第11章 生物素-亲合素放大技术
第十一讲生物素-亲和素系统相关技术课件
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❖ 活化生物素可与不同的大分子物质结合，应 根据可标记基团的种类及特性，选择相应的 活化生物素； 抗体：BNHS 偏酸性抗原：BHZ 核酸：光生物素
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❖ 1.标记蛋白质氨基：N-羟基丁二酰亚胺酯 （BNHS）、长臂活化生物素（BCNHS）。
抗体中性和偏碱性 蛋白的标记
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❖ 2.标记蛋白质醛基：生物素酰肼（BHZ）、 肼化生物胞素（BCHZ）
用于偏酸性糖蛋 白的生物素标记
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(三)生物素标记蛋白质
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❖ 1.标记蛋白质氨基：N-羟基丁二酰亚胺酯 （BNHS）、长臂活化生物素（BCNHS 物胞素（BCHZ）。
❖ 3.标记蛋白质巯基：3-（N-马来酰亚胺-丙酰） -生物胞素（MPB）。
❖ 4.标记核酸：光生物素、生物素脱氧核苷三 磷酸、BNHS和BHZ。
A
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二）亲和素和链霉亲和素
❖(二)链霉亲和素(streptavidin，SA) ：
1.概念：是从链球菌属的菌培养液中提取的一 种蛋白质。
2.分子量：65 000 3.结构：由4个相同的肽链组成，甘氨酸和丙
氨酸含量较大 。
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4.特性：1个亲和素分子可结合4个生物素分 子。
5.亲和常数：1018/mol 6.优点：为弱酸性蛋白（PI=6.0），不含糖基，
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三）生物素-亲和素系统的特点
生物素-亲和素免疫放大技术
Dr. Wang Hui,
第四节 生物素 -亲和素系统的应用
生物素与亲和素间的结合亲和力高、特 异性强 , 且各自均可以与各型大小分子 偶联, 以及二者在结合反应时具有的多 级放大作用等优越性
Dr. Wang Hui,
Faculty of Laboratory Medicine in Xinxiang Medical College
一、生物素-亲和素系统基本类型及原理
BAS 在应用中的基本类型有二种 : 一类以游离 亲和素为中间物 , 分别连接包含生物素化大分 子的待检反应体系和标记生物素 , 称为 BAB 法 (biotin-avidin bind,BAB); 后来又在此基础上 发展了亲和素 -生物素化酶复合物技术 (avidinbiotin-peroxidase complex,ABC). 另一类是直接用标记亲和素连接生物素化大分 子反应体系进行检测的 BA 法, 或称标记亲和 素·生物素法 (labeled avidin-biotin,LAB)。
早在1916年Bateman第一個發現雞蛋蛋白 中有一種有毒物質，直到1927年Boas才發 現某種食物可以預防蛋白的毒性。之後 的研究，即將此種可抗蛋白毒性的物質--生物素分離出來。生物素的結構於1936 年被發明而出，也在1943年即能在實驗 室中合成此種物質。
Dr. Wang Hui,
Faculty of Laboratory Medicine in Xinxiang Medical College
Dr. Wang Hui,
Faculty of Laboratory Medicine in Xinxiang Medical College
