生物化学09

k1
Kcat/Km的上限是K1，即生成ES复合物的速度(酶促反应的速 度不会超过ES的形成速度K1，在水相中不会超过108～109）
只有Kcat/Km可以客观地比较不同的酶或同一种酶催化 不同底物的催化效率
3.利用作图法测定Km和Vmax值
基本原则：将米氏方程变化成相当于 y=ax+b 的直线方 程，再用作图法求出Km。 （1） Lineweaver-Burk 双倒数作图法
★乒乓机制的动力学曲线是两组平行直线
★表观米氏常数 KmA′（KmB′）随 [B]（ [A]）浓度的增 大而增大
★表观最大反应速度Vmax′随[B]（[A]）的增大而增大
（2）序列机制的底物动力学方程
Vmax[ A][B] V A B A B K m [ B] K m [ A] [ A][B] K s K m
2、可逆的抑制作用
抑制剂与酶蛋白非共价键结合，可以用透折、超滤等物 理方法除去抑制剂而使 酶复活。
★交点在X轴上：表观KmA′（KmB′）随[[B]（[A]）浓度的增 加而减小
★交点在X轴下：表观KmA′（KmB′）随[[B]（[A]）浓度的增 加而增大 ★表观最大反应速度Vmax′随[B]（[A]）的增大而增大
三、酶的抑制作用
变性作用(denaturation)： 抑制作用(inhibiton)：使酶活力下降或丧失但并不引起 酶蛋白变性 变性剂没有选择性 抑制剂有不同程度的选择性 研究抑制剂对酶的作用有重大的意义： （1）药物作用机理和抑制剂型药物的设计与开发 （2）了解生物体的代谢途径，进行人为调控或代谢控制 发酵 （3）通过抑制剂试验研究酶活性中心的构象及其化学功 能基团，不仅可以设计药物，而且也是酶工程和化学修 饰酶、酶工业的基础
f.Km和米氏方程的实际应用 若已知某个酶的Km值，可以计算在某一个底物浓度 时，反应速度相当于最大反应速度的百分率。
g.Km可以帮助推断某一反应的方向和途径
（2）Vmax和k3(kcat)的意义 在一定的酶浓度下，Vmax是一个常数，它只与底物的种 类及反应条件有关。 当[S]很大时，Vmax=K3 [E] K3代表酶被底物饱和时每秒钟每个酶分子转换底物的分 子数，称为转换数（或催化常数，Kcat）， 表明酶的最 大催化效率。 转换数的倒数即为催化周期：一个酶分子每催化一个底 物分子所需的时间。 乳糖脱氢酶转换数为1000/秒，则它的催化周期为10-3秒
（1）乒乓机制的动力学方程
V
Vmax [ A] [ B] A B K m [ B] K m [ A] [ A] [ B]
A
1 Km 1 V V [ A] max

Km
B
Vmax
1 1 [ B] Vmax
KmA： [B]达到饱和浓度时A的米氏常数 KmA′： A的表观米氏常数 Vmax：[A][B]都达到饱和浓度时的最大反应速度
80
Rate of Reaction(v)
60
40
20
0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 Concentration of Substrate(umol/L)
酶与底物的中间络合物学说（Henri和Wurtz）
S+E
ES
P+E
中间产物假说证据： （1）ES复合物已被电子显微镜和X射线晶体结构分析直 接观察到。 （2）酶和底物的光谱特性在形成ES后发生变化。 （3）酶的物理性质经常在形成ES后发生变化。 （4）已分离得到ES复合物。 （5）平衡透析时，底物浓度在半透膜内外不等。
（二）酶促反应的动力学方程式
E S P E ES
k3
k1 1.米氏方程式的推导
k2
米氏方程:
Vmax S v K m S
米氏常数:
k 2 k3 Km k1
推导原则：从酶被底物饱和的现象出发，按照
“稳态平衡”假说的设想进行推导。
SE
S
半衰期与初始浓度成正比。
二、底物浓度对酶反应速率的影响
（一）中间络合物学说
100
在低底物浓度时 , 反应速度与 底物浓度成正比，表现为一级 反应特征。 当底物浓度达到一定值，反应 速度达到最大值（ Vmax ），此 时再增加底物浓度，反应速度 不再增加，表现为零级反应。
1903年，Henri用蔗糖 酶水解蔗糖的实验
（3） Kcat/Km 的意义
在生理条件下， [S]/Km=0.01～1.0
V max [ S ] Kcat [ E ] [ S ] v Km [ S ] Km [ S ]
Kcat [ E ] [S ] [S]<<Km 时： v Km
K cat k3 k1 Km k 2 k3
c.Km 值表示酶与底物之间的亲和程度： Km 值大表示亲和 程度小，酶的催化活性低 ; Km 值小表示亲和程度大 , 酶的催化活性高。 （同一种酶有几种底物就有几个 Km 值，其中 Km 值最小的 底物一般称为该酶的最适底物或天然底物） 一般情况下， 1/Km 可以近似地表示酶对底物的亲和 力大小， 1/Km愈大，表明亲和力愈大。
所以1/Km表示形成ES的趋势大小 特例： Km=K2/K1=Ks(在K3K1，K2时)
d.Km与Ks Km不等于Ks。在K3<<K1、K2时， Km看作Ks，也只 有此时1/Km 才可以近似表示酶与底物结合的难易程度。 e.Km与Km 无抑制剂时，ES的分解速度与形成速度的比值 符合米氏方程，为Km; 而有抑制剂时发生变化，则不符合 米氏方程，为Km 。
k1 Et ESS k2 ES k3 ES
k 2 k3 Km k1

