亲和素和生物素系统.ppt
第十一讲生物素-亲和素系统相关技术课件
2020/12/18
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❖ 活化生物素可与不同的大分子物质结合，应 根据可标记基团的种类及特性，选择相应的 活化生物素； 抗体：BNHS 偏酸性抗原：BHZ 核酸：光生物素
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❖ 1.标记蛋白质氨基：N-羟基丁二酰亚胺酯 （BNHS）、长臂活化生物素（BCNHS）。
抗体中性和偏碱性 蛋白的标记
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❖ 2.标记蛋白质醛基：生物素酰肼（BHZ）、 肼化生物胞素（BCHZ）
用于偏酸性糖蛋 白的生物素标记
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(三)生物素标记蛋白质
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❖ 1.标记蛋白质氨基：N-羟基丁二酰亚胺酯 （BNHS）、长臂活化生物素（BCNHS 物胞素（BCHZ）。
❖ 3.标记蛋白质巯基：3-（N-马来酰亚胺-丙酰） -生物胞素（MPB）。
❖ 4.标记核酸：光生物素、生物素脱氧核苷三 磷酸、BNHS和BHZ。
A
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二）亲和素和链霉亲和素
❖(二)链霉亲和素(streptavidin，SA) ：
1.概念：是从链球菌属的菌培养液中提取的一 种蛋白质。
2.分子量：65 000 3.结构：由4个相同的肽链组成，甘氨酸和丙
氨酸含量较大 。
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4.特性：1个亲和素分子可结合4个生物素分 子。
5.亲和常数：1018/mol 6.优点：为弱酸性蛋白（PI=6.0），不含糖基，
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三）生物素-亲和素系统的特点
临床免疫学：第十三章 生物素-链霉亲和素标记免疫技术
3、按BNHS：抗体1：8 ～1：15（体积比）混合， 室温搅拌下反应2 ～4小时；
4、装入透析袋，用0.05mol/L、pH7.2 PBS，4 ℃ 透析过夜；
5、结合物内加等体积甘油，小量分装，-20℃冻 存备用。
2、与其他标记物（如酶、荧光素、胶体金）结合制成 新的标记物。
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3、生物素标记抗体（IgG）的制备 基本原理 生物素N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS）分子酯键中的-
C=O基团可与蛋白质分子中的氨基在碱性条件下形成肽 键，从而使其标记上生物素。
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4、实验流程
1、用二甲基甲酰胺（DMF）将BNHS配成1mg/ml溶 液；
第三类是将亲和素与酶标生物素共温形成亲和素-生物素 -过氧化物酶复合物，再与生物素化的抗（抗）体接触， 将抗原-抗体反应体系与ABC标记体系连成一体，称为 ABC法。
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17第三节生物素和亲和素系统的技术方法一桥联亲和素生物素法bridgedavidinbiotintechnologybab法lymphocytebab法直接法检测原理示意图18二标记亲和素生物素法labelledavidinbiotintechlab间接法lab法直接法检测原理示意图20abc双抗体夹心elisa检测原理示意图三亲和素生物素化酶复合物法abcpapabc复合法检测原理示意图四酶抗酶亲和素生物素化酶复合物法papabc23第四节技术评价与应用领域1生物素b和亲和素a之间的高亲和力使反应试剂经得起高度稀释降低或避免了非特异性结合
