CCK8检测细胞增殖毒性的原理、方法及注意事项
cck8细胞增殖实验原理
cck8细胞增殖实验原理CCK-8细胞增殖实验原理引言：细胞增殖实验是生物学和医学研究中常用的一种实验方法，用于测定细胞的增殖能力。
CCK-8（Cell Counting Kit-8）是一种常用的细胞增殖检测试剂，通过测量细胞中的还原型CCK-8转化为溶液中的发色体，从而间接反映细胞增殖的能力。
本文将介绍CCK-8细胞增殖实验的原理及其应用。
一、CCK-8细胞增殖实验原理：CCK-8细胞增殖实验原理基于细胞代谢产物对试剂的还原作用。
CCK-8试剂中含有一种能被还原的黄色酶，当细胞活力高时，细胞内的代谢产物会将CCK-8试剂还原为有色产物。
实验原理如下：1. 细胞培养：将待测细胞接种于培养皿中，培养至适当的细胞数和状态。
2. 细胞处理：根据实际需求，对待测细胞进行处理，例如给予药物处理、基因转染等。
3. CCK-8试剂处理：将CCK-8试剂加入培养皿中，与细胞共同孵育一段时间。
4. 反应终止：孵育一段时间后，加入一种酸性溶液终止反应，阻止进一步的细胞代谢反应。
5. 测量吸光度：将培养皿中的溶液转移到微孔板中，使用酶标仪或多功能酶标仪在450 nm波长下测量吸光度。
6. 数据分析：根据吸光度值，计算细胞增殖的相对程度，比较不同处理组的细胞增殖能力。
二、CCK-8细胞增殖实验的应用：CCK-8细胞增殖实验广泛应用于生物医学研究、药物筛选、细胞毒性评价等领域。
以下列举几个常见的应用场景：1. 药物筛选：CCK-8实验可用于评估药物对细胞增殖的影响。
将细胞分为不同处理组，给予不同浓度的药物处理，通过测量吸光度值，评估药物对细胞增殖的抑制或促进作用。
2. 细胞毒性评价：CCK-8实验可用于评估化合物、材料或环境因素对细胞生存能力的影响。
通过测量吸光度值，判断待测物质对细胞的毒性程度。
3. 细胞增殖动力学研究：CCK-8实验可用于研究细胞增殖的动力学过程。
通过连续测量不同时间点的吸光度值，得到细胞增殖曲线，进一步分析细胞增殖速率和生长特性。
cck8检测细胞增殖原理
cck8检测细胞增殖原理
CCK-8（CellCountingKit-8）是一种广泛应用于细胞增殖及细胞毒性实验中的水溶性化合物。
CCK-8试剂盒可以用于评估各种生物、药物和化学物质对细胞增殖的影响。
CCK-8的实现原理是通过测定细胞内还原性代谢活性酶（如脱氢酶）生成的水溶性形式的四氮唑盐的量，从而评估细胞增殖情况。
使用CCK-8检测细胞增殖的方法十分简单。
首先，将待测物（如药物、化学物质等）加入到细胞培养液中，让细胞在特定时间内与其接触。
然后，向培养液中加入适量的CCK-8试剂，并在紫外线或荧光光谱仪中测量吸光度。
CCK-8的加入会使细胞内代谢活性酶发生还原反应，从而产生水溶性四氮唑盐，其吸光度与细胞数量成正比。
因此，吸光度越高，细胞数量也就越多。
CCK-8检测细胞增殖的优点在于其高度灵敏和高通量的特点，能够快速、准确地测定细胞数量，同时减少检测误差和节省实验时间。
因此，CCK-8已经成为了现代细胞生物学和药物研究中不可或缺的实验工具之一。
- 1 -。
CCK8相关检测介绍
CCK-8相关检测介绍K-8检测原理Cell Counting Kit -8，简称CCK-8，是一种广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速、高灵敏度检测试剂盒。
其检测原理在于，在电子耦合试剂存在的情况下，检测试剂中的WST-8（化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐）化合物被活细胞线粒体内脱氢酶还原成具有水溶性的橙黄色甲臜化合物,该物质在450 nm 处有最大吸收峰。
甲臜量与活细胞数成正比，即细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。
对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。
2.适用范围可用于细胞活力检测、细胞数量测定细胞增殖测定、细胞抑制、细胞粘附、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验等3.实验方法（1）细胞种板数及CCK-8孵育时间摸索根据实验所用细胞查阅文献查看该细胞的推荐种板密度或者自己梯度稀释细胞（如：1000、2000、4000、8000个/孔）种板，24h后加入CCK-8 10ul/孔，37℃孵育1~4h，可分别在0.5h、1h、1.5h、2h 分别读取OD450数值，选取OD值在1.0左右的时间段作为该细胞孵育时间。
（2）正式实验根据前期摸索结果将对数生长期的细胞（一般复苏后传代2次以上）以适宜的密度种板，使用基础培养基过夜饥饿培养后加入梯度稀释好的不同浓度药物，设置复孔3~6孔，根据实验目的选择药物孵育时间，药物孵育结束后加入10ul/孔CCK-8，37℃孵育适宜时间后使用酶标仪测定OD450，可测定OD650进行对照。
（3）分析实验结果4.注意事项种板：（1）离心后重悬细胞计数，多次吹打使其成为单一分散的细胞。
（2）制备细胞悬液于离心管中充分吹打后加入加样槽，铺板时先用枪均匀吹打悬液、上下左右各晃动相同次数后再铺板。
复孔作为一次铺板，先铺边缘一圈，每铺2排重新上下左右晃动细胞悬液并用排枪多次吹打。
铺完半块板后重新吹打细胞悬液重复上述操作。
CCK8检测细胞增殖毒性的原理、方法及注意事项
CCK8检测细胞增殖/毒性的原理、方法及注意事项一、CCK8检测细胞增殖/毒性的原理Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。
其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。
生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。