主管检验师临床医学检验免疫学和免疫检验 第十一章 生物素-亲和素放大技术
第十一章生物素-亲和素放大技术第一节生物素的理化性质与标记生物素（biotin）、亲和素（avidin）是一对具有高度亲和力的物质，它们的结合迅速、专一、稳定并具有多级放大效应。
生物素-亲和素系统（BAS）是一种以生物素和亲和素具有的多级放大结合特性为基础的实验技术，它既能偶联抗原抗体等大分子生物活性物质，又可被荧光素、酶、放射性核素等材料标记。
生物素（biotin，B）广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄和肝组织中提取。
一、活化生物素利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，称为活化生物素。
生物素活化后，可容易地与各种抗原、抗体、酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标志物。
（一）标记蛋白质氨基的活化生物素此种活化生物素的制备方法是将生物素与N-羟基丁二酰胺在碳二亚胺的作用下进行缩和，生成生物素N-羟基丁二酰亚胺醣（BLAHS）。
BLAHS分子酯键中的—C-=0基团可与蛋白质分子中赖氨酸的氨基形成肽键。
从而使蛋白质标记上生物素。
（二）标记蛋白质醛基的活化生物素用于此类标记的活化生物素有两种：生物素酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BGHZ）。
BHZ是水合肼与生物素的合成物，主要用于偏酸性糖蛋白的生物素标记。
（三）标记蛋白质巯基的活化生物素3-（N-马来酰亚胺-丙酰）-生物胞素（MPB）是能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素试剂。
（四）标记核酸的活化生物素活化生物素可通过缺口移位法、化学偶联法、光化学法及末端标记法等技术使生物素的戊酸侧链通过酰胺键与核酸分子相连，构成生物素标记的核酸探针。
二、生物素标记蛋白质（一）生物素化蛋白质衍生物的特性生物素化蛋白质衍生物有两类：1.生物素化的大分子活性物质，如抗原、抗体。
2.标记材料（如酶）结合生物素后制成的标志物。
（二）标记方法1.标记抗体、抗原选用第二抗体进行生物素标记，制备的标志物具有通用性。
2.标记酶生物素标记辣根过氧化物酶第二节亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记亲和素和链霉亲和素是生物亲和素的天然特异性结合物。
生物素-亲合素放大技术
标记核酸的活化生物素
光生物素(photobiotin)
侧链上连接的芳香基叠氮物基团, 经光照后,
变为芳香基硝基苯，可直接与腺嘌呤氨基结
合, 形成B（生物素）-核酸探针
生物素脱氧核苷三磷酸（Bio-dUTP）
作为TTP（三磷酸胸苷）的结构类似物，可 采用缺口移位法掺入化 特 性
亲合素（A）
结构 四亚基糖蛋白 pI 10.5 结合位 色氨酸 生物素 4 K（亲和常数） 1015 活性(U) 13～15
链霉亲合素(SA)
四肽链蛋白 无糖基 6 色氨酸 4 1015 15～18
二、亲合素/链霉亲合素标记
标记物：酶、胶体金 异硫氰酸荧光素（FITC） HRP-AV(SA) 改良过碘酸钠法、戊二醛法 ABC/SABC 预制亲和素(AV)-Biotin、 链霉亲和素(SAV)-Biotin
BAS主要与免疫放射分析(IRMA)检测体系偶 联，用于对终反应的放大（BA法） BAS也可用于IRMA反应后B、F成分的分离
四、生物素-亲合素系统在分子生 物学中的应用
以生物素标记核酸探针进行的定位检测 用BAS制备的亲和吸附剂进行基因的分离 纯化 将免疫测定技术与PCR结合建立免疫PCR(immuno-PCR)用于抗原的检测。
可直接标记核酸， 但对碱基配对有影 响（影响氢键的形成）