的羧基经活化修饰 后形成的衍生物， 只有活化生物素才 能偶联各种其他生 物大分子，如蛋白 质、多糖、荧光素 等。
生物素-链亲和素
生物素-链亲和素
1 简介
生物素-链亲和素是一种用于分离和纯化特定蛋白质的技术。
生物素是一种维生素，链亲和素是一种人工合成的小分子化合物，它们可以相互结合形成生物素-链亲和素复合物。
这种复合物可以用于特异性地捕获具有生物素结合蛋白（如亲和标签）的蛋白质。
2 生物素
生物素是一种水溶性维生素，也称为维生素H。
它是许多酶类的辅助因子，参与多种代谢反应。
生物素可以通过食物摄入或肠道内微生物的合成获得。
生物素在生物体内的作用包括促进葡萄糖、脂肪和氨基酸的代谢，以及DNA复制和表达的调节。
3 链亲和素
链亲和素是一种人工合成的小分子化合物，它是由生物素和亲和基团（如imidazol）组成的。
链亲和素可以与生物素结合，形成生物素-链亲和素复合物。
链亲和素的亲和性可以通过改变亲和基团的结构来调节。
链亲和素可用于纯化和检测蛋白质，特别是那些具有生物素标签的蛋白质。
4 生物素-链亲和素的应用
生物素-链亲和素是一种常用的蛋白质纯化技术。
利用这种技术，可以通过将生物素-链亲和素复合物结合到具有生物素标签的蛋白质上，将目标蛋白质高效地分离和纯化出来。
此外，生物素-链亲和素还可用于检测和定量具有生物素标签的蛋白质。
5 结语
生物素-链亲和素技术是一种基于生物素标签的蛋白质纯化和检测方法。
通过利用生物素和链亲和素相互结合形成的复合物，可以高效地分离和纯化具有生物素标签的蛋白质。
这种技术广泛应用于生命科学研究和工业领域。
标记亲和素生物素法
标记亲和素生物素法标记亲和素生物素法是一种常用的生物化学实验技术，用于研究蛋白质的相互作用。
本文将介绍亲和素生物素法的原理、应用和实验步骤。
一、原理亲和素生物素法基于生物素（biotin）与亲和素（avidin或streptavidin）之间的高度特异性结合。
生物素是一种水溶性维生素，与亲和素结合后形成稳定的复合物。
利用这种结合关系，可以将含有生物素的分子与亲和素结合，从而实现对目标分子的标记和纯化。
二、应用亲和素生物素法在生物科学研究中有广泛的应用。
其中一些主要应用包括：1. 蛋白质纯化：通过将含有生物素的标签蛋白与亲和素结合，可以实现对目标蛋白的高效纯化。
2. 免疫组化：生物素标记的抗体可以与细胞或组织中的特定抗原结合，从而实现对抗原的检测和定位。
3. 蛋白质相互作用研究：通过将目标蛋白与生物素标记的配体蛋白结合，可以研究蛋白质的相互作用和信号传导机制。
三、实验步骤亲和素生物素法的实验步骤主要包括以下几个方面：1. 标记生物素：将生物素与所需标记的分子（如蛋白质或核酸）进行化学反应，将生物素引入目标分子中。
2. 制备亲和素柱：将亲和素（如avidin或streptavidin）固定在柱子上，形成亲和素柱。
亲和素柱可以商购买或自行制备。
3. 样品处理：将标记了生物素的分子与亲和素柱接触，使其与亲和素结合。
4. 洗脱：通过改变溶液条件，如改变pH值或添加竞争性配体，使亲和素与目标分子解离，从而洗脱目标分子。
5. 分析和应用：将洗脱得到的目标分子用于后续实验或分析，如Western blot、质谱分析等。
四、实验注意事项在进行亲和素生物素法实验时，需要注意以下几点：1. 使用高纯度的生物素和亲和素，以确保实验结果的准确性。
2. 选择适当的洗脱条件，以实现目标分子的高效洗脱。
3. 控制实验中的非特异性结合，以减少背景信号。
4. 根据实验需要选择合适的生物素标记方法，如目标分子的标记位置和标记方式（N-末端、C-末端或内部标记）。
ABC法亲和素与生物素系统的操作流程
ABC法亲和素与生物素系统的操作流程
亲和素—生物素—过氧化物酶复合物法是许世明于1981年在BAB法和LAB法的基础上改良的，其特点是利用亲和素分别连接生物素标记的第二抗体和生物素标记的酶。
ABC法与LAB法、BAB法不同的是第一抗体不为生物素所标记，生物素标记的第二抗体与ABC复合物相连接，最后进行显色反应定位。
复合物是将过氧化物酶结合在生物素上，再将生物素—过氧化物酶连接物与过量的亲和素反应而制备的。
ABC法与LAB法、BAB法相比较具有敏感性高、特异性强、背景染色淡等优点。
