同源重组的分子机制2
06.第六章-遗传重组的分子机理
• Mu的DNA是线型的，两端没有粘性末端，而是类 似于IS的序列，并有与转座有关的基因A和基因B ， 其整合方式与λ噬菌体不同，不是位点专一性的整 合和切除，而是类似于转座因子，其末端常常带 有一小段宿主DNA，因而可以引起转导。
model): DNA双链的断裂与重接
3)Holliday模型：异源双链
(heteroduplex)的断裂与重接
4)Meselon-Radding 模型：
1.Holliday 模型
a) 同源染色体联会
b) 内切酶切割非姊妹染 色单体DNA
c) 交换重接形成交联桥 结构(cross-bridge
structure)
A: phe- try- tyr- × B: met- his-
苯丙AA 色AA 酪AA
甲硫AA 组AA
↓
原养型菌落
phe+ try+ tyr+ met+ his+
问题：是接合引起的？是转化引起的？
U型管实验
• 但在这里，结果却获 得了原养型菌株，说 明有一种可通过滤膜 的过滤性因子(FA)， 细菌不必直接接触即 可进行基因转移
遗传学讲义 第六章 遗传重组的分子基础
中国海洋大学 生命学院 汪小龙 xiaolong@
1、遗传重组的类型
(1) 同源重组(homologous recombination)
又叫普遍性重组(generalized recombination) ，大范围同源序 列对等交换。真核生物减数分裂中同源染色体联会，非姊妹 染色单体之间的交换就是同源重组。需要重组蛋白因子参与， 如E.coli. 的RecA.参与重组，又叫依赖于RecA的重组（RecAdependent recombination)；
同源重组的分子机制
方记向的相同重的组一条，单它链们； 都含有•3 一个异源双链区。
3. 切开的单链交换重接;
4. 形成交联桥结构； 5. 分支迁移：形成一大段异源 •4
双链DNA(Holliday结构)
•5
6. 绕交联桥旋转1800，形成
Holliday异构体；
• •7
7. 切开与重接：
左右切，形成非重组体
上下切，形成重组体。
•(2). 一个杂种分子得到校正，另一条未校正，有丝分裂后 分离形成 5:3 或 3:5 的分离比，属于半染色单体转变；
•(3). 两个杂种分子都被校正到同一种类型，有丝分裂后分 离形成 6:2或2:6 的分离比，属于染色单体转变；
•(4). 两个杂种分子都被校正到不同类型，有丝分裂后分离 形成 4:4 分离比，未出现基因转变；
哈工大-遗传学
同源重组的分子机制
(二)、基因转变及其分子机理
1、异常分离与基因转变 粗糙脉孢菌： pdxp：酸度敏感的VB6依赖型 pdx： 酸度不敏感的VB6依赖型
哈工大-遗传学
同源重组的分子机制
+ pdxp
× pdx +
•585个子囊中
孢子对
①
子囊
②
③
④
1 2
•? + pdxp pdx +
+ + pdx +
•-
•-
•-
因的遗传+ 学现象（源于-基因内重组）。+
•+
•+
•+
+
+
+
•+ -
••+-+-
••+-+-
同源重组的分子机制
同源重组的分子机制一、断裂重接模型（breakage joining model）C．D．Darlington 1936年提出。
在同源染色体联会时，由于染色体的缠绕而产生张力，两个相对染色单体在同一位置断裂，然后彼此和另一染色单体重新连接起来从而形成重组并消除这种张力。
二、基因转换现象Olive等广泛研究粪生粪壳菌g座位，g-决定子囊孢子灰色，g+决定子囊孢子的黑色，在g+×g-的杂交中，他们分析了20万子囊，发现0.06%是5∶3分离，0.05%是6∶2分离，0.008％是3∶1∶1∶3（或异常4∶4）分离。
图示． (1)一个孢子中的两个孢子有着不同的基因型。
(2)分离比例不是4∶4。
(3)邻近的基因A/a都呈现正常分离。
断裂重接模型则无法解释异常现象。
1930年，德国遗传学家H．温克勒把这种不规则分离现象解释为减数分裂过程中同源染色体联会时一个基因使相对位置上基因发生相应的变化所致，因而称就基因转变。
好象是由于一个基因转换为另一等位基因，所以称为基因转换（gene conversion）。