二、生物素标记蛋白质
活化生物素通过侧链与蛋白分子连接 一个蛋白分子可被多个生物素标记－多价性 对BNHS多标记抗体, BHZ则多标记偏酸性抗原； 抗原、抗体标记后活性不变 可对标记材料（如酶）标记：碱性磷酸酶标记 后活性将降低
+ABC
Ab-Ag-Ab-B + ABC
Ab-Ag-Ab-B-ABC
主管检验师资格考试临床免疫学和免疫检验 复习习题 第十一章 生物素-亲和素放大技术(附答案解析)
主管检验师资格考试临床免疫学和免疫检验复习习题第十一章生物素-亲和素放大技术（附答案解析）一、A1型题1、每个亲和素能结合生物素分子的数目是（）A、4B、2C、1D、3E、82、以下关于生物素-亲和素系统（BAS）的说法错误的是（）A、1个亲和素分子可结合4个生物素分子B、1个生物素分子可以结合多个亲和素分子C、生物素易与抗体、酶、多聚核苷酸结合D、亲和素易与酶、铁蛋白、荧光素、核素结合E、亲和素和生物素.有极强的亲和力3、免疫组化技术的优点不包括（）A、高特异性B、高敏感性C、形态学的直观性D、精确定量分析E、能对抗原表达情况进行分析4、BAS在ELISA技术中应用最广泛的反应模式是（）A、ABAB、ABCC、BRABD、BAE、LAB5、免疫组化染色前，对标本进行固定的目的是（）A、保存组织细胞的抗原性B、防止细胞脱落C、防止细胞自溶D、终止胞内酶的活性E、使细胞内蛋白质凝固6、ABC-ELISA将酶标记在（）A、亲和素B、生物素C、抗体D、补体E、抗原7、关于亲和素-生物素系统的错误描述是（）A、用于间接包被B、用于终反应放大C、用于酶免疫测定D、用于胶体金测定E、不用于荧光免疫测定8、ABC-ELISA将酶标记在（）A、亲和素B、生物素C、抗体D、补体E、抗原9、关于生物素标记蛋白质的注意事项，下列说法错误的是（）A、根据抗原或抗体分子结构中所带可标记基团的种类以及分子的理化性质，选择相应的活化生物素和反应条件B、活化生物素与待标记抗原或抗体可以为任意比例C、在生物素与被标记物之间加入交联臂样结构可减少空间位阻影响D、生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后，不影响后者的免疫活性E、生物素标记酶时会影响其免疫活性10、亲和素和生物素结合的特点是（）A、免疫反应B、不属于免疫反应C、特异性弱D、亲和力小E、不够稳定二、B型题1、 A.ABCBC.BABD.直接法BASE.间接法BAS<1> 、标记亲和素-生物素的方法为（）；<2> 、亲和素-生物素化酶复合物技术为（）；<3> 、生物素化第二抗体为（）；<4> 、生物素化第一抗体为（）。
生物素-亲和素免疫放大技术
第十一章生物素 -亲和素免疫放大技术一、生物素 - 亲和素系统的特点灵敏度高，特异性好，稳定性高，适用广泛。
二、生物素的理化性质与标记（一）生物素及其活化1.标记蛋白质氨基的活化生物素N- 羟基丁二酰亚胺酯（ BNHS）2. 标记蛋白质醛基的活化生物素酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BCHZ）3.标记蛋白质巯基的活化生物素3- （ N-马来酰亚胺 - 丙酰） - 生物胞素（ MPB）4.标记蛋白质核酸的活化生物素常用于标记核酸分子的活化生物素有光生物素、生物素脱氧核苷三磷酸、BNHS和 BHZ。
（二）生物素标记蛋白质生物素化蛋白质衍生物的特性生物素化蛋白质衍生物有两类：一种是生物素化的大分子生物活性物质（如抗原、抗体），另一种是标记材料（如酶）结合生物素后制成的标记物。
标记方法：（ 1）标记抗体、抗原：常用于标记抗体的活化生物是BNHS；对于偏酸性的抗原，标记时多采用 BHZ。
（ 2）标记酶：以生物素标记HRP为例。