ABC法染色流程如下。
(1)4um石蜡切片常规脱蜡至水，PBS洗3X3min。
(2)IHC的前处理视特异性一抗不同，可采用蛋白酶消化或热诱导的微波抗原修复(AR)，PBS洗3X3min。
(3)3％过氧化氢孵育10min(可省略)，以阻断内源性过氧化物酶活性。
(4)PBS洗3X3min。
(5)10％非免疫性动物血清孵育10min(可省略)，以减少非特异性背景，无需冲洗只需吸去多余血清。
(6)滴加适当稀释的第一抗体，37℃孵育60min或4℃过夜。
(7)PBS洗3X3min。
(8)滴加生物素标记的二抗，37℃孵育30～60min。
(9)PBS洗3X3min。
(10)滴加ABC复合物(提前30min，A液与B液等量混合)，37℃孵育30～60min。
(11)PBS洗3X3min。
(12)0．04％DAB(含0．03％H：02)显色5～10min。
(13)复染，脱水，常规树胶封固和结果观察。
生物素亲和素系统
2mg IgG
1mmol IgG
20mmol B-NHS
1ml IgG ×
×
×
＝0.000266mmol
1ml IgG
150000mg IgG
1mmol IgG
1000000ul
L
0.00026mmol B-NHS ×
A、计算
B-NHS的使用量要根据被标记的蛋白的量和浓度计算。通过控制B-NHS和蛋白的量可以 控制标记的程度。当标记较低浓度的蛋白的时候需要更多的B-NHS以达到相同的标记效 果。一般为达到最好的标记效果，对于10mg/ml蛋白， B-NHS的使用量≥12mol倍，对于 2mg/ml蛋白， B-NHS的使用量≥20mol倍，
不同点： 1、分子量： AV=66KD-69KD，SA=54KD 2、等电点：AV=10.5，SA=6.0，AV带正电较多，非特异性结合较强，可通 过醋酸酐等修饰降低表面所带正电荷，增加亲和素稀释液的PH和离子强度降 低非特异性结合。 3、位阻效应：SA的生物素结合位点较AV深，位阻效应较强，长臂生物素更 适合。 4、生物素的结合：AV随机结合，SA协同结合。 5、氨基酸序列： AV含二硫键和10%糖，SA含甘氨酸丙氨酸较多，无糖和二 硫键。
生物素-亲和素系统
亲和素 链霉亲和素 生物素 生物素衍生物及配体连接 生物素亲和素系统的应用 链霉亲和素磁珠制备 链霉亲和素包被板制备 生物素连接抗原/抗体实验 生物素—链霉亲和素系统在项目的试验
郑州安图生物 2008年
亲和素(Avidin)
一、来源： 亲和素主要存在于鸡蛋清中，可通过离子交换和分子筛方法提 纯，从1L蛋清中可提取纯亲和素15-25mg。亲和素可以在PH 5-7的高盐 缓冲液中结晶出来，但没有报道在等电点附近的缓冲液中可以结晶析出。
生物素亲和素
分子式：C10H16O3N2S 分子量：244.31 等电点：PH=3.5 溶解特性：难溶于水，易 溶于二甲基甲酰胺(DMF) 两个环状结构： I环（咪唑酮环）为与亲 和素结合的主要部位； II环（噻吩环）为结合抗 体和其它生物大分子的部 位，C2上戊酸侧链的未端 羧基是结合生物大分子的 唯一结构
分子量：68 000
比活性：A≥12u/mgP
亲和常数：1015/mol
生物素酰肼(BHZ)：水合肼与生物素的合成物 主要用于标记偏酸性糖蛋白 肼化生物胞素(BCHZ) ：生物素与赖氨酸连接后， 再与无水肼反应而成。 除醛基外， BCHZ还可标记氨基
标记特点：BHZ与蛋白质中的 醛基结合而标记
马来酰亚胺-丙酰-生物胞素（MPB)：
能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素
活化生物素可克服以上缺点，既减少空间位阻 效应，又可扩大其结合的对象。
生物素侧链的末
端羧基经化学修
饰后制成带各种 活性基团的衍生
物－活化生物素
(生物素化衍生 物)
标记蛋白质氨基的活化生物素
N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS） 长臂活化生物素（BCNHS）
活化生物素易 与抗原、抗体 酶及核酸分子 中相应基团偶 联形成生物素 化标记物
注意事项：