以后由于发现一个基因发生基因转变时，它两旁的基因常同时发生重组：在5∶3和6∶2分离的子囊中，大约有30%也在g座位的这边或那边发生重组；有基因转换的子囊中，基因转换和遗传重组都发生在同样两个单体的子囊比例竟高达90%。
所以认为基因转变是某种形式的染色体交换的结果。
因此，基因转变的研究，实质上也是染色体交换机制的研究。
三、同源重组的Holliday模型1964年，R. Holliday提出了重组的杂合DNA模型(hybrid DNA mode)，并作修正。
图示．过程：A．同源的非姊妹染色体的DNA配对。
B-C．同源非姊妹染色单体DNA中两个方向相同的单链在DNA内切酶的作用下，在相同位置上同时切开。
D．切开单链交换重接，形成交联桥结构（cross-bridged structure）。
E．交联桥的位置可以靠拉链式活动，沿着配对DNA分子“传播”—桥迁（Bridge migration），其中互补碱基间形成的氢键从一条链改变另一条链。
同源重组法分子克隆 -回复
同源重组法分子克隆 -回复同源重组法是分子克隆技术中的一种重要方法，其基本原理是利用DNA的同源性重组来插入外源DNA序列到宿主DNA中。
同源重组法在基因克隆、遗传工程等领域得到了广泛应用。
本文将详细介绍同源重组法的原理、步骤及应用。
一、同源重组法的原理同源重组法的原理基于DNA分子的自身结构和功能，DNA分子在某些条件下能够进行重组、修复和重复。
同源重组是指两个DNA分子之间具有相似序列（同源）的区域进行交换而形成的DNA分子重组。
同源重组法基于此原理，通过在宿主DNA中引入重组的同源片段，将外源DNA序列插入到宿主DNA中。
同源重组法的原理可以分为两个步骤：相互间接断裂和互补配对。
两个DNA分子的同源片段同时发生间接断裂，获得可供基因重组的末端。
接下来，由于互补配对的作用，从两个DNA分子中间的同源片段在一定条件下进行配对，形成插入、缺失、互换等不同类型的重组产物。
1. 构建载体DNA：载体DNA是将外源DNA插入到宿主DNA中的重要工具，构建载体DNA 需要选择有适当限制酶切位点的载体和外源DNA。
一般来说，常用的载体包括质粒、噬菌体、噬菌体样颗粒等。
2. 制备DNA片段：外源DNA片段可以通过PCR扩增、酶切和DNA合成等技术制备。
需要注意的是，PCR扩增要确保扩增的DNA片段与宿主DNA具有一定的同源性。
3. 利用限制酶切割载体和外源DNA：根据预定的酶切位点设计限制酶切位点并进行酶切。
4. 进行杂交和拼接：将外源DNA片段与载体DNA杂交，并通过互补配对将DNA片段与载体DNA进行拼接。
5. 转化大肠杆菌：利用化学方法或电击法将构建好的载体DNA转化到大肠杆菌中，转化后得到含外源DNA的菌落。
6. 筛选阳性菌落：利用选择性培养基和荧光素酯分析方法等技术筛选阳性菌落。
7. 测序鉴定：对筛选出的阳性菌落进行测序，并鉴定插入的外源DNA序列是否正确。
同源重组法是分子克隆领域中一种非常实用的技术。
同源重组技术的原理和应用
同源重组技术的原理和应用同源重组技术（Homologous recombination technology，HRT）是一种常用的基因编辑技术，它能够在特定部位改变DNA序列，用于治疗某些遗传性疾病、研究基因表达调控和蛋白质结构等方面。
本文将介绍同源重组技术的原理和应用。
1. 同源重组技术的原理同源重组技术是利用质粒、病毒等载体携带的外源基因通过靶向指向的方式将其导入到细胞或生物体中，从而达到改变生物体基因组的目的。
具体来说，同源重组技术是基于DNA的相互作用原理进行的。
DNA由四种碱基（腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶）构成，它们之间形成了氢键，使得两条互补的DNA链可以通过这些氢键相互结合。
在同源重组中，DNA分子的另一端则通过DNA酶和锌指核酸酶来实现切割和精准定位。
一旦发现了具备相同序列的区域，这些酶就会将外源基因定向到位点，与染色体上的同源序列组成DNA双链，从而取代了原有的序列，以达到修复或替换某些基因的效果。
2. 同源重组技术的应用同源重组技术的应用广泛，其中最重要的是对基因的编辑和修复。
以下将介绍几种常见的同源重组技术应用：(1)质粒介导同源重组质粒介导同源重组是一种常用的基因工程技术。
这种技术主要是利用菌单倍体的同源重组能力，通过转化质粒来实现有选择性地在DNA的特定区域插入新基因。
