MicroRNA腺病毒表达系统使用手册0828
腺病毒中文操作手册
腺病毒中文操作手册腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1第二章应用重组腺病毒的优点 2第三章 AdEasyTM 技术 33.1 技术概况 33.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3第四章主要流程 44.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体44.1.1 克隆的一般原则 44.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体 54.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生 54.2.1 共转化的一般原则 54.2.2 共转化方法 54.2.3 预期结果 54.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 64.4.1 细胞铺板 64.4.2 磷酸钙转化技术 7第五章常用技术 85.1 QBI-293A细胞培养 85.1.1 QBI-293A细胞的初始培养85.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖 85.1.3 QBI-293A细胞的冻存8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生 95.2.1 感染QBI-293A细胞 95.2.2 病毒空斑形成 95.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 9 5.3 MOI测定 105.4 腺病毒感染力测定 105.4.1 X-Gal染色 115.5 重组腺病毒的筛选和纯化 115.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送 115.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增125.5.3 Western杂交 135.5.4 Southern杂交和点杂交 135.5.5 病毒裂解产物PCR 145.5.6 免疫测定 145.5.7 功能测定 145.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增 155.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 165.7.1 不连续密度梯度离心 175.7.2 连续密度梯度离心 175.7.3 病毒溶液去盐和浓集 17 5.8 病毒滴度测定 18 5.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 195.8.2 空斑测定法 205.8.3 50%组织培养感染剂量法 20 第六章疑难解答 226.1 QBI-293A细胞培养 226.2 感染力测定 226.3 转移载体克隆 236.4 在BJ5183细胞中共转化和重组246.5 转染QBI-293A细胞 256.6 筛选和测定 256.7 在QBI-293A细胞中表达 266.8 重组腺病毒的扩增 266.9 纯化 266.10 病毒滴度测定 27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNA cccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNACPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNA MWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Gal actopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
腺病毒中文操作手册
