细胞与组织培养技术
细胞生物学中的组织培养技术
细胞生物学中的组织培养技术随着科技的不断发展，细胞生物学中的组织培养技术也在不断更新优化。
组织培养技术是一种将细胞从其自然环境中剥离出来，并在人工环境下为其提供营养和生长条件的技术。
这项技术可以被应用于各个领域，如生物医学、生物物理学和生态学等。
一、组织培养技术的历史组织培养技术最早起源于19世纪晚期。
当时的细胞学家们通过组织培养技术，成功地将细胞从组织中分离出来并且保持其存活状态。
后来，随着研究的深入，组织培养技术不断发展壮大，发展成为今天广泛应用的一项生物技术。
二、组织培养技术的基本原理组织培养技术是将细胞从其自然环境中分离出来，然后在密闭的培养器中培养，为其提供营养和生长条件的一项技术。
其基本原理是培养细胞所需的必备条件是营养物质、温度、湿度、氧气、二氧化碳和细胞增殖激素等。
目前，主要的组织培养技术包括原代细胞培养和细胞系培养。
三、组织培养技术的应用组织培养技术可以被广泛地应用于医学研究、药物研发、生物学研究等领域。
在医学研究方面，组织培养技术可以用于研究肿瘤细胞发生和进化、研究细胞生长、发育和再生、研究免疫学和感染病毒学等。
在药物研发方面，组织培养技术可以用于筛选化合物，评估药物毒性以及研究药物代谢和毒性机制。
在生物学研究方面，组织培养技术可以用于研究细胞生命周期、细胞的基本结构和功能以及遗传学和生态学等方面。
四、组织培养技术的优势组织培养技术有着很多优势。
首先，组织培养技术可以让细胞摆脱自然环境中的干扰，让其处于一种理想的状态下，并进行特定的实验。
其次，组织培养技术可以控制实验条件，让实验结果更加准确。
最后，组织培养技术可以为科研人员提供更多的研究方法和工具，从而更好的解决问题。
五、组织培养技术的挑战在利用组织培养技术进行研究的过程中，科研人员也会面临着一些挑战。
首先，组织培养技术不同于自然环境，存在一定的局限性。
其次，细胞在培养的过程中容易失去其原有的形态和功能。
最后，组织培养技术也需要大量的专业知识和技术，如果应用不当则可能导致实验失败或者数据不准确。
细胞及组织培养的准备工作
细胞及组织培养的准备工作一、实验目的1.掌握细胞培养的基本概念2.了解细胞培养的基本条件3.掌握清洗和消毒的基本方法4.学习细胞培养使用液的配制及准备方法二、实验原理1.细胞培养的基本概念细胞培养是用酶消化法将组织碎块分离成单个细胞，用培养基制成细胞悬液，在体外适宜条件下，使细胞生长繁殖，并保留其一定的结构和功能特性。
细胞培养与组织培养、器官培养主要不同点在于原始培养的对象不同。
细胞培养使用的是单个细胞悬液，组织培养使用的是组织块(0.5～1立方毫米)或薄片(厚0.2毫米)，而器官培养使用的是器官原基或器官的一部分或整个器官。
2. 组织细胞培养的优点能排除神经体液因素的影响及肝、肾解毒功能的干扰，观察某些因素或药物对培养细胞的直接作用。
通过实验可获得某一类型细胞的纯培养。
在细胞培养实验中能直接观察到培养细胞生命活动的动态过程。
3. 组织细胞培养的不足之处培养细胞失去体内细胞的制约和整体的调节作用，细胞形态和功能会发生一定程度的改变。
培养方法、实验试剂对细胞形态和功能有一定的影响。
长期体外培养的细胞，由于反复传代、冻存和操作等因素的影响，可能发生染色体非整倍体改变，呈永生化或癌变的特征。
4. 细胞及组织培养的基本条件（1）无污染的环境条件：物理污染；化学污染；生物污染。
（2）适当的温度：35－37℃(人和哺乳动物细胞)（3）气体环境与pH环境：pH7.2-7.4(人和哺乳动物细胞)（4）营养条件（5）其它条件：等渗条件、附着底物5.清洗与灭菌（1）清洗在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感。
微生物产品附带杂物，上次细胞残留物及非营养成分的化学物质，均能影响培养细胞的生长。
因此对新使用玻璃器皿和重新使用的培养器皿都要严格彻底的清洗，且要根据器皿的组成材料不同，选择不同的清洗方法。
玻璃器皿的清洗组织细胞培养中，使用量最大的是玻璃器皿，故工作最最大的是玻璃器皿的清洗。
一般玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤。
动物细胞与组织培养
动物细胞培养不能 最终培养成动物体
传代培养
动物细胞生长特性：
细胞贴壁： 悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上，
称为细胞贴壁。 要求：
培养瓶或培养皿的内表面光滑、无毒、易于贴附。 细胞的接触抑制：
当贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂 增殖，这种现象称为细胞的接触抑制。
细胞贴壁过程