这种技术特别适用于菌类以及一些单细胞真菌和原生生物。
(2)病毒介导同源重组病毒介导同源重组则运用了病毒自身的重组机制特征，对其进行了改造，使其能够以带选择性的方式在目标细胞中整合外源基因。
这种方法目前已经广泛应用于人类基因治疗领域，尤其在修复致病基因和引入新基因方面取得了显著进展。
(3)基因组编辑基因组编辑技术可以通过同源重组来治疗遗传性疾病。
比如，在用于治疗Friedreich's ataxia（FA）的基因治疗研究中，研究团队采用基因克隆技术构建了能够靶向FA基因的重组质粒，并通过同源重组的方式将其导入细胞中。
DNA同源重组修复的分子机制
・综述・作者单位:300192 天津,中国医学科学院放射医学研究所DNA 同源重组修复的分子机制王勇 樊飞跃 电离辐射直接造成生物靶分子细胞DNA 的损伤,DNA 的损伤类型很多,其中以DNA 双链断裂(double strand break ,DS B )最为严重。
DNA DS B 的修复较其他类型的DNA 损伤更加困难,不修复则可能导致染色体断裂和细胞死亡,而修复不当则可能导致染色体缺失、重排、转位和倒置等,从而易于形成肿瘤等疾病[1]。
DNA 损伤的不完全修复可导致基因组不稳定,机体细胞为了对抗损伤,发展出多个修复系统来保证基因组的完整性,同源重组修复(hom olog ous recombinationrepair ,HRR )是DNA DS B 损伤修复的主要方式,对于保持哺乳动物细胞的基因组完整性十分重要[2]。
重组即遗传物质的重排,同源重组是指发生在同源DNA 序列间的重组,主要是利用DNA 序列间的同源性来识别,而负责配对和重组的蛋白质因子并无碱基序列特异性。
本文综述了国外近来对HRR 分子机制的研究进展,包括引发HRR 的DNA 损伤机制;HRR 的基本修复过程和多条修复通路;HRR 关键分子重要功能的实现机制;HRR 与细胞周期调控等其他事件的相互关系;辐射和HRR 及其与肿瘤之间的关系。
11DNA 损伤的感受识别:HRR 参与的蛋白质有RAD51,RAD51b ,c ,d ,RAD52,RAD54,BRC A1,BRC A2,XRCC2,XRCC3和MRN 复合物等,另外还需大量起始和损伤应激感受分子,包括AT M ,ATR 和DNA 2PK cs [3]。
细胞在受到电离辐射照射后,一系列重组或修复蛋白及复合物重新定位形成核焦点,以应答DNA 损伤。
这些蛋白有γ2H2AX ,AT M ,RAD51,BRC A1,BRC A2,NBS1,RPA 和MRN ,它们相互作用,完成DNA 损伤信号的接受功能并转导信号给其他蛋白质,介导并协调包括周期检控点、凋亡、修复的损伤应答。
RedET同源重组技术概述
亚克隆 pGB-15A载体抗性基因簇
Red/ET subcloning
直接克隆 Myxococcus xanthus中的沉默基因簇
3 mg基因组DNA用EcoR V消化
EcoRV (36739)
EcoRV (664)
p15A ori
Cm
Mx unknown PKS gene cluster (~36kb)
2. 不受靶标DNA分子大小的限制；
3. 不受内切酶切位点的限制；
4. 精确性：不依赖RecA蛋白，减少了引入非预期的突变、
缺失、替换等的几率；
5. 简便快捷：省去了中间质粒的构建，减少实验步骤、缩
短实验周期。
三、 Red/ET重组的作用机制
1.链入侵模式
Red/ET重组链入侵模型
2.链退火模型
插入选择标记
插入无选择标记的DNA片段
E. coli染色体上插入抗性基因
传统基因工程技术（A）和Red/ET重组技术（B）修饰E.coli染色体实验步骤比较
3. 亚克隆 （Subcloning）
4. 直接克隆 （Direct cloning）
（A）亚克隆和直接克隆示意图
（B） 不同复制子能承载外源 DNA片段的大小
2. RecE和RecT
RecE：C端39kDa的部分才是5’-3’外切酶活性必需，对5’端为羟 基的底物也有活性。 RecT：与ssDNA结合形成丝状体，催化与互补ssDNA之间的退火。
3. RecA ４个亚基形成有活性的RecA蛋白，细菌中广泛存在且高度保
守，有同源重组酶、DNA损伤修复、DNA依赖ATPase活性等功能。 可诱导SOS反应、挽救DNA复制叉等，提高电击后细胞的活