腺病毒中文操作手册腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 44.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体54.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生54.2.1 共转化的一般原则 54.2.2 共转化方法 54.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 64.4.1 细胞铺板 64.4.2 磷酸钙转化技术7 第五章常见技术85.1 QBI-293A细胞培养8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞95.2.2 病毒空斑形成9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞9 5.3 MOI测定10 5.4 腺病毒感染力测定105.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表示和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增125.5.3 Western杂交13 5.5.4 Southern杂交和点杂交13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 145.5.6 免疫测定145.5.7 功能测定14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心17 5.7.2 连续密度梯度离心17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集17 5.8 病毒滴度测定185.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 195.8.2 空斑测定法20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法20 第六章疑难解答226.1 QBI-293A细胞培养22 6.2 感染力测定22 6.3 转移载体克隆23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组246.5 转染QBI-293A细胞25 6.6 筛选和测定25 6.7 在QBI-293A细胞中表示26 6.8 重组腺病毒的扩增26 6.9 纯化26 6.10 病毒滴度测定 27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNA cccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNA CPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNA MWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
赛默飞世尔TaqMan MicroRNA Assays 简要操作说明说明书
快速参考手册TaqMan MicroRNA Assays简要操作说明（Rev.A.0）本操作说明提供了TaqMan MicroRNA Assays的简要操作指南。
更详细信息，请至赛默飞世尔官方网站下载英文版说明书：https:///content/sfs/manuals/cms_042167.pdf一．配制反转录体系1.准备总RNA（1）注意：应选择适当的提取方法，避免提取过程中丢失microRNA（2）RNA定量2.准备反转录预混液（1）将Taqman MicroRNA反转录试剂盒中的组分放在冰上融化后涡旋混匀。
（2）准备一支无RNA酶的离心管，参照下表，在冰上配制反转录预混液。
组成成分反应体系100mM dNTPs(with dTTP)0.15µl反转录酶 1.00µl10X反转录buffer 1.50µlRNase抑制剂0.19µl无核酸酶H2O 4.16µl总体积7.00µl（3）涡旋混匀，离心。
（4）将反转录预混液放置在冰上备用。
3.配制反转录体系（1）在冰上将5x反转录引物和RNA模板融化。
涡旋混匀。
（2）15µl的反转录体系中，加入1-10ng RNA（5µl），7µl反转录预混液，3µl反转录引物，涡旋混匀，离心。
（3）将反应管放在冰上放置5分钟，然后进行反转录实验。
4.设置反转录步骤将反应管放入PCR仪内，按照下列的反应程序进行设置：模式：标准模式，反应体积：15µl阶段时间温度退火30分钟16°C延伸30分钟42°C失活5分钟85°C∞4°C2二．定量PCR 扩增1.准备定量PCR 反应体系（1）将反应用到的组分放在冰上融化，混匀后放置冰上备用。
（2）按照20µl 反应体系计算所需要的试剂量。
将各组分加入离心管中，涡旋混匀，离心。
MicroRNA培训教材