因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
用途：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验CCK8的优点：∙使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；∙CCK-8法能快速检测；∙CCK-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度；∙CCK-8法的重复性优于MTT 法；∙CCK-8法对细胞毒性小；∙CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。
CCK8的缺点：∙与MTT法相比，CCK8和XTT的价格比较贵。
∙CCK8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多加。
与以往的增殖/毒性测定试剂相比较：检测方法MTT法XTT法WST-1法CCK8法甲臢产物的水溶性差（需加有机溶剂溶解）好好好产品性状粉末2瓶溶液溶液1瓶溶液使用方法配成溶液后使用现配现用即开即用即开即用检测灵敏度高很高很高高检测时间较长较短较短最短检测波长560-600nm420-480nm420-480nm430-490nm细胞毒性高，细胞形态完全消失很低，细胞形态不变很低，细胞形态不变很低，细胞形态不变试剂稳定性一般较差一般很好批量样品检测可以非常适合非常适合非常适合便捷程度一般便捷便捷非常便捷二、CCK8检测细胞增殖/毒性的方法实验一：细胞增殖分析1、制备细胞悬液：细胞计数2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数，每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做3个重复。
CCK-8法
CCK-8法一．实验原理CCK8全称cell counting kit-8试剂，可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。
该试剂中含有WST-8[化学名：2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-(4-硝基苯基)-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑单钠盐]，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原成具有高度水溶性的黄色甲瓒产物。
生成的甲瓒物的数量，颜色的深浅和活细胞的数量成正比，与细胞毒性成反比。
使用酶标仪在450nm波长处测定OD值，间接反映活细胞的数量。
二．实验步骤1）制作标准曲线1.在96孔板中接种细胞悬液(100ul /孔)。
按500,1000，2000,4000,6000,8000的比例做一个细胞浓度梯度，每组3-6个复孔。
将培养板放在培养箱预培养 (在37℃，5% CO2的条件下)，直到细胞贴壁完全(一般24小时)。
2.向每孔加入10ul的CCK- 8溶液 (注意不要在孔中生成气泡，它们会影响O.D值的读数)。
3.之后将培养板每个细胞浓度分别测定不同孵育时间的吸光度。
一般为0h,0.5h,1h,2h,3h,4h在培养箱内孵育1-4小时。
4.用酶标仪测定在450 nm处的吸光度，绘制标准曲线。
2）细胞活性检测（或者用于预测cck-8最佳孵育时间）1.在96孔板中接种细胞悬液(100ul /孔)。
将培养板放在培养箱预培养(在37℃，5% CO2的条件下)，直到细胞贴壁完全(一般24小时)。
2.向每孔加入10ul的CCK- 8溶液 (注意不要在孔中生成气泡，它们会影响O.D值的读数)。
3.培养板孵育，孵育时间根据标准曲线而定。
4.用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。
（一般选择孵育时间与OD值线性关系比较明显的为最佳孵育时间）增殖抑制率(%)=1−实验组A值−空白组A值对照组A值−空白组A值×100%3）细胞增殖-毒性检测1.在96孔板中接种细胞悬液(100ul /孔)。
CCK8实验原理与步骤
CCK8实验原理与步骤CCK-8是一种常见的细胞活力检测方法，常用于评估细胞增殖和细胞毒性等生物学活性。
实验原理：CCK-8试剂是一种黄色噻唑-二苯基甲烷盐的溶液，它能够在有活细胞存在时被细胞内的酶还原成橙色水溶性的产物。
这种产物可以通过光度计测量，从而得到细胞的活力信息。
细胞活力高时，细胞内有较多的酶可以将CCK-8还原成产物，产生较高的吸光度；细胞活力低时，细胞内酶的活性降低，无法完全还原CCK-8，产生较低的吸光度。
实验步骤：1.细胞培养：将待测细胞株接种到含有适宜培养基的培养皿或孔板中，并在恒温、湿润、含有5%CO2的培养箱中孵育。
2.实验前处理：根据实验设计的需要，可进行细胞预处理，如给药、感染等。
预处理时间根据需要确定。
K-8试剂准备：将CCK-8试剂按照用户手册的要求溶解成适合实验设计的浓度。
注：部分实验可能需要调整试剂的浓度，应根据实验要求进行调整。
K-8试剂加样：对不同组的培养皿或孔板分别加入适量的CCK-8试剂，使其与培养基均匀混合。
一般情况下，加入的CCK-8试剂量为培养基总量的10%。
5.孵育CCK-8与细胞的反应：将含有CCK-8试剂的培养皿或孔板放回恒温、湿润、含有5%CO2的培养箱中继续孵育。
孵育时间根据实验需要确定，一般为1-4小时。
6. 吸光度测定：使用酶标仪或光度计测定吸光度（OD）值，一般在450nm波长下测定。
同时，记录对照组（如细胞温育组）的OD值作为参照。
7.数据处理与分析：根据实验设计，采用合适的统计学方法，比较各组的细胞活力差异，并将数据结果进行图表展示。