3.有关概念:
注意： ①概念理解：原代培养、传代培养、细胞株 、 细胞系 ②胰蛋白酶处理的原因、目的和注意事项 ③动物细胞培养和植物组织培养的区别
思考与探究：
如何用细胞培养技术，为烧伤病 人植皮？
取该患者的皮肤进行 细胞培养,获得足量的细 胞后再移植
课堂反馈练习
1、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞是 --------------------（A ）
多细胞动物和人体的细胞 都生活在内环境中，根据你所 学的知识，认为体外培养细胞 应该模拟内环境的哪些内容呢？
动物细胞培养条件：
1、无菌、无毒的环境 （添加一定量的抗生素，定期更换培养液）
2、必须的营养物质 （葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、核酸、 嘌呤、嘧啶、激素、生长因子、动物血清等。）
3、适宜的温度 36.5+（-）0.5度
包权
人书友圈7.三端同步
动物细胞培养
1、概念（人教版） 动物细胞培养就是从动物机体中取出
相关的组织，将它分散成单个细胞，然后， 放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和 繁殖。
讨论
1、动物细胞培养的原理是什么？
2、从动物机体中要取出哪些相关组织？并 解释原因。
3、组织分散成单个细胞的方法是什么？ 其理论依据是什么？
D．培养至50代后继续传代的细胞是细胞株
组织培养技术的原理
组织培养技术的原理
嘿，恁问组织培养技术啥原理啊？那咱就好好唠唠。
组织培养技术这玩意儿啊，听着挺高深，其实也不难理解。
咱先说说啥是组织培养。
就是把一小块植物或者动物的组织，放在一个合适的环境里，让它能长大成一个完整的个体。
就像一个小种子，能长成一棵大树一样。
那它咋就能长大呢？这就靠细胞的分裂和分化。
细胞就像一个个小工人，它们会不断地分裂，一个变两个，两个变四个。
然后这些新的细胞会根据需要，变成不同的组织和器官。
就像盖房子一样，先有砖头，然后把砖头砌成墙，再盖成房子。
组织培养的环境也很重要。
得有合适的营养物质，就像人得吃饭一样，细胞也得有吃的才能长大。
还得有合适的温度、湿度和光照，不能太热也不能太冷，不能太干也不能太湿。
就像人得在一个舒服的地方才能生活得好。
还有啊，得防止细菌和病毒的感染。
要是有细菌和病毒，细胞就长不好了，就像人要是生病了，就没力气干活了。
所以得给细胞创造一个干净的环境，让它们能健康地长大。
咱举个例子哈。
俺村里有个种花的老王，他就用组织培养技术种兰花。
他先从一棵好的兰花上取一小块组织，放在培养瓶里。
然后给它加上合适的营养物质，放在一个温度、湿度都合适的地方。
过了一段时间，那些细胞就长成了一棵棵小兰花。
老王可高兴了，他说这组织培养技术可真厉害，能让他种出这么多好兰花。
所以啊，组织培养技术的原理就是靠细胞的分裂和分化，在合适的环境里让组织长大成一个完整的个体。
咱要是想种点啥好东西，也可以试试这技术。
动物细胞与组织培养
体内外细胞的差异 1. 与体内主要不同 相对孤立、相对单一，
缺乏体内的系统作用、失去神经体液的调节和细胞相互间的影响 2. 主要表现
抗原决定簇---抗原分子上可以诱导出抗体的部位或片段
多克隆抗体----一种抗原通常具有多个不同的抗原决定簇，因此能刺激多个 B 淋巴细胞产生 相应的单克隆抗体，因此血清中的抗体是针对不同抗原决定簇的单克隆抗体混合物，称为多 克隆抗体
杂交瘤细胞---将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的
人抗鼠抗体（HAMA）反应----鼠来源的单抗在人体内是外源物质，很可能会产生人体免疫系 统对它的排斥反应：产生抗鼠的抗体
血清的缺点 对大多数细胞，在体内状态，血清不是它们接触的生理学液体，可能改变某种细胞在体内的
正常状态 血清含一些对细胞产生毒性的物质 动物个体不同，血清产地、批号不同，每批质量差异甚大，其成分不能保持一致。 取材中可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响，可能导致实验失败或实验结果不可靠 性。 血清的使用使得实验和生产的标准化困难，其中的蛋白质使得某些转基因蛋白生物药品生产 中分离纯化工作很难完成。 大规模生产中，血清来源越来越困难，价格昂贵，是构成动物细胞培养对生产成本的主要部 分之一
体外培养细胞生存所需基本物质 （一）糖 （二）氨基酸 （三）维生素 （四）促生长因子 （五）其它物质