一、microRNA简介1．什么是microRNAmicroRNAs（microRNAs）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约19~23个核苷酸。
成熟的microRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。
最近的研究表明microRNA参与各种各样的调节途径，包括生物个体发育、病毒防御、组织分化、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢、参与原癌基因作用等等。
2. MicroRNA的发现1993年，Lee，Feinbaum和Ambros等人发现在线虫体内存在一种RNA （lin-4），是一种不编码蛋白但可以生成一对小的RNA转录本，每一个转录本能在翻译水平通过抑制一种核蛋白lin-14的表达而调节了线虫的幼虫发育进程。
对于出现这种现象的原因，科学家们猜测是由于基因lin-14的mRNA的3'UTR 区独特的重复序列和lin-4之间有部分的序列互补造成的。
在第一幼虫阶段的末期降低lin-14的表达将启动发育进程进入第二幼虫阶段。
7年后科学家又发现了第二个microRNA－let-7，let-7相似于lin-4，同样可以调节线虫的发育进程。
自从let-7发现以来，应用随机克隆和测序、生物信息学预测的方式，又分别在众多生物体如病毒、家蚕和灵长类动物中发现了上千个的microRNAs。
被鉴定的microRNAs均被miRBase网站整理并加以注释。
此网站由著名的Sanger研究所主办，并对公众开放。
（/）3. microRNA的产生与作用机制microRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇等多种形式存在于基因组中，约60%microRNA单独表达，15%的microRNA一基因簇的形式表达，而25%的microRNA位于基因的内含子中，与基因同时被转录。
microRNA过表达载体具体步骤及说明
microRNA过表达载体具体步骤及说明microRNA 过表达载体具体使用说明及步骤MicroRNA（miRNA）是一类真核生物内源性的小分子单链RNA，通常长为18~25nt，能够通过与靶mRNA 特异性的碱基配对结合，引起靶序列降解或抑制其翻译，从而对基因进行转录后的表达调控（如右图所示）。
GenePharma MicroRNA 载体利用CMV 启动子可以在众多哺乳动物细胞中快速、高效、持续表达pre-miRNA，经过Drosha（RNase Ⅲ）作用形成small hairpin pre-miRNAs。
在使用载体法针对某一MicroRNA 进行过表达研究过程中，通常会遇到如下几个问题：实验对照组的确立、细胞转染条件的确定、基因表达效率的检测。
1、实验对照组的确立在一个完善的MicroRNA 表达实验设计中，必须考虑设立正确合理的实验对照组。
通常，这些对照组包括载体阴性对照组、转染试剂对照组。
载体阴性对照可以有两种，一种是采用通用的阴性对照组，在本试剂盒中包括了该对照所需的载体（microRNA），可以表达与目的基因序列无同源性的microRNA 片段；另一种是将目的microRNA 的序列打乱后重新组合所得的阴性对照（scrambled）。
对照组的设立对于MicroRNA 表达研究是很有必要的，您可以利用载体对照来确认microRNA 实验中转染、RNA提取和基因表达检测方法的可靠性。
2、细胞转染条件的确定使用MicroRNA 载体转染细胞时，为了选择合适的转染方法和确定转染效率，通常采用报告基因来检测DNA 的导入情况。
最常用的报告基因是绿色荧光蛋白。
3、MicroRNA 表达的检测通常用两大类方法来检测MicroRNA 表达效率，一类方法是直接检测MicroRNA 的变化水平，常用的方法如northern 杂交、芯片（microarrays）以及核糖核酸酶保护分析，但这些传统的方法都需要用到标记探针与纯化的RNA 进行杂交，由于成熟的miRNAs 及其前体共享一段共同的靶序列，而且目前的这些方法有无法通过大小将其分开，因此很难专一识别成熟的MicroRNA，导致较高的背景信号。
miRNA腺病毒操作手册-推荐下载
miRNA腺病毒操作手册miRNA简介MicroRNAs（miRNAs）是一类长度为18-24个核苷酸的非编码RNA分子。
MiRNA通过与靶基因mRNA上的互补序列结合，降解mRNA或抑制mRNA的翻译。
MiRNAs在细胞分化、增殖、凋亡和癌细胞发生中发挥重要的调控作用。
MiRNAs 来源于具有60-80 个核苷酸茎环结构的microRNA 前体（premir）和序列更长一些的microRNA初级转录产物（primir）。