注意事项：K-8试剂对皮肤、眼睛、呼吸道等有刺激性，请注意安全操作；2.实验前需进行细胞的适宜密度的培养，以保证其在实验过程中的稳定生长状态；3.在实验中注意培养条件的一致性，如温度、湿度、CO2浓度等；4.参照组的选择要慎重，需要与实验对象具有相同的培养条件；5.准备稀释CCK-8试剂时，避免过长时间暴露于光线和空气中，以免降低其效力。
cck8实验步骤及注意事项
Cell Counting Kit简称CCK8试剂盒，是一种基于WST-8（化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-
四唑单钠盐）的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。
WST-8属于MTT的升级产品，工作原理为：在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物（formazan）。
颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。
使用酶标仪在490mM波长处测定OD值，间接反映活细胞数量。
cck8实验步骤(以下为药物处理实例)
1、在96孔板中配置100μL的密度为2×104个/ml的细胞悬液。
将培养板在培养箱预培养24小时（37℃，5% CO2）。
2、按一下浓度梯度和时间点，加药物处理;
3、将培养板在培养箱孵育一段时间（0-7天共8个时间点）。
4、向每孔加入10μL
CCK8溶液（注意不要再孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数。
5、将培养板在培养箱内孵育1小时。
6、用酶标仪测定在450nm处的吸光度。
通常研究药物毒性时会涉及半抑制率，即IC50，,意思是抑制率50％的时候药物的浓度。
把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50％抑制率时候的药品浓度，就是IC50。
CCK8实验原理与步骤
CCK8实验原理与步骤CCK-8实验（Cell Counting Kit-8）是一种常用的细胞增殖和细胞毒性测定实验方法。
CCK-8试剂可以通过还原机制，测量细胞内的活性代谢物质水平，从而评估细胞数量和活力。
以下是CCK-8实验的基本原理和步骤。
实验原理：CCK-8试剂中含有一种缩合的四氢噻唑并噻吩偶吡啉（WST-8）和电子传递剂1-甲基噻唑盐（MTS）。
细胞内的代谢酶可以将WST-8还原成橙红色的形成物形成溶液。
这个形成物可以通过光度计检测，并与细胞数量和代谢活性成正比。
所以，通过测量形成物的光吸收度，可以获得细胞的增殖和毒性信息。
实验步骤：1.细胞培养准备：将待测细胞分散在完全培养基中，并按照常规方法培养至适当的细胞密度。
2.细胞悬液准备：将培养的细胞用PBS缓冲液洗涤一次，然后用PBS 缓冲液重新悬浮至适当的浓度。
3.细胞计数：使用仪器（如细胞计数器）计数细胞的数目。
如果没有细胞计数器，则可以使用显微镜和计数板手工计数。
4.细胞接种：将细胞分散在细胞培养板或96孔板中，使得每个孔的细胞数目相等。
通常可以根据实验需求设定各组的重复孔数。
5.处理组别：根据实验设计，在每个组中添加不同浓度的药物处理。
同时设置一个对照组（只添加培养基），以便比较。
6.增殖处理：将细胞培养在适当的条件下（如37°C，5%CO2）孵育一定时间。
孵育时间取决于具体实验需求和细胞类型。
K-8试剂处理：在孵育结束后，添加CCK-8试剂到每个孔中，使其最终浓度达到指定浓度。
通常浓度为1/10到1/100倍的CCK-8试剂：细胞悬液体积。
在这个步骤中，也可以添加几种不同的浓度以确定最佳浓度应用于未来的实验。
8.孵育：将试验板放回培养箱中，继续孵育一段时间。
孵育时间可以根据实验设计确定，通常为2-4小时。
9. 吸光度测量：在孵育结束后，使用酶标读板机或其他光度计测量每个孔中形成物的吸光度。
根据实验目的，可以选择470nm或450nm波长。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
CCK8佥测细胞增殖/毒性的原理、方法及注意事项
、CCK8检测细胞增殖/毒性的原理
Cell Counting Kit-8 （简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。
其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-（2-甲氧基 4 硝基苯基）-3-（4- 硝基苯基）-5-（2,4- 二磺酸苯）-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS 的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物
Formazan dye）。
生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。
因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
用途：药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验
CCK8的优点：
・使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；
* CCK-8法能快速检测；
* CCK-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度；
* CCK-8法的重复性优于MTT法；
・CCK-8法对细胞毒性小；
・CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。
CCK8的缺点：
•与MTT法相比，CCK8和XTT的价格比较贵。