选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记基 团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性；
控制生物素：蛋白质比例 生物素：IgG 用量比(mg/mg)宜为2:1，IgG应用浓度 0.5~5μg/ml；生物素1~3个/Ag，3~5个/Ab； 使用交联臂减少空间阻力
概念：是动物微生物中提取的一种含10%碳水化物的碱性糖 蛋白，可由蛋清中提取。 主要包括：卵白亲合素、链亲合素、卵黄亲合素及类亲合素 等。后两种因其特异性亲合力低，研究不多，前两种目前已 深入研究并得到广泛应用。 结构：4个相同亚基组成的四聚体糖蛋白，富含色氨酸，它 是与生物素结合的基团。
生物素亲和素系统
亲和素 链霉亲和素 生物素 生物素衍生物及配体连接 生物素亲和素系统的应用 链霉亲和素磁珠制备 链霉亲和素包被板制备 生物素连接抗原/抗体实验 生物素—链霉亲和素系统在项目的试验
郑州安图生物 2008年
亲和素(Avidin)
一、来源： 亲和素主要存在于鸡蛋清中，可通过离子交换和分子筛方法提 纯，从1L蛋清中可提取纯亲和素15-25mg。亲和素可以在PH 5-7的高盐 缓冲液中结晶出来，但没有报道在等电点附近的缓冲液中可以结晶析出。
三、活性：SA 和AV 的活性都是结合生物素的量来表示，1mg蛋白结合生物 素的微克数就是该蛋白的活性单位。从分子量计算，AV的最高活性是 15u，完整SA是14u，核心SA 的分子量较低，最高活性可达l8u，但由于 1分子蛋白都结合4分子生物素，故它们的应用效果相同。
AV的活性基团是肽链中的4个色氨酸残基，SA 的活性基团也是肽链中的色 氨酸残基，当用对色氨酸特异的Koshlands试剂处理后，SA就丧失了和生 物素结合的能力。最近实验又显示，酪氨酸残基对蛋白的活性也有作用， AV的每条肽链中只有一个酪氨酸残基(Tyr)，硝基苯磺酰氟(Nbs-F)只要平 均修饰它的0.5个Tyr，就可使其完全失去活性。SA的每条肽链中含6个Tyr 残基， Nbs-F也修饰其中的一半即3个可便SA失去结合生物素活性。 四：等电点： PH= 6.0
温度、盐的影响：游离亲和素在85℃就会失活，但是生物素-亲和素复合物可 在短时间内耐受132 ℃的高温。生物素-亲和素复合物对热的耐受能力依赖于 盐的存在，在没有盐存在时， 100 ℃10分钟约有88%的生物素-亲和素复合物 解离，但在有盐存在的条件下，需120 ℃15分钟复合物才能完全解离。
PH、变性剂影响：生物素-亲和素复合物在PH 2-13或8M盐酸胍（中性）条件 下不会受到影响，并可以用硫酸锌沉淀，但是沉淀出的复合物用70%蚁酸处 理1小时会使亲和素不可逆失活。
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• ABC 复合物不能饱和，即亲和素上的4 个结合位 点最多允许3 个位点与生物素化酶结合，留1~2 个位点与生物素化二抗结合。
• 抗原先后与特异性一抗、生物素化二抗、ABC 复 合物结合，最终形成巨大复合体，因该复合体网 络了大量酶分子，从而提高了检测的灵敏度。
• 亲和素有4 个亚单位，它具有4 个同生物素 亲和力极高的结合位点，因其能使生物素 失活，故又称抗生物素。
链霉亲和素
• 链霉亲和素（streptavidin ）是一种从链霉 菌培养物中提取的蛋白质，相对分子质量 60000，且不含糖链。
• 同亲和素一样，链霉亲和素也具有4个生物 素结合位点，亲和力高达10－15 mol/L，是 一种更完美的生物素结合蛋白。因为它很 少有低聚糖残余成分，可保持中性等电点， 避免了组织中的非特异性染色。
• 14、Thank you very much for taking me with you on that splendid outing to London. It was the first time that I had seen the Tower or any of the other famous sights. If I'd gone alone, I couldn't have seen nearly as much, because I wouldn't have known my way about.