MiRNA在核内由RNA聚合酶II（polII）转录生成，最初产物primir具有帽子结构和多聚腺苷酸尾巴。
ViGene生物的mirAD-腺病毒microRNA前体表达系统包括三个相关产品：microRNA前体穿梭载体、microRNA前体腺病毒载体和预制microRNA前体腺病毒。
microRNA前体腺病毒简介重组腺病毒是进行基因转移和表达的工具，功能强大且易于操作。
腺病毒独特的生物学特征使它成为“载体的首选”，被科研工作者广泛应用。
首先，它能够感染包括分裂、非分裂细胞和干细胞在内的多种细胞。
第二，病毒滴度高。
第三，高滴度的病毒可获得高感染效率和高表达量。
第四，病毒进入细胞后，病毒基因组不整合到细胞染色体上，因此瞬时表达外源基因的重组腺病毒不会诱导宿主细胞中染色体的变化。
ViGene生物选用的是应用最广泛的复制缺陷型的人类血清5型腺病毒，该腺病毒载体缺失E1和E3基因。
E1 基因在组装感染性病毒颗粒时必不可少，可在HEK293T细胞病毒包装过程中得到补充，而E3基因可有可无。
由于E1和E3基因的缺失，腺病毒载体可插入高达7.5kb的外源基因。
pMir-microRNA precursor 是基于microRNA 前体表达系统的质粒。
microRNA前体天然的茎环结构被克隆到质粒的SgfI和MluI双酶切位点。
为了保持推测的发卡结构和诱导正确的内源性反应，miRNA茎环结构的两侧具有它的150-200bp的天然序列。
腺相关病毒操作手册
腺相关病毒操作手册一、腺相关病毒（Adeno-Associated Viral Vector，AAV）简介腺相关病毒属微小病毒科(parvovirus)，为无包膜的单链线状DNA病毒。
AA V的基因组约4700bp，包括上下游两个开放读码框架(ORF)，位于分别由145个核苷酸组成的2个反向末端重复序列(ITR)之间。
基因组中有3个启动子(P5、P19和P40)和2个开放阅读读框(ORF)，rep和cap，如图1所示。
rep编码4个重叠的多功能蛋白，即Rep78、Rep68、Rep52和Rep40，其中Rep78与Rep68参与AA V的复制与整合，Rep52和Rep40具有解螺旋酶和ATP酶活性，与Rep78、Rep68共同参与单链基因组的复制；cap编码的VP1、VP2、VP3是装配成完整病毒所需要的衣壳蛋白，它们在AA V病毒整合、复制和装配中其重要作用。
图1.AA V基因结构二、腺相关病毒的优点1.安全性高：迄今从未发现野生型AA V对人体致病，重组AA V基因组序列上去除了大部分的野生型AA V基因组元件，进一步保证了安全性；2.免疫原性低：AA V2的基因组仅4681个核苷酸，便于用常规的重组DNA技术进行操作，而且进行动物实验时造成的免疫反应小；3.宿主范围广：能感染分裂细胞和非分裂细胞；4.表达稳定：能介导基因的长期稳定表达；5.物理性质稳定：在60℃不能被灭活，能抗氯仿；（汉恒--AAV包装）三、重组腺相关病毒载体系统简介AAV是一种复制缺陷型微小病毒，其增殖复制需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。
AAV无辅助病毒系统（AAV Helper-Free System）可以在无辅助病毒的条件下生产出重组腺相关病毒。
在AAV Helper-Free System中，生产具有感染性的AAV病毒颗粒所需的腺病毒基因产物（如：E2A，E4等基因）大部分由pHelper质粒提供，其余的腺病毒基因产物由稳定表达腺病毒E1基因的AAV-293宿主细胞提供。
MicroRNA
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产品手册│MirAd TM MicroRNA前体腺病毒表达系统本产品仅限用于研究，严禁用于任何动物或人类疾病诊断。
本产品仅供购买方内部研究使用，未经ViGene生物科技有限公司书面许可，严禁转售。
目录│产品简介 4 产品组成 5 保存条件 5 使用安全注意事项 6 pMirAd 载体图谱 6 质粒扩增 6 病毒载体扩增 7 常见问题解答 8产品有限责任担保Vigene生物保证您收到的产品符合产品目录上的规格。
本担保规定了Vigene 更换产品的责任。
Vigene生物不提供其他任何形式的对于产品商业或健康用途的保证。
Vigene生物不对任何由于使用或不正确使用本公司产品造成的直接、间接的、衍生的或偶然的损害所产生的后果负责。