6. 重组子筛选
同源染色体联会的分子机制
同源染色体联会的分子机制
同源染色体联会（homologous chromosome pairing）是指在有性生殖中，同源染色体在减数分裂前期通过染色体联会在细胞核中形成特定的结构，从而实现染色体的准确配对和交换的现象。
同源染色体联会对于有性生殖的正常进行至关重要，它在基因重组和遗传多样性的形成中起到重要作用。
同源染色体联会的分子机制涉及多个分子和细胞过程的参与。
以下是同源染色体联会的主要分子机制：
1. 首先，细胞核内的同源染色体会在减数分裂前期的染色质纤维上形成同源染色体联会中心（homologous chromosome pairing center，PC）。
2. PC由多种蛋白质组成，其中一个重要的蛋白质是Meristem Disc 1（MER1），它被认为是同源染色体联会的关键因子。
3. MER1蛋白质通过与同源染色体的特定区域结合，促进同源染色体的接近和配对。
4. 在同源染色体联会的过程中，其他蛋白质如ASY1、ASY3和ZYP1等也参与其中，它们形成复合物并与MER1一起调控同源染色体联会的进程。
5. 同源染色体联会的形成还涉及DNA修复机制的参与。
在染色体联
会过程中，同源染色体之间的DNA断裂和交换被触发，从而实现基因重组。
这一过程依赖于DNA双链断裂修复机制中的同源重组。
总的来说，同源染色体联会的分子机制是一个复杂的过程，涉及多种蛋白质的相互作用和调控，以及DNA修复机制的参与。
这些分子机制的研究对于了解有性生殖的遗传机制和遗传多样性的形成具有重要意义。
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两个方向相同的一条单链；
• 3. 切开的单链交换重接;
•
• 4. 形成交联桥结构；
•4
• 5. 分支迁移：形成一大段异 •5
•7
源双链DNA(Holliday结构)
• 6. 绕交联桥旋转1800，形成 Holliday异构体；
• 7. 切开与重接：
• 左右切，形成非重组体
• 上下切，形成重组体。
同源重组的分子机制2
支持Holliday遗传重组模型的证据： 1、形态学上，Holliday中间体(Chi 结构)的电镜照片；
同源重组的分子机制2
•Holliday模型同样适用于环状DNA间的重组 两个环状DNA分子配对、断裂、重接形成“8”字
型结构中间物，根据切割的位置不同，可分别形成两 个亲本环、大的单体环或者是滚环结构，也可以形成 “χ” 结构。
•A•G•b•A•A•b
•a
•T
•B
•a
•C
•B
•D/d
同源重组的分子机制2
•A •G
•B
•A •A
•B
•a •C
•b
•a •T
•b
•A
•G
•b
•A
•A
•b
•a
•T
•B
•a
•C
•B
同源重组的分子机制2
同源重组的分子机制2
• Holliday 模型中，由于重组而产生的异源双链区存在 不配对碱基，可被细胞内的修复系统能够识别并以一条链 为模板进行切除修复：
•5:3 (或 3:5)
100/200000
•3:1:1:3
同1源6重/组2的00分0子0机0制2
2、基因转变的分子机制
•①在5：3和6：2分离的子囊中，约有30%也在g基因两侧 • 发生重组； •②发生基因转变的子囊中，基因转变和遗传重组都发生 • 于同样的两个染色单体上的子囊的比例高达90%；
•基因转变的实质：重组过程中留下的局部异源双 链区，在细胞内的修复系统识别下不同的修复产 生的结果；
同源重组的分子机制2
同源重组的分子机制2
同源重组的分子机制2
•左右切
•异源双链 区
•D/d
•A
•G
•B
•A
•A
•B
•a
•C
•b
•a
•T
•b
•D/d
同源重组的分子机制2
•上下切
•异源双链 区
•D/d
•(1). 两个杂种分子均未得到校正，有丝分裂后分离形成4:4 或 3:1:1:3的异常孢子分离比，属于半染色单体转变；
•(2). 一个杂种分子得到校正，另一条未校正，有丝分裂后 分离形成 5:3 或 3:5 的分离比，属于半染色单体转变；
•(3). 两个杂种分子都被校正到同一种类型，有丝分裂后分 离形成 6:2或2:6 的分离比，属于染色单体转变；
同源重组的分子机制2
2020/11/7
同源重组的分子机制2