标记注意事项：（ 1）应根据抗原或抗体分子结构中所带可标记基团的种类以及分子的理化性质，选择相应的活化生物素和反应条件；（2）标记反应时，活化生物素与待标记抗原或抗体应有适当的比例；（3）为减少空间位阻影响，可在生物素与被标记物之间加入交联臂样结构；（4）生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后，不影响后者的免疫活性；标记酶时则结果有不同。
三、亲和素、链霉亲和素理化性质与标记1.亲和素及其活性：活性基团 - 色氨酸。
2.链霉亲和素及其活性：活性基团- 色氨酸。
3.亲和素、链霉亲和素的标记：最常用的是酶、FITC 和胶体金。
亲和素的标记（链霉亲和素的标记）（1） HRP-亲和素结合物的制备：改良过碘酸钠法，戊二醛法；（2）亲和素 - 生物素化HRP复合物的制备；（3）亲和素 - 生物素化碱性磷酸酶复合物的制备。
四、生物素 - 亲和素系统的应用1.生物素 - 亲和素系统基本类型及原理：基本类型有两种，一类以游离亲和素为中间物，分别连接包含生物素大分子的待检反应体系和标记生物素，称为BAB法；后来又在此基础上发展了亲和素 - 生物素化酶复合物技术（ ABC）。
(完整word版)初级检验技师临床免疫学和免疫检验(2017年讲义)第十一章生物素-亲和素放大技术
第十一章生物素-亲和素放大技术生物素、亲和素是一对具有高度亲和力的物质，它们的结合迅速、专一、稳定并具有多级放大效应。
生物素-亲和素系统（BAS）是一种以生物素和亲和素具有的多级放大结合特性为基础的实验技术，它既能偶联抗原抗体等大分子生物活性物质，又可被荧光素、酶、放射性核素等材料标记。
第一节生物素的理化性质与标记生物素（biotin，B）广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄和肝组织中提取，分子量244.31kD。
一、活化生物素利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，称为活化生物素。
（一）标记蛋白质氨基的活化生物素（二）标记蛋白质醛基的活化生物素有两种：生物素酰肼（BHZ）和肼化生物胞素（BGHZ）。
（三）标记蛋白质巯基的活化生物素：3-（N-马来酰亚胺-丙酰）-生物胞素（MPB）。
（四）标记核酸的活化生物素：生物素戊酸侧链通过酰胺键与核酸分子相连，构成生物素标记的核酸探针。
1.光敏生物素：用于DNA或RNA的标记。
2.生物素脱氧核苷三磷酸：将生物素与某种脱氧核苷酸连接成活化生物素。
用缺口移位法掺入到双链DNA中。
3.BNHS和BHZ：与核酸胞嘧啶分子中的N-4氨基交联，使核酸分子生物素化。
二、生物素标记蛋白质（一）生物素化蛋白质衍生物的特性生物素化蛋白质衍生物有两类，一种是生物素化的大分子活性物质（如抗原、抗体），另一种是标记材料（如酶）结合生物素后制成的标记物。
（二）标记方法1.标记抗体、抗原：由于一个抗体分子可连接多个生物素分子，因此一个生物素化的抗体分子在反应时可与多个亲和素分子结合。
通常选用第二抗体进行生物素标记，制备的标记物具有通用性。
2.标记酶：如生物素标记辣根过氧化物酶（HRP）。
（三）标记注意事项1.应根据抗原或抗体分子结构中所带可标记基团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的理化性质（酸性、中性或碱性），选择相应的活化生物素和反应条件。
2.标记反应时，活化生物素与待标记抗原或抗体应有适当的比例，使每个蛋白质分子上标记的生物素分子数量控制在一定范围，以免影响标记物的活性。
生物素-亲和素放大技术
生物素-亲和素放大技术生物素与亲和素之间结合的亲和力高、特异性强，各自均可以与各型大小分子结合，以及两者在结合反应时具有的多级放大作用等优越性。
生物素的理化性质与标记亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记生物素-亲和素系统的特点生物素-亲和素系统的应用生物素的理化性质与标记生物素（biotin，B）广泛分布于动、植物组织中，常从含量较高的卵黄和肝组织中提取，分子量244.31kD。