产品订购和技术支持山东维真生物科技有限公司暨美国ViGene Biosciences公司中国办事处美国地址：12111 Parklawn Dr. Rockville, MD 20852 US北京办事处：北京市海淀区北三环西路43号青云里满庭芳园D座1206室上海办事处：上海市徐汇区肇家浜路201弄11号602室广州办事处：广州市天河区骏景花园骏景路棋乐街33号404室山东办事处：济南市高新区开拓路2350号留学人员创业园717室Email: service@Phone: 400-077-2566(美国) （中国）欢迎您致电或发邮件，咨询产品技术信息。
产品简介MicroRNAs（miRNAs）是一类长度为18-24个核苷酸的非编码RNA分子。
MiRNA通过与靶基因mRNA上的互补序列结合，降解mRNA或抑制mRNA的翻译。
MiRNAs在细胞分化、增殖、凋亡和癌细胞发生中发挥重要的调控作用。
MiRNAs来源于具有60-80个核苷酸茎环结构的microRNA前体（premir）和序列更长一些的microRNA初级转录产物（primir）。
MiRNA在核内由RNA聚合酶II（polII）转录生成，最初产物primir具有帽子结构和多聚腺苷酸尾巴。
ViGene生物的mirAD-腺病毒microRNA前体表达系统包括三个相关产品：microRNA前体穿梭载体、microRNA前体腺病毒载体和预制microRNA前体腺病毒。
重组腺病毒是进行基因转移和表达的工具，功能强大且易于操作。
腺病毒独特的生物学特征使它成为“载体的首选”，被科研工作者广泛应用。
首先，它能够感染包括分裂、非分裂细胞和干细胞在内的多种细胞。
第二，病毒滴度高。
第三，高滴度的病毒可获得高感染效率和高表达量。
第四，病毒进入细胞后，病毒基因组不整合到细胞染色体上，因此瞬时表达外源基因的重组腺病毒不会诱导宿主细胞中染色体的变化。
ViGene生物选用的是应用最广泛的复制缺陷型的人类血清5型腺病毒，该腺病毒载体缺失E1和E3基因。
E1基因在组装感染性病毒颗粒时必不可少，可在HEK293T细胞病毒包装过程中得到补充，而E3基因可有可无。
由于E1和E3基因的缺失，腺病毒载体可插入高达7.5kb的外源基因。
pMir-microRNA precursor是基于microRNA前体表达系统的质粒。
microRNA前体天然的茎环结构被克隆到质粒的SgfI和MluI双酶切位点。
为了保持推测的发卡结构和诱导正确的内源性反应，miRNA茎环结构的两侧具有它的150-200bp的天然序列。
MicroRNA前体在CMV启动子启动下表达，其上游有GFP荧光标记，并具有SV40 poly（A）加尾信号。
穿梭载体含有SV40启动子启动的puromycin嘌呤霉素标记，可以用来进行稳转细胞株的筛选。
穿梭载体还含有两个腺病毒ITR序列和两个与腺病毒Ad5同源的序列，可用于将microRNA前体同源重组到腺病毒载体。
microRNA前体腺病毒载体通过在大肠杆菌中同源重组，将microRNA序列从pEnter和除慢病毒、腺相关病毒之外的大部分的目的载体转移至pAD腺病毒载体。
pAD是最常用的人类腺病毒载体，是人类腺病毒血清5型，E1和E3基因的缺失。
pAD-ORF质粒可用于在HEK293细胞中包装重组腺病毒。
microRNA前体腺病毒是microRNA前体的重组腺病毒表达系统。
ViGene的预制microRNA腺病毒能够最有效地传递microRNA前体，可应用于microRNA 体外和体内的功能研究。
产品组成产品主要包括以下部分:1. pMir-microRNA 前体甘油菌液。
100ul.2. pAD-microRNA前体甘油菌液。
100ul.3. MirAd-microRNA 前体腺病毒。
每100ul含有10 8个病毒颗粒*根据特定订购要求，产品组成可能有所调整。
保存条件收到产品后，请将所有产品-80ºC保存安全注意事项请按照美国国立卫生研究院NIH推荐的方法处理包括生物安全二级（BSL_2）的所有样品。
请小心操作具有传染性的病毒样品。
pMir载体图谱pMir8356bp质粒扩增pMir-microRNA前体或pAD-microRNA前体的甘油菌液在含30ug／ml卡那霉素LB 固体培养基上活化并37℃培养过夜。
第二天，至少挑取3个克隆进行质粒小提。
用引物GFP-F对pMir-microRNA前体或pAD-microRNA前体进行5’端测序，测序位点位于接头上游 85 nt。
病毒载体扩增用包括MicroRNA前体腺病毒在内的病毒感染HEK293细胞，对病毒进行扩增。
每轮扩增可使病毒滴度增加10倍。
注：以下步骤建议使用T75培养瓶，可根据实际情况优化具体参数。
1. 转染前一天，在T75培养瓶中接种3-5×106 HEK293T细胞。
2. 取1/2体积的粗提病毒裂解液至培养细胞中。