•上一课重点内容回顾
•着丝粒作图原理与方法
•顺序四分子遗传分析
•四分子分析
•两个基因作图原理与方法
•非顺序四分子遗传分析
•相关概念：四分子、顺序四分子、第一次分裂分离(MI模式)、 第二次分裂分离(MII模式)、子囊型(PD、NPD和T)
同源重组的分子机制2
同源重组的分子机制2
•2
同源重组的分子机制2
同源重组的分子机制2
支持Holliday遗传重组模型的证据： 1、形态学上，Holliday中间体(Chi 结构)的电镜照片； 2、异源双链形成时，产生碱基错配导致与重组相关联 的基因转变的发生；
同源重组的分子机制2
(二)、基因转变及其分子机理 1、异常分离与基因转变
同源重组的分子机制2
•二、Holliday模型 •依据：基因转变 •证据：细菌重组chi结构
同源重组的分子机制2
•(一)、过程
•1
• 1. 同源的非姐妹染色单体联
•6
•会; 无论 Holliday 结•2构断裂是否• 导致旁侧遗传标
• 2. DNA内切酶在非姐妹染
•旋转1800
•色单记体的的相重同组位，置同它时们切都开 含•3有一个异源双链区。
Meselson-Radding模型 1975年Meselson Radding提出；
•同源重组的分子机制
同源重组的分子机制2
•第四章 同源重组的分子机制
同源重组的分子机制2
断裂重接模型和模板选择复制模型存在的问题
断裂重接模型：不能解释基因转变和极化子现象； 模板选择复制模型：
(1) 违背了半保留复制； (2) DNA复制在S期，重组在偶线期，不应同时发生； (3)不能解释3线和4线交换；
同源重组的分子机制2
•解释同源重组分子机制的模型：
断裂和重接模型 1937年，Darlington提出；
模板选择复制模型（copy choice ） Belling J.首先提出，1933年又撤回； 1948年，Hershey再次提出；
霍利迪(Holliday)模型 1964年Robin Holliday提出；
第六章 同源重组的分子机制
同源重组的分子机制2
•一、概 念
•同源重组：依赖大范围的DNA同源序列的联会，重组过 程中，两个染色体或DNA分子交换对等的部分。
• 例：同源染色体非姐妹单体交换； • 细菌的转化、转导、接合； • 噬菌体的重组…
•条件：•2个DNA分子序列同源；
•不同物种同源重组所需的最小的同源序列不同；
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•+同源重组的分子机制2
•染色单体转变•粪生粪壳菌(Ol•i半ve染): 色g+单×体g转-变
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•+
•?
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•?
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•6:2 (或 2:6)
•120/200000
4 pdx + + pdxp pdx + pdx +
同源重组的分子机制2
•-
•+
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+
+
•+
•+
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+
••基因转+变(gene
conver••+s-+-ion)：一个基因••转+-+- 变为它的等位基
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因的遗传+ 学现象（源于-基因内重组）。+
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•+ -
••+-+-
••+-+-
粗糙脉孢菌： pdxp：酸度敏感的VB6依赖型 pdx： 酸度不敏感的VB6依赖型
同源重组的分子机制2
+ pdxp
× pdx +
•585个子囊中
孢子对
①
子囊
②
③
④
1 2
•? + pdxp pdx +
+ + pdx +
+ + pdx + + pdxp + pdxp
3 + pdxp + + pdx + + +