• 抗体分子经生物素化后，其结合抗原的能 力不受损失，细胞经生物素化后仍能保持 正常的分裂、增殖能力，因此被用作抗体、 细胞的标记。
亲和素
• 亲和素（avidin）是一种分子质量为 68000Da的一种碱性糖蛋白。亲和素具有 与其他示综物质，如，荧光素、酶、胶体 金等，结合的能力。
• 生物素和亲和素之间有极强的亲和力，比 抗体对抗原的亲和力要高出100 万倍。
。2020年12月10日星期四2020/12/102020/12/102020/12/10
• 15、会当凌绝顶，一览众山小。2020年12月2020/12/102020/12/102020/12/1012向哪头，那么任何风都不是顺风。2020/12/102020/12/10December 10, 2020
物素标记抗体结合。由于采用了改良的亲 和纯化技术和酶标技术，LSAB 法敏感性更 高、背景更清晰。
LSAB法优缺点
• 此方法与ABC 法相比，不需A、B 两液提前混合， 操作者容易掌握，稳定性高，由于采用了低等电 点的链霉亲和素，其内源性生物素干扰要低于 ABC 法。
• 该法生物素化二抗和链霉亲和素HRP （AKP）的 孵育（室温）时间仅需10 15min，其敏感性和 所用时间与EnVision 法一致。
标记亲和素-生物素法（labeled avidin biotin，LAB）
• 将亲和素与标记酶（HRP）结合，一个亲和素可 结合多个HRP
• 将生物素与抗体（一抗或二抗）结合，一个抗体 分子可连接多个生物素分子
• 细胞的抗原（或通过一抗）先与生物素化的抗体 结合，继而将酶标记亲和素结合在抗体的生物素 上，如此多层放大提高了检测抗原的敏感性。
• 亲和素和生物素系统是在免疫组织化学技 术方法上不断加以改进，与细胞生物化学 紧密结合后的产物。
• 这种方法使免疫组化技术的敏感性得到进 一步提高，更有利于微量抗原（或抗体） 在细胞或亚细胞水平的定位，扩大了其应 用范围。
生物素
• 生物素（biotin ），也称维生素H，是一种 分子质量为244Da 的小分子维生素。
标记链霉亲和素-生物素法 （Labelled streptavidin biotin ，
LSAB）
• 它是采用生物素标记的第二抗体与结合有 HRP 或AKP 酶的链霉亲和素 （streptavidin ）连接来测定细胞及组织中 的抗原。
• 链霉亲和素同一定浓度的生物素化酶混合 后，就能形成链霉亲和素-生物素-酶复合物， 这种复合物中至少存在1 个尚未被生物素占 据的链霉亲和素结合位点，可以和各种生
亲和素和生物素系统
亲和细胞化学不同于免疫细胞化学，亲 和细胞化学是利用两种物质之间的高度 亲和能力而相互结合的化学反应。
目前，亲和组织化学中的亲和物质包括 亲和素与生物素、植物凝集素与糖类、 葡萄球菌A 蛋白（SPA ）与IgG、抗原与 抗体、阳离子与阴离子、激素与维生素 和脂质与受体等。
亲和素和生物素系统
• 最大的缺点是内源性生物素的干扰。
• 9、春去春又回，新桃换旧符。在那桃花盛开的地方，在这醉人芬芳的季节，愿你生活像春天一样阳光，心情像桃花一样美丽，日子像桃子一样甜蜜。 2020/12/102020/12/10Thursday, December 10, 2020
• 10、人的志向通常和他们的能力成正比例。2020/12/102020/12/102020/12/1012/10/2020 1:38:11 PM • 11、夫学须志也，才须学也，非学无以广才，非志无以成学。2020/12/102020/12/102020/12/10Dec-2010-Dec-20 • 12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。2020/12/102020/12/102020/12/10Thursday, December 10, 2020 • 13、志不立，天下无可成之事。2020/12/102020/12/102020/12/102020/12/1012/10/2020
桥接亲和素-生物素法（bridged avidin biotin，BAB）
• 先使抗原与生物素化的抗体结合，再以游 离亲和素为“桥”将生物素化抗体与酶标 记生物素连接，也可达到多层放大效果。
亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法 （avidin biotin-peroxidase complex，
ABC）