则： Km ES ESS Et S
Et S ESS k2 k3 ES k1
经整理得：
ES

Et S K m S
将（4）代入（3），则：
v
Vmax S K m S
当[S] <<Km时
V
V max [ S ] V max [ S ] K’ [S ] Km [ S ] Km
酶反应速度与底物 浓度的关系曲线
当[S]＞＞Km时 当[S]=Km时
V
V max [ S ] V max [ S ] V max Km [ S ] [S ]
V max [ S ] V max V Km [ S ] 2
2.动力学参数的意义
（1）米氏常数的意义 a.不同的酶具有不同 Km值，它是酶的一个重要的特征物 理常数,只与酶的性质有关，而与其浓度无关。 b.Km值只是在固定的底物，一定的温度和 pH条件下，一 定的缓冲体系中测定的，不同条件下具有不同的Km值。
Km [S] [S] ——＝——＋—— v Vmax Vmax [S] 以 ～[S]作图 v [S] v 1 Vmax
-Km
[S]
（4）Eisenthal 作图法
（5）Hill 作图法
Log V Vmax V n Log[ S ] LogKm
（寡聚酶）
Log Y V （Log ） 1 Y Vmax V
2. 反应级数：根据实验结果，整个化学反应的速率服 从哪种分子反应速率方程式，则这个反应即为几级反应。 一级反应，二级反应，……，零级反应。
（三）各级反应的特征
1. 一级反应 凡是反应速率只与反应物的浓度的一次方成正比的，这 种反应就称为一级反应。 速率常数与半衰期成反比，半衰期与反应物的初浓度无 关。 2. 二级反应 凡是反应速率与反应物浓度二次方（或两种物质浓度的 乘积）成正比的，这种反应就称为二级反应。 半衰期与初浓度成反比。 3. 零级反应 凡是反应速率与反应物浓度无关而受它种因素影响而改 变的反应。
反应速率是以单位时间内反应物或生成物浓度的改变来 表示。用瞬时速率表示反应速率： v =dc/dt 反应速率的测定实际上就是测定不同时间的反应物或生 成物的浓度。
（二）反应分子数和反应级数
1. 反应分子数：在反应中真正相互作用的分子的数目。 单分子反应，双分子反应，…… 判断一个反应是单分子反应还是双分子反应，应先了解 反应机制，即反应过程中各个单元反应是如何进行的。
第九章 酶促反应动力学
一、化学动力学基础 二、底物浓度对酶反应速率的影响 三、酶的抑制作用 四、温度对酶反应速度的影响 五、pH对酶反应的影响 六、激活剂对酶反应的影响
一、化学动力学基础
化学反应的两个基本问题：（ 1）反应进行的方向、可 能性和限度；（2）反应进行的速率和反应机制。
（一）反应速率及其测定
★在缺少A时，B不能与E结合
A
B
A
P B AE AEB
Q
E → AE → AEB → QEP → QE → E
E QE
Q P
QEP
A与其产物Q相互竞争地结合E，但A和B互不竟争
反应的总方向决定于A、Q的浓度和反应的平衡常数
NAD＋ 与NADH相互竞争E上的NAD＋结合部位
②随机反应
底物A、B与酶结合的顺序是随机的，形成的三元复合 物AEB → QEP，产物P、Q的释放顺序也是随机的。 限速步骤是AEB → QEP A 与 Q 相互竞争 E 上的底物结合部位 A ， B 与 P 相互竞争 E 上 的底物结合部位B 反应的总方向决定于A、B、Q、P的浓度和反应的平衡常数
（2）乒乓反应
底物 A 先与 E 结合成 AE 二元复合物， AE → PF （修饰酶形 式），释放第一个产物P，接着底物B与F形成FB，FB →EQ， 释放第二个产物Q。 A与Q 竞争自由酶形式E ，B与P竞争修饰酶形式F。 整个反应历程中只有二元复合物形式，没有三元复合物形 式。
2.双底物反应的动力学方程
（一）抑制程度的两种表示方法