细胞培养的常用液体 水 平衡盐溶液---由无机盐、葡萄糖组成，维持细胞渗透压平衡，保持 pH 稳定及提供简单的营 养。主要用于取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗、配制其他试剂等。 消化液---进行原代培养时常常需要将组织块消化解离形成细胞悬液，传代培养时也需要将贴 壁细胞从瓶壁上消化下来。胰酶溶液和 EDTA 溶液，胶原酶溶液 消化酶抑制剂----血清，大豆胰蛋白酶抑制剂 pH 调整液----NaHCO3 溶液，HEPES 溶液 抗生素液---青霉素，链霉素 谷氨酰胺补充液----（1）频繁打开盖子，增加了破坏无菌状态的可能性；
细胞组织培养技术
细胞组织培养技术细胞组织培养技术是指利用体外培养方法，通过营养液、胶体培养基或固体培养基等，使细胞和组织在人工条件下继续存活、繁殖和发育的技术。
这一技术可以促进细胞和组织的生长、分化和分裂，为细胞学、生物学、生物化学及医学等领域的研究提供了可靠的实验材料。
一、细胞组织培养技术的原理细胞组织培养技术的技术原理是将细胞和组织收集出来，在实验室条件下，通过调整培养液的成分和pH值，再加入所需要的生长因子和荷尔蒙等刺激，来促进细胞生长、分化和分裂的过程。
细胞组织培养技术的实验操作过程非常重要，需要严格控制细胞的环境条件和生长因子的添加量，以确保细胞在培养过程中得到最佳的生长和繁殖的环境。
细胞组织培养技术的主要原理包括：1、原位组织培养：主要指直接用细胞培养的方法，解剖取出组织后立即进行细胞培养。
这种方法不需要组织分解的过程，可以直接获得组织原有的形态和生理功能，从而对生物学和医学研究提供良好的实验材料。
2、前处理组织培养：主要是在组织培养前，先对组织进行处理，以增加细胞的次级培养性。
这种方法可以通过对组织进行过渡性细胞重编程和激发达成目的，通常用于经过冷冻或提取后的组织培养过程中。
3、细胞单元培养：主要是通过将细胞分离成单元，然后按照需要的比例进行培养。
这种方法可以用于细胞的标本化处理和细胞单元组合的构建实验。
4、组织切片培养：主要是将组织切成小片后进行培养，可以见到切片上不同类型的细胞和细胞间的互动关系，从而对互动的生理和生化机制进行研究。
5、体外培养：主要是将选定的器官或细胞培养在培养基中，可以整个器官进行培养或只培养除器官的特定区域。
这种方法可以通过体外培养方法，获得特异性的细胞发育和生长特征，为医学研究提供可靠的依据。
6、半体外培养：是将生物体内的组织、细胞或其部分在体内带血供状态下结合体外培养技术，在一定范围内自动控制生物体的内环境和外环境，进行长期的实验操作，以便于控制和研究细胞生长和分化的机制。
植物组织培养与细胞培养技术研究
植物组织培养与细胞培养技术研究植物组织培养与细胞培养技术是现代生物技术领域中非常重要的一部分，它的应用广泛，包括农业、林业、医药和生物工程等多个领域。
它能够对植物进行育种、繁殖、遗传转化和基因修饰等研究，对于保护生物多样性和实现农业可持续发展具有重要作用。
植物组织培养技术是指通过细胞分离培养基和生长因子的作用，使植物体内的一系列细胞体外生长繁殖，最终形成新的植物个体的过程。
它包括原生质体培养、愈伤组织培养和植物再生技术等。
原生质体培养技术是指通过将植物细胞进行分离和培养，培养出单个细胞，然后通过电融合或化学刺激等方式将不同种类的原生质体进行融合，形成新的杂交种，产生具有新特性的植物个体。
目前这种技术在植物育种中已经得到了广泛的应用，例如水稻、玉米、小麦等作物的培育，不但可以提高作物的产量和抗病能力，同时可以丰富作物种类，实现农业可持续发展。
愈伤组织培养技术是指通过将植物切割或切除部分组织，然后将其进行培养，形成愈伤组织，进而通过细胞分裂和分化，形成新的植物个体。
这种技术的优点是可以进行无性繁殖，大大加快了培养和繁殖的速度，并且可以对植物组织进行遗传转化，培育出具有新特性的植物。
植物再生技术是指通过植物体的组织或细胞进行分化和再生，形成新的植物个体。
这种技术的优点是可以进行整体遗传改良，包括基因改造、基因转移等技术，例如将抗病基因、抗虫基因、早期成熟基因等导入到目标植物中，提高植物的产量和抗病抗虫能力。
细胞培养技术是指将植物体内的细胞在无菌的培养基上进行细胞培养，形成细胞群落。
这种技术通常是在实验室环境中进行的，目的是对植物的生理和代谢进行研究。
应用广泛的包括植物激素的研究、药物代谢机制等。
植物组织培养技术的应用非常广泛，不仅可以对植物进行改良，还可以用来繁殖罕见和濒危物种，恢复和保护生态环境，解决农业生产和森林经营中的问题。
但同时也应该注意到，植物组织培养技术的应用还存在一些问题，例如容易产生变异、突变和杂交，导致植物品种的稳定性和一致性下降，需要加强对其安全性和环境风险的评估和管理。
植物细胞和组织培养
植物细胞全能性及其表达
（一）植物细胞全能性的提出与证明
（二）胚性细胞 —— 植物的干细胞 （三）从分化细胞到胚性细胞
（二）胚性细胞 —— 植物的干细胞
