次氯酸钠溶液进行浸泡消毒，时间一般为3-5分钟。
消毒后用脱脂棉纸吸干余液，进行无菌操作。
（2）接种将已消毒好的外植体用组织取片剪刀分割成2-3mm长的段，将其移植到琼脂中，培养基为MS基本培养基，添加10%蔗糖和0.8%琼脂糖。
接种时注意切口与琼脂接触，并尽量避免外植体处于吸水的状态，以减少周围细胞破裂。
（3）培养将已接种好的外植体置于温度适宜、光照强度适中的培养箱内，在合适的光周期下进行培养，并观察外植体的生长状态。
观察时应注意以下几点：①外植体的生理状况：生长慢、残缺、干瘪、腐烂、出现菌丝等表明外植体存在刺伤、污染等问题。
外植体消毒的一般步骤
外植体消毒的一般步骤在植物组织培养中，外植体消毒是非常重要的一步，它关系到实验的成败。
以下是外植体消毒的一般步骤：1.剪取外植体在消毒前，需要选取健康、无病虫害的外植体。
剪取时要保证无菌操作，避免污染。
一般选取植物的新鲜、幼嫩的部分作为外植体。
2.清洗外植体剪取后的外植体需要用无菌水或酒精进行清洗。
要多次清洗，以去除表面的杂质和细菌。
在清洗时，应注意不要损伤外植体。
3.切除两端为了防止两端感染，在外植体两端用火焰消毒或75%酒精浸泡2-3分钟。
然后切除两端，减小接触面积，避免污染。
4.浸泡在酒精中将外植体完全浸泡在75%酒精中，取出后用无菌水冲洗。
这样可使外植体表面的细菌和病毒失去活性，提高消毒效果。
5.取出并用无菌水冲洗将外植体从酒精中取出，用无菌水冲洗干净。
在冲洗时，要确保每个外植体都冲洗到位，以避免残留物影响培养效果。
6.消毒剂处理在外植体上涂抹一层消毒剂，进行进一步的杀菌处理。
涂抹时要适量，避免过度使用导致外植体损伤。
7.无菌水冲洗用无菌水冲洗外植体，重复多次，确保外植体表面没有消毒剂残留。
在冲洗时，要注意更换无菌水，以确保冲洗效果。
8.滤纸吸干表面水分在外植体表面用滤纸吸干水分，确保外植体保持干燥。
这一步可以有效避免培养过程中出现水分过多导致霉变的情况。
9.接种到培养基中将外植体轻轻插入培养基中，注意不要损坏外植体和培养基。
接种时需要保证无菌操作，避免带入新的污染源。
以上就是外植体消毒的一般步骤，希望能对你有所帮助。
在进行实验时，一定要注意无菌操作，确保每个步骤都符合要求，以获得良好的实验效果。
植物组织培养室及培养用具的消毒与灭菌（3学时）
实验一植物组织培养室及培养用具的消毒与灭菌（3学时）一、目的要求1、通过实验，培养学生良好的卫生观念，确立组织培养的无菌意识；2、掌握组织培养室的消毒及灭菌方法。
3、掌握培养用具的干热灭菌的一般操作技术。
二、仪器与用具1、用具：喷雾器、工作服、口罩、手套等；2、药品：2%新洁尔灭，高锰酸钾，甲醛，70%酒精。
三、方法步骤（一）植物组织培养室的灭菌1、地面、墙壁和工作台的灭菌：用2%新洁尔灭喷雾。
（1）配方：取新洁尔灭原液20ml，加水980ml，配成2%新洁尔灭溶液。
（2）方法：将配好的2%新洁尔灭溶液倒入喷雾器内，进行均匀喷雾。
（3）注意事项：①墙壁、角落、地面喷雾要均匀，不要遗漏；②注意安全，在喷房顶时，要特别小心，防止药液雾滴掉入眼睛。
2、无菌室和培养室的灭菌：用甲醛和高锰酸钾熏蒸，1年中熏蒸1-2次。
（1）配方：每立方米空间用甲醛10ml加高锰酸钾5g的配比液熏蒸。
（2）方法：首先房子要密封。
然后在房子中间放一口缸或大烧杯，将称好的高锰酸钾放入缸内，再把已称量的甲醛溶液慢慢倒入缸内，完毕，人迅速离开，并关上门，密封3天。
（3）注意事项：①操作前要戴好口罩及手套；②倒入甲醛时要小心，因为甲醛遇到高锰酸钾会迅速沸腾，并产生大量烟雾。
操作时人要迅速避开烟雾；③3天后，打开房间，搬走费液缸；一周后，方可进入操作。
3、在已经熏蒸过的房间内，用70%酒精纱布擦洗培养架、工作台。
4、用紫外灯照射20—30min。
5、使用前，再用70%酒精喷雾，使空间灰尘落下。
（二）培养基的灭菌——高压蒸汽灭菌（湿热灭菌法）（1）洗涤：把组织培养基用的培养皿、三角瓶、试管等玻璃器皿进行彻底清洗。
自然晾干或烘箱干燥。
（2）包扎：用牛皮纸、报纸、纱布或锡箔纸把玻璃器皿和金属器械分别包扎好。
（3）装水：在高压灭菌锅内装入一定量的水（水要淹没电热丝）。
（切忌干烧！）（4）装物品：在灭菌锅内放入含培养基的培养瓶或三角瓶、装蒸馏水的玻璃瓶，以及包扎好的玻璃器皿和金属器械等。