建议使用PFU（空斑形成单位）> 0.5 或足够在48 h内产生病毒细胞病变效应（CPE）的病毒量。
3. 感染后24-48 h，每天显微镜下镜检两次，检查单层细胞是否出现细胞病变效应CPE。
当CPE接近完成（即大多数细胞圆形但尚未从瓶上脱落），用移液管将瓶上的细胞吹洗至培养液中。
4. 收集细胞和培养液。
1000 g离心5 min收集细胞。
除去上清液，悬浮细胞用10 mM Tris，pH值8.0，NaCl 100 mM重悬。
（T75培养瓶0.25-0.5ml/瓶）。
5. 反复冻融细胞3次释放病毒颗粒。
3000g 离心10 min，除去细胞碎片。
弃沉淀，保存上清液中的病毒。
6. 病毒上清-80°C冻存或立即进行纯化和滴度测定。
常见问题解答1. 在使用和操作腺病毒载体时应注意哪些安全性问题？mirAd腺病毒载体是复制缺陷型的人类血清5型腺病毒，E1和E3基因缺失。
使用腺病毒载体前请向您所在机构的生物安全部门征得许可和指令。
应在BL2生物安全二级实验室操作病毒粒子。
使用新鲜配制的10％漂白粉进行消毒操作。
操作腺病毒和转染细胞时应始终佩戴手套。
2. 在什么情况下我该选用腺病毒载体作为将microRNA前体导入细胞的工具？您应先考虑以下几点：1. 外源基因需要瞬时表达还是稳定的基因表达？2. 需转染分裂细胞还是非分裂的细胞？3.对于靶细胞的潜在免疫原性4.病毒用来进行体内还是体外基因传递？腺病毒载体能感染分裂和非分裂细胞。
它适用于体内和体外基因传递，转染效率高，对外源基因瞬时表达量高。
但相对于其他病毒载体系统，腺病毒载体在靶细胞中具有相对较高的免疫原性。
3. VP，PFU，IFU的区别是什么？我设计的实验该选用哪个指标？VP(Viral particles) 反映了病毒颗粒的总数（包括活病毒和死病毒）。
由于在病毒制备过程中，每次死病毒的比率各不相同，VP并不能真实反映有活性的病毒数量。
PFU（plaque formation unit）代表具有感染活性的病毒数量。
通常情况下，VP/PFU比值为20:1至50:1。
IFU（infectious unit）相当于PFU。
我们建议您选用PFU或IFU作为病毒滴度单位，可获得较为一致的实验结果。
4. 病毒滴度如何测定?测定腺病毒的滴度有三种常用的方法：（1）空斑形成实验（2）终点稀释实验（3）BAC法空斑形成实验是一种检测有感染能力的病毒（PFU）的生物学方法。
通常是用一系列病毒稀释液感染单层HEK293细胞，病毒在感染的细胞中繁殖，最终导致细胞毒性效应并被释放出来。
释放的病毒将感染邻近的细胞，这整个过程将被不断重复，最终导致空斑的形成。
为了阻止病毒扩散并形成新的空斑，在完成最初感染后，要将一层0.5%的琼脂铺在细胞表面上。
病毒滴度（PFU/ml）可通过统计空斑数目获得。
空斑的形成需3周时间。
终点稀释实验类似于空斑形成实验，但更为复杂。
病毒滴度的计算公式也较为复杂。
BAC法是检测蛋白浓度，仅适用于纯化后的腺病毒。
通常1 ug蛋白=1X109 VP。
5. 通过CsCl双重梯度法纯化和浓缩病毒有必要吗？如果病毒被用于体外细胞实验，不需要进行CsCl双重梯度法纯化。
由于未纯化病毒液中含有的细胞碎片和少量培养基成分易诱导显著的免疫学反应，用于体内实验或动物实验的病毒需通过CsCl双重梯度法纯化和浓缩病毒液，从而除去有缺陷的病毒颗粒和其他培养基中的成分。
6. 如何保存重组腺病毒?腺病毒可在-80°C条件下，稳定保存6个月至一年。
7. mirAd是什么血清型的腺病毒?MirAd 腺病毒是E1/E3基因缺失的人类血清5型腺病毒。
8. 什么是RCAs？如何检测 RCAs?HEK293细胞中存在与血清5型腺病毒相同的序列，重组腺病毒与293细胞的重叠序列交叉重组，可产生复制能力的腺病毒（Replication Competent Adenoviruses：RCAs），RCAs发生的几率较小。
RCA可使用非辅助细胞，如HeLa进行检测。
将梯度稀释的病毒液感染HeLa细胞，并培养8天。
8天后，若没有空斑产生，重组的腺病毒则不是有复制能力的腺病毒。
9. MirAd microRNA前体的序列是什么?mirAd microRNA前体序列是由primirs（60-80 nts）和150-200 nts的两侧基因组序列组成。
两侧基因序列应至少75nts，才能保证primir和miRNA的正确表达。
10. 如何检测miRNA?从转染的细胞中提取包括小RNAs的总RNA，用适当的接头和microRNA特异性引物进行RT-qPCR，扩增并检测microRNA的表达。
11. 每个质粒只表达一个microRNA吗？是的，每个microRNA前体只表达一个microRNA的发夹序列。