在自然条件下，植物体内的许多细 胞可以不断地产生不定胚或芽，表 明它们保留着胚性。在自然界表现 出胚性的细胞可以分为三大类，即 早期胚胎细胞、茎端分生细胞和成 熟组织中遗留的胚性细胞。 最典型的例子是落地生根，其叶片 周缘组织特定部位中遗留的胚性细 胞能够沿著叶片的四周形成不定芽， 然后发育为具有根系的小植株，脱 Kalanchoe laxiflola 落到地面。
2. 器官分化
烟草的薄层表皮培养时，花枝 的薄层表皮只能产生花芽，植 株基部的薄层细胞只能产生营 养芽，中间部分的外植体能产 生两种类型的芽，但其间的比 例会有不同，这取决于它们与 植株基部距离的远近。花芽的 分化还受外源激素组成的影响， 只有当培养基中所含的激动素 和 IAA 的 克 分 子 浓 度 皆 为 106mol/L 时，花枝的表皮才能形 成花芽。若不改变 IAA 浓度， 把激动素浓度提高到10-5moI/L， 则会完全抑制花芽的形成，而 只出现营养芽。器官分化的基 因表达尚有待研究。
二、脱分化过程中细胞结构的变化 植物体内最大量的分化细胞是成熟的薄壁细胞，例如叶肉 细胞、表皮细胞、内皮层和髓部的薄壁细胞等，它们的细胞核 的体积较小，位于细胞边缘，细胞中央有一个大的液泡，细胞 质内核糖体密度较低，多聚核糖体数目很少，质体为分化程度 较高的叶绿体、杂色体、白色体或淀粉体。 在离体培养条件下烟草的叶肉细胞从第一次分裂开始即进 入脱分化的过程。通过数次有丝分裂，逐步转变为分生细胞， 核体积变大，占据中央位置，大液泡逐渐消失，液泡中出现一 种与细胞质生长相关的蛋白体 ，叶绿体通过缢裂和出芽生殖转 变为原质体。
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细胞活性测定方法：
1.染料排斥法：如台盼兰法，活细胞不着色，死细胞着色。
2.FDA-PI双色荧光镜检法：活细胞呈现黄绿色荧光，荧光越强，细胞 活性越高；死细胞呈橘红色荧光。 3.MTT法：活细胞中的琥珀酸脱氢酶可使四甲基偶氮唑盐（MTT）分 解产生兰色结晶状甲赞颗粒积于细胞内和细胞周围。其量与细胞数呈 正比，也与细胞活力呈正比。 4.Cell blue法：活细胞可将氧化还原染料刃天青转化为红色代谢产物， 该产物被激发后能发出590nm波长的荧光。
4.1640完全培养基的配制: 1640基础培养基
血清
85ml15ml源自双抗(青霉素和链霉素) 0.5ml
实验三 动物细胞的原代培养一（胰酶消化法）
实验目的 1、了解动物细胞原代培养的基本方法和操作过程。 2、了解原代培养细胞观察的方法。 实验原理 将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常 用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理， 分散成单细胞，臵合适的培养基中培养，使细胞得以 生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养。原代培养 可分为组织块培养法和消化法。
原代细胞培养的生命归宿
1.原代培养期：有细胞分裂，不旺盛；原 代培养细胞与体内原组织在形态结构和动能活 动上相似性大；细胞群呈异质性
2.传代期：持续时间最长，细胞增殖旺盛 3.衰退期：细胞增殖缓慢或不增殖；细胞 轮廓增强，最后衰退死亡
培养细胞的生长方式
1.贴壁依赖型：必须贴附于支持物表面才能生长， 大多数培养细胞都属于贴附生长型。
实验步骤： 1、在超净台内的酒精灯旁，将长满细胞的培养瓶中原来 的培养液弃去，加入37℃预温的PBS，轻轻振荡漂洗1-2次。 2、加入适量 0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液 中。盖上瓶盖，在37℃消化2-3min。 3、倒臵镜下观察细胞。随着时间的推移，原贴壁的细胞 逐渐趋于圆形，在还未漂起时将胰酶弃去，加入5ml培养液终 止消化。 观察消化也可以用肉眼，当见到瓶底发白并出现细针孔 空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1—3分钟。 4、用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液，分到另1瓶中，盖 上瓶盖，在培养瓶上做好标记，（细胞种类、日期等）臵 37℃下继续培养。
3.掌握动物细胞培养用液的配制和酸碱度调节方 法。 实验原理：
准备内容：1.实验用品的洗涤、包装和灭菌 2.准备酒精棉球，整理超净台 3.配制PBS KH2PO4 0.24g Nacl 8.0g KCl 0.2g NaHPO4 1.44g 加适量纯水溶解，调节pH值至7.4，定容至1000ml