植物组织培养室及培养用具的消毒与灭菌
植物组织培养室及培养用具的消毒与灭菌一、目的要求1、通过实验，培养学生良好的卫生观念，确立组织培养的无菌意识。
2、掌握组织培养室的消毒及灭菌方法。
3、掌握培养用具的干热灭菌的一般操作技术。
二、仪器与用具1、用具：喷雾器、工作服、口罩、手套等。
2、药品：2%新洁尔灭，高锰酸钾，甲醛，70%酒精。
三、方法步骤（一）植物组织培养室的灭菌1、地面、墙壁和工作台的灭菌：用2%新洁尔灭喷雾。
（1）配方：取新洁尔灭原液20ml，加水980ml，配成2%新洁尔灭溶液。
（2）方法：将配好的2%新洁尔灭溶液倒入喷雾器内，进行均匀喷雾。
（3）注意事项：①墙壁、角落、地面喷雾要均匀，不要遗漏；②注意安全，在喷房顶时，要特别小心，防止药液雾滴掉入眼睛。
2、无菌室和培养室的灭菌：用甲醛和高锰酸钾熏蒸，1年中熏蒸1-2次。
（1）配方：每立方米空间用甲醛10ml加高锰酸钾5g的配比液熏蒸。
（2）方法：首先房子要密封。
然后在房子中间放一口缸或大烧杯，将称好的高锰酸钾放入缸内，再把已称量的甲醛溶液慢慢倒入缸内，完毕，人迅速离开，并关上门，密封3天。
（3）注意事项：①操作前要戴好口罩及手套；②倒入甲醛时要小心，因为甲醛遇到高锰酸钾会迅速沸腾，并产生大量烟雾。
操作时人要迅速避开烟雾；③3天后，打开房间，搬走费液缸；一周后，方可进入操作。
3、在已经熏蒸过的房间内，用70%酒精纱布擦洗培养架、工作台。
4、用紫外灯照射20—30min。
5、使用前，再用70%酒精喷雾，使空间灰尘落下。
（二）培养基的灭菌——高压蒸汽灭菌（湿热灭菌法）（1）洗涤：把组织培养基用的培养皿、三角瓶、试管等玻璃器皿进行彻底清洗。
自然晾干或烘箱干燥。
（2）包扎：用牛皮纸、报纸、纱布或锡箔纸把玻璃器皿和金属器械分别包扎好。
（3）装水：在高压灭菌锅内装入一定量的水（水要淹没电热丝）。
（切忌干烧！）（4）装物品：在灭菌锅内放入含培养基的培养瓶或三角瓶、装蒸馏水的玻璃瓶，以及包扎好的玻璃器皿和金属器械等。
植物组织培养中的清洗、消毒灭菌技术
植物组织培养中的清洗、消毒灭菌技术1、清洗植物组织培养用的各种玻璃器皿，特别是培养瓶和盛培养基的器皿，一定要严格清洗，以防油污、重金属离子、酸、碱等有害物质残留在瓶内，影响培养物的生长。
使用过的玻璃器皿应及时清洗，先将污物如培养基、培养物倒掉，再浸入水中，然后洗涤。
玻璃器皿的洗涤，可根据器皿的污染程度和性质，采用不同的方法，通常有碱洗法和酸洗法。
凡有微生物污染的器皿，必须先进行高压消毒和煮沸，以杀死菌体，否则会产生孢子飞扬，污染环境，给组织培养带来严重困难。
器皿洗净后，应烘干或晾干，放在规定的地方，便于取用。
常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类，即：物理方法如干热(烘烧和灼烧)、湿热(常压或高压蒸煮)、射线处理(紫外线、超声波、微波)、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施；化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。
这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用湿热灭菌（培养基）培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。
高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。
在o．1MPa的压力下，锅内温度达121℃。
在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。
注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。
高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。
常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到O．05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。