* CCK8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多加。
与以往的增殖/毒性测定试剂相比较:
现配现用即开即用即开即用使用方法配成溶液后
使用
二、CCK8检测细胞增殖/毒性的方法
实验一：细胞增殖分析
1、 制备细胞悬液：细胞计数
2、 接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数，每孔约100ul 细胞悬液， 同样的样本可做3个重复。
3、 37C 培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时，如果 不需要贴壁，这步可以省去。
4、 加入10ul CCK8 :由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在 孔壁上而带来误差，建议 在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。
或 者直接配置含10%CCK8的培养基，以换液的形式加入。
5、 培养1-4小时：细胞种类不 同，形成 的Formazan 的量也 不一样。
如 果显色不够的话，可以继续培养，以确 认最佳条件。
特别是血液细胞形 成的Formazan 很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。
6、测定450nm 吸光度：建议采用双波长 进行测定，检测波长450-490nm ， 参比波长600-650nm 。
实验二：细胞毒性分析 1、 制备细胞悬液：细胞计数
2、 接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数，每孔约100ul 细胞悬液， 同样的样本可做3个重复。
3、 37C 培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养2-4小时，如果 不需要贴壁，这步可以省去。
4、 加入不同浓度的毒性物质
5、 37C 培养箱中培养：加入毒性物质的培养时间，要看毒性物质的性 质和细胞的敏感性，一般 要根据细胞周期来决定，起码要一代以上的时 间。
6、 加入10ul CCK8 :由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在 孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀
7、 培养1-4小时：细胞种类不 同，形成 的Formazan 的量也 不一样。
如 果显色
检测灵敏度 很高 很高 检测时间 较长 较短 较短 最短 检测波长 560-600nm
420-480nm
420-480nm
430-490nm
细胞毒性
高，细胞形 很低，细胞 很低，细胞 很低，细胞 态完全消失 形态不变 形态不变
便捷程度
便捷
很好
非常适合 非常便捷
形态不变 试剂稳定性 批量样品检测 非常适合
不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。
特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。
8、测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm ，参比波长600-650nm。
*若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10此0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。
24 小时内测定，吸光度不会发生变化。
•如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK8之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。
当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
三、CCK8检测细胞增殖/毒性的注意事项
・当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/ 孔（100 讪培养基）。
检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500
个/孔（100讪培养基）。
・酚红和血清对CCK8法的检测不会造成干扰，可以通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去。
* CCK8可以检测大肠杆菌，但不能检测酵母细胞。
在细胞增殖实验每次测定的过程中需要避免细菌污染，以免影响结果。
•CCK-8在0-5 C下能够保存至少6个月，在-20 C下避光可以保存 1年。
・当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。
一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为测定孔用。
*在培养基中加入CCK8,培养一定的时间，测定450 nm的吸光度即为空白对照。
在做加药实验时，还应考虑药物的吸收，可在加入药物的培养基中加入CCK8
培养一定的时间，测定450 nm的吸光度作为空白对照。
*金属对CCK-8显色有影响：当终浓度为1 mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5% 15%、90%的显色反应，使灵敏度降级。
如果终浓度是10 mM的话，将
会100%抑制
・悬浮细胞由于染色比较困难，一般需要增加细胞数量和延长培养时间。
欢迎您的下载，
资料仅供参考!
致力为企业和个人提供合同协议，策划案计划书，学习资料等等
打造全网一站式需求。