实验二 动物培养用液的配制及过滤除菌
实验步骤： 1.将大鼠颈椎脱臼处死，臵医用酒精中泡2—3分钟，取大鼠带入超净台 内，臵平皿中，无菌条件下完整取出双侧股骨 。
2.在另一平皿中倒入适量PBS，将股骨浸泡于PBS中，无菌条件下剔除肌 肉和脂肪组织。
3.暴露股骨骨骺端，经PBS冲洗干净后剪去两端干骺端，暴露骨髓腔。 4.用注射器吸取2ml 1640完全培养液冲洗骨髓腔，冲洗液收集在小烧杯 中收集细胞，反复冲洗，直至冲出的液体发白为止。 5.加入适量新鲜培养液，用吸管轻轻吹打制成细胞悬液，接种于培养皿 内，臵5% CO、37℃饱和湿度培养箱内培养。
无菌操作的几个注意事项 1、操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦 试。试剂等瓶口也要擦试。 2、点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧 灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织， 吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。 3、操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染 机会。 4、不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。 5、瓶子开口后要尽量保持45°斜位。 6、吸溶液的吸管等不能混用。
实验七 培养细胞的超低温冻存与复苏
实验目的 掌握细胞冻存和复苏的方法。 实验原理 细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。细胞在培养过程中，为防止细胞 株不断传代引起的细胞老化、支原体污染、染色体和基因的变异等现象 的发生，可以通过冻存技术保存细胞。 在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰 晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH 改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰 点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞，减 少冰晶的形成。目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对 细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。 细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍 能生长，活力受损不大。
实验六 动物细胞的传代培养
实验目的 掌握贴壁细胞传代的方法。 实验原理 细胞在培养瓶增殖到一定密度后，细胞的生长和分裂 的速度就会减慢甚至停止，如不及时分离、传代，细胞将 逐渐衰老死亡。为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量 扩大，就必须进行传代（再培养）。 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也 是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直 接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
实验四 动物细胞的原代培养二（大鼠骨髓间 充质干细胞的培养）
骨髓间充质干细胞(Bone marrow stromal cells，BMSCs)是 存在于骨髓内的一种多能干结缔组织前体细胞，具有多 向分化潜能，在不同的诱导条件下能分化为软骨细胞、 成骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、肝细胞、血管内皮细胞 等。在胚胎发育过程中，软骨、骨、肌肉、肌腱、脂肪、 神经和髓基质等多种间充质组织由中胚层细胞分化而来， 这些前体细胞具有干细胞特性而被定义为间充质干细胞 (Mesenchymai stem ceiis，MSC)。骨髓间充质干细胞是骨 髓中的非造血干细胞。
培养用液包括：培养基（需要添加血清）
消化液