三次放气后，关阀再通电，压力表上升达0．1-0．15Mpa时，维持15-20min。
?对高压灭菌后不变质的物品，如无菌水、栽培介质、接种用具，可以延长灭菌时间或提高压力。
而培养基要严格遵守保压时间，既要保压彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，不能随意延长时间。
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植物组培外植体消毒详解
外植体的消毒植物组织培养用的外植体大部分取自田间，表面上附着大量的微生物，这是组织培养的一大障碍。
因此在材料接种培养前必须要消毒处理，消毒一方面要求把材料表面上的各种微生物杀灭，同时又不能损伤或只轻微损伤组织材料而不影响其生长。
因此，外植体的消毒处理是植物组织培养工作中的重要一环。
(1)常用的消毒剂常用的消毒剂如下表所示。
理想的消毒剂应具有消毒效果好，易被无菌水冲洗掉或能自行分解，对材料损伤小，对人体及其他生物无害，来源广泛，价格低廉。
常用消毒剂的使用方法及效果
①酒精
酒精是最常用的表面消毒剂，以70%~75% 酒精杀菌效果最好，95% 或无水酒精会使菌体表面蛋白质快速脱水凝固，形成一层干燥膜，阻止了酒精的继续渗
入，杀菌效果大大降低。
酒精具有较强的穿透力，使菌体蛋白质变性，杀菌效果好。
同时它还具有较强的湿润作用，可排除材料上的空气，利于其他消毒剂的渗入。
但酒精对植物材料的杀伤作用也很大，浸泡时间过长，植物材料的生长将会受到影响，甚至被酒精杀死，使用时应严格控制时间。
但酒精不能彻底消毒，一般不单独使用，多与其他消毒剂配合使用。
②升汞
又称氯化汞，Hg2+ 可以与带负电荷的蛋白质结合，使蛋白质变性，从而杀死菌体。
升汞的消毒效果极佳，但易在植物材料上残留，消毒后需用无菌水反复多次冲洗。
升汞对环境危害大，对人畜的毒性极强，使用后应做好回收工作。
③次氯酸钠
次氯酸钠是一种较好的消毒剂，它可以释放出活性氯离子，从而杀死菌体。
其消毒能力很强，不易残留，对环境无害。
但次氯酸钠溶液碱性很强，对植物材料也有一定的破坏作用。
④漂白粉
漂白粉的有效成分是次氯酸钙[Ca(ClO)2] ，消毒效果很好，对环境无害。
它易吸潮散失有效氯而失效，故要密封保藏。
⑤过氧化氢
也称双氧水，消毒效果好，易清除，又不会损伤外植体，常用于叶片的消毒。
⑥新洁尔灭
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这是一种广普表面活性消毒剂，对绝大多数植物外植体伤害很小，杀菌效果好。
（2 ）消毒方法
①茎尖、茎段及叶片等的消毒
消毒前先对植物组织进行修整，去掉不需要的部分，然后用自来水冲洗。
对于一些表面不光滑或长有绒毛的材料，可用洗涤剂清洗，必要时用毛刷充分刷洗，硬质材料可用刀刮。
消毒时在超净台上操作，先用70%酒精浸泡10~30s，以无菌水冲洗2~3 次, 然后按材料的老、嫩和枝条的坚实程度，分别采用2%次氯酸钠浸泡10~15mi n
或用0.1%升汞浸5~10min。
消毒时要不断搅动，使植物材料与消毒剂充分地接触。
若材料有绒毛，最好在消毒液中加入几滴Tween-20，最后用无菌水冲洗3~5 次。
②果实及种子的消毒
先用自来水冲洗10~20min，再用酒精迅速漂洗一下。
果实用2%次氯酸钠浸
10min，后用无菌水冲洗2~3次。
种子则先用10%次氯酸钠浸泡20~30min，难以消毒的可用0.1%升汞消毒5~10min。
对于种皮太硬的种子，也可预先去掉种皮，再用4%次氯酸钠浸泡8~10min。
③花药的消毒
用于组织培养的花药多未成熟，其外面有花萼、花瓣或颖片保护，处于无菌状态。
消毒时将整个花蕾或幼穗用70%酒精浸泡数秒钟，然后用无菌水冲洗2~3 次，再在漂白粉中浸泡10min，最后用无菌水冲洗2~3次。
④根及底下部器官的消毒
由于这类材料生长于土壤中，表面带菌量大，消毒较为困难。
可先用自来水冲洗，软毛刷刷洗，用刀切去损伤及污染严重部位，再用酒精漂洗后，置于0.1% 升汞中浸5~10min或2%次氯酸钠中浸10~15min，最后用无菌水冲洗3次。
在操作时要根据材料的大小、幼嫩、质地等差异做出判断后，再选择适宜的消毒剂种类、浓度和消毒时间，切不可生搬硬套。
消毒的最佳效果应以最大限度地杀死材料上的微生物，而又对材料的损伤最小为好。