活化生物素利用生物素的羧基加以化学修饰可制成各种活性基团的衍生物，使之容易地与各种抗原、抗体、酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标志物。
包括能标记蛋白质氨基、醛基、巯基和核酸的活化生物素。
常用于标记核酸分子的活化生物素有以下几种：1.光敏生物素它是一种化学合成的生物素衍生物，用于DNA或RNA的标记。
2.生物素脱氧核苷三磷酸先将生物素与某种脱氧核苷酸连接成活化生物素。
可采用缺口移位法掺入到双链DNA中。
3.BNHS和BHZ 二者均可以在一定条件下与核酸胞嘧啶分子中的N-4氨基交联，使核酸分子生物素化。
生物素标记蛋白质（一）生物素化蛋白质衍生物有两类，一种是生物素化的大分子活性物质（如抗原、抗体），另一种是标记材料（如酶）结合生物素后制成的标志物。
而且一个蛋白质分子可连接多个生物素分子，从而使其具有较高的比活性，在与亲和素的反应中成为多价。
生物素化大分子的多价性，是BAS多级放大作用的物质基础。
生物素化蛋白质衍生物有两类，一种是生物素化的大分子活性物质（如抗原、抗体），另一种是标记材料（如酶）结合生物素后制成的标志物。
（二）标记注意事项1.选择正确的活化生物素和反应条件；2.应有适当的比例，以免影响被标志物的活性；3.可在生物素与被标志物间加入交联臂样结构；4.不影响被标记物的免疫活性。
亲和素、链霉亲和素的理化性质与标记亲和素（AV）和链霉亲和素（SA）是生物亲和素的天然特异性结合物。
而且，二者均为大分子蛋白，几乎所有用于标记的物质均可以与之结合。
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O NH NH N3 NH NO2 (CH2)3 N CH3 (CH2)3 NH C (CH2)4
S
生物素脱氧核苷三磷酸（Bio-dUTP）
作为TTP的结构类似物，可采用缺口移 位法掺入到双链DNA中。
BNHS和BHZ 可直接标记核酸， 但对碱基配对有影 响。
+A-E
BAS实验方法及反应层次
方法 反应层次
直接法
BA
BAB
Ag-(
ABC
间接法 BA
Ag- (Ab-B)-AB*C
Ag-Ab1-(Ab2-B)-A*
BAB
ABC
Ag-Ab1- (Ab2-B)-A-B*
Ag- Ab1- (Ab2-B)-AB*C
第十一章 生物素-亲合 素放大技术
第一节
生物素理化性质与标记
I环为咪唑酮环，可与亲合 素结合 Ⅱ环为噻吩环，C2上戊酸 侧链的未端羧基是结合生 物大分子的唯一结构
生物素（biotin,B）是一 种小分子生长因子,又称维生 素H或辅酶R 动、植物组织中广泛分布, 卵黄和肝含量高 MW 244.31kD.
二、生物素标记蛋白质
活化生物素通过侧链与蛋白分子连接；
一个蛋白分子可被多个生物素标记－多价性； 对BNHS多标记抗体, BHZ则多标记微酸性抗原； 抗原、抗体标记后活性不变； 可对标记材料（如酶）标记：碱性磷酸酶标记后
活性将降低；
选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记基团 的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性；
生物素与亲合素之间结合的亲合 力高、特异性强，各自均可以与各型 大小分子结合，以及二者在结合反应 时具有的多级放大作用等优越性，使 BAS及其相关技术被广泛应用在各种标 记免疫分析技术领域中，尤其为标记 免疫检测自动化分析做出了极大的贡 献。
一、生物素-亲合素系统基本类型 及原理
BAB法：
Ag+B· Ab
二、亲合素/链霉亲合素标记
标记物：小分子示踪物125I、胶体金、荧光素、 化学发光物 大分子物质如酶抗原、抗体 亲和素的标记： HRP的标记 改良过碘酸钠法 戊二醛法
过碘酸盐氧化法
O
NaIO4
O O
O O
O
酶-五炭糖环 + NH2Avidin
O