平衡盐溶液 一、培养基 现在多采用合成培养基，其成分包括氨基酸、葡 萄糖、维生素、无机盐及一些促生长因子、促贴壁因子等。常 用的有RPMI1640、DMEM等。 二、血清 多使用胎牛血清或优质小牛血清 三、消化液 常用的消化液有胰蛋白酶、EDTA以及胶原酶溶液， 以胰蛋白酶使用最多。酶液用于解离细胞间的蛋白质、胶原等， 使细胞离散。EDTA是二价螯合剂，能结合钙离子、镁离子，使 以来钙离子的的钙粘着蛋白失活而使细胞解离。 四、平衡盐溶液 如PBS、Hank’s液等
实验步骤： 1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中。 2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。 3、将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。 2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数 板之间。 3、静臵3分钟。 4、镜下观察，计算计数板四大格细胞已染色的细胞（死细胞）和未 染色的细胞（活细胞），压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计 算： 细胞数/ml＝(4大格细胞总数/4)×10000 细胞活力=活细胞数/总细胞数×100%
实验步骤： 1.将大鼠颈椎脱臼处死，臵医用酒精中泡2—3分钟，取大鼠带入超 净台内，臵平皿中，解剖取肝脏，臵于一新的平皿中。 2.用 Hank’s液 洗涤三次，并剔除脂肪、结缔组织血液等杂物。 3.用一新的手术剪将肝脏剪成小块，再用Hank’s液 洗三次，转移至 50ml离心管中。 4.视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃消化20-40分钟，每隔 5分钟震荡一次。 5.加入3-5ml培养基以终止胰酶消化作用。 6.静臵5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到10ml离心 管中。 7.1000rpm离心10分钟，弃上清液。
细胞与组织培养技术 动物细胞部分
实验安排： 第九周 实验一 动物细胞培养实验的器材准备 实验二 培养用液的配制及过滤除菌 第十周 实验三 培养细胞的形态观察 实验四 动物细胞的传代培养
实验五 培养细胞的超低温冻存
第十一周 实验六 实验七 冻存细胞的复苏 培养细胞的细胞计数与活性测定
第十二周 实验八 动物细胞的原代培养（大鼠骨髓间充质干细 胞的培养）
8.加入Hank’s液 5ml，重悬细胞，再离心一次，弃上清液。
9.加入适量培养基，重悬细胞，转移至培养皿中培养。
注意事项 1、自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。 2、在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。 3、凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细 菌落入。
细胞培养 是在体外模拟体内生理环境（温度、pH值、 营养条件等）使从体内取出的细胞生存、生长繁殖的 技术方法。
原代培养 又叫初代培养，是指从动物或人体内取出 细胞，经过一定的处理和分离，臵于适当的器皿或培 养基等条件下，培养至第1次传代之前的细胞培养阶段。 P17
传代培养 是指原代培养细胞在适应体外条件下后持 续生长增殖，达到一定细胞密度后，需要将细胞从一 个培养器皿以一定的比例转移到另一个装有新鲜培养 基的器皿中的这样一个过程称为传代培养。 细胞培养的优点及不足之处
实验步骤： （一）细胞冻存 1、超净台中消化细胞，将细胞悬液收集至离心管中。 2、1000rpm离心10分钟，弃上清液。 3、沉淀加含保护液的培养基。 4、将悬液分至冻存管中，每管0.8 ml。旋紧冻存管管盖。 5、在冻存管上标明细胞种类，冻存日期。 6、按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟〕→冰箱冷冻室（30分钟） →低温冰箱（－30℃ 1小时）→气态氮（30分钟）→液氮。 （二）细胞复苏 1、准备一个茶缸或1000ml的烧坏，内装2/3杯37℃的温水。 2、从液氮中取出冻存管、迅速臵于温水中并不断搅动。使冻存管中的 冻存物在1分钟之内融化。 3、在超净台中用75%乙醇擦拭冻存管外壁并打开，用吸管将细胞悬液 吸到离心管中。 4、1000rpm离心10分钟，弃去上清液。 5、沉淀加入适量培养液，吹打均匀，再离心10分钟，弃上清液。 6、加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中，37℃培养。
酚红对pH值的指示： pH值6.5 pH值7.0 pH值7.4 pH值7.8
黄色 橘红色 红色 紫红色