OH N Avdin
O
NaBH4
O
O
N
H2O
O N OH
+ B-E + A ABC
+ABC
Ab-Ag-Ab-B + ABC
Ab-Ag-Ab-B-ABC
BA法
Ag+B· Ab
Ag-Ab· B
A· E
Ag-Ab· B-A· E
特点：以A-E/SA-E代替BAB法中的A，省 却了加B-E的步骤
Ag-Ab1-Ab2-B + A-E
Ag-Ab1-Ab2-B-A-E
物。而且，二者均为大分子蛋白，因此几乎所
有用于标记的物质均可以同亲合素（AV）或链
酶亲合素（SA）结合。
一、理 化 特 性
亲合素（A）
结构 PI 结合位 生物素 Ka 活性 四亚基糖蛋白 10.5 色氨酸 4 1015 13～15
链霉亲合素(SA)
四肽链蛋白 无糖基 6 色氨酸 4 1015 15～18
主要用于标记偏酸性糖蛋白
肼化生物胞素(BCHZ) ：生物素与赖氨酸连接
后，再与无水肼反应而成。 除醛基外， BCHZ还可标记氨基
标记蛋白质巯基的活化生物素
马来酰亚胺-丙酰-生物胞素（MPB)
能特异地与蛋白质巯基结合的活化
生物素
标记核酸的活化生物素
光敏生物素(photobiotin)
侧链上连接的芳香基叠氮物基团, 经光照后, 变为芳香
Ag-Ab· B
A
Ag-Ab· B-A
B· E
Ag-Ab· B-A-B· E
特点：以游离A分别连接B-Ab和B-E
+A
+A
ABC法 ⑴ ⑵ A+B· E Ag+B· Ab A- B· E----ABC Ag-Ab· B
ABC
Ag-Ab· B-ABC
特点:将BAB法中的A先与B-E结合，制备成复合物 ABC
控制生物素：蛋白质比例
生物素：IgG 用量比(mg/mg)宜为2:1, IgG应用浓度 0.5~5μg/ml; 生物素1~3个/Ag，3~5个/Ab；
使用交联臂减少空间阻力
第二节 亲合素、链霉亲合素的理
化性质与标记
亲合素(avidin, AV) 和链霉亲合素
(streptavidin, SA)是生物素的天然特异性结合
过碘酸盐氧化法
O
NaIO4
O O
O O
O
酶-五炭糖环 + NH2SAvidin
O
OH N Avdin
O
KBH4
O
O
N
H2O
O N OH
O
OH
O
SAvidin
SAvidin
Schiff碱
第三节 生物素-亲合素系统的特点
一、灵敏度高 二、特异性强 三、稳定性好 四、适用性广 五、其他
第四节 生物素-亲合素系统的应用
标记核酸的活化生物素
标记蛋白质氨基的活化生物素
O C NH CH CH2 S NH CH CH (CH2)4COOH NH2 C CH2 CH2 C NH OH O
O
EDC O C O
O
C N C O CH2 CH2
生物素
N-羟基丁二酰胺
碳二亚 胺
生物素羟基 琥珀酰亚胺 酯（BNHS ）
活化生物素
I 咪唑酮环
羧基
Ⅱ
噻吩环
一、活化生物素
生物素侧链的末 端羧基经化学修
饰后制成带各种
活性基团的衍生 物－活化生物素
(生物素化衍生物)
生物素活化
标记蛋白质氨基的活化生物素 标记蛋白质醛基的活化生物素 标记蛋白质巯基的活化生物素
活化生物素易 与抗原、抗体 酶及核酸分子 中相应基团偶 联形成生物素 化标记物
如何减小空间位阻？
长臂活化生物素（BCNHS）： 生物素和N-羟基丁二酰亚胺之间添 加了两个6-氨基已糖分子基团，形 成连结臂，生物素与大分子基团的 距离
BNHS分子可与蛋白质 赖氨酸的氨基形成肽键 BNHS适用标记抗体和 中性或偏碱性的蛋白质
标记蛋白质醛基的活化生物素
生物素酰肼(BHZ)：水合肼与生物素的合成物
O
OH Avidin
O
Avidin
Schiff碱
戊二醛法
O C 酶－NH2 亲和素－NH2 ＋ (CH2)3 C O H H 酶 N CH (CH2)3
亲和素
N
CH
2.亲和素－生物素化HRP复合物的制备
B-E
+
A
ABC
链霉亲和素的标记 方法：过碘酸钠法 HRP+NaIO4+SA
透析+KBH4
沉淀