ABC法亲和素与生物素系统的操作流程
生物素、亲和素标记技术
适用：标记偏酸性的蛋白质、酶、DNA
三、亲和素及其理化性质 1 概念 2 分子式 3 结构特点 4 溶解特性 5 等电点 6 其它特性
1 概念： 亲和素(avidin)：是动物微生物中提 取的一种含10%碳水化合物的碱性糖蛋白。 链霉亲和素：是从链球菌属的菌培养 液中提取的一种蛋白质 2 分子量： A: 6.7KD SA: 6~6.5KD
3 结构特点： 每分子由四个亚基组成
4 溶解特性：溶于水，C=5mg/ml 5 等电点： A: PH=10.5 SA: PH= 6.0 6 比活性： A≥12u/mgP SA ≥14u/mgP
四、亲和素的活性及其测定 1 亲和素的活性：是表示亲和素结合生物 素的能力，即：ugB/mgA或ugB/mgSA。
2 活性测定： ⑴ 羟基偶氮苯-2-羧酸(HABA)法： A(SA) + HABA（红色） B A-B （出现黄色时B的量）
⑵ 分光光度法：
五、生物素标记物及亲和素标记物的制备：
1 生物素标记物的制备： B +Ab/Ag/E 交联剂
B-Ab/Ag/E
2 亲和素标记物的制备： A/SA+ Ab/Ag/ E 交联剂 A/SA-Ab/Ag/E
(在BNHS的B与羧基之间插入2分子的6-氨基己酸 ）
标记特点: (同BNHS) BCNHS中的羧基与蛋白质中的赖氨酸氨基 结合达到标记的目的 适用：(同BNHS) 标记Ab、酶、中性或偏碱 性的Ag、DNA
3 生物素酰肼(BHZ)：
制备：生物素 +水合肼 标记特点： BHZ与蛋白质中的醛基结合而标记
1 概念： 生物素(biotin)是动、植物体内广泛分布 的一种小分子生长因子，又名辅酶R或 维生素H。 2 分子式： C10H16O3N2S 分子量：244.31
临床免疫学：第十三章 生物素-链霉亲和素标记免疫技术
3、按BNHS：抗体1：8 ～1：15（体积比）混合， 室温搅拌下反应2 ～4小时；
4、装入透析袋，用0.05mol/L、pH7.2 PBS，4 ℃ 透析过夜；
5、结合物内加等体积甘油，小量分装，-20℃冻 存备用。
2、与其他标记物（如酶、荧光素、胶体金）结合制成 新的标记物。
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3、生物素标记抗体（IgG）的制备 基本原理 生物素N-羟基丁二酰亚胺酯（BNHS）分子酯键中的-
C=O基团可与蛋白质分子中的氨基在碱性条件下形成肽 键，从而使其标记上生物素。
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4、实验流程
1、用二甲基甲酰胺（DMF）将BNHS配成1mg/ml溶 液；
第三类是将亲和素与酶标生物素共温形成亲和素-生物素 -过氧化物酶复合物，再与生物素化的抗（抗）体接触， 将抗原-抗体反应体系与ABC标记体系连成一体，称为 ABC法。
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17第三节生物素和亲和素系统的技术方法一桥联亲和素生物素法bridgedavidinbiotintechnologybab法lymphocytebab法直接法检测原理示意图18二标记亲和素生物素法labelledavidinbiotintechlab间接法lab法直接法检测原理示意图20abc双抗体夹心elisa检测原理示意图三亲和素生物素化酶复合物法abcpapabc复合法检测原理示意图四酶抗酶亲和素生物素化酶复合物法papabc23第四节技术评价与应用领域1生物素b和亲和素a之间的高亲和力使反应试剂经得起高度稀释降低或避免了非特异性结合
的羧基经活化修饰 后形成的衍生物， 只有活化生物素才 能偶联各种其他生 物大分子，如蛋白 质、多糖、荧光素 等。
07 生物素-亲和素
特性：每个亚基都可结合1个生物素分子，即1个亲和素分子 可结合4个生物素分子。 亲和素可以和4个生物素分子亲密结合，这虽不属免疫反应， 但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。且由于 多种生物活性物质在生物素化后，其活性不会受到显著影响， 故而二者在结合反应时具有的多级放大作用。
注意事项：
选择活化生物素：依抗原或抗体分子所带可标记基 团的种类（氨基、醛基或巯基）以及分子的酸碱性；
控制生物素：蛋白质比例 生物素：IgG 用量比(mg/mg)宜为2:1，IgG应用浓度 0.5~5μg/ml；生物素1~3个/Ag，3~5个/Ab； 使用交联臂减少空间阻力
概念：是动物微生物中提取的一种含10%碳水化物的碱性糖 蛋白，可由蛋清中提取。 主要包括：卵白亲合素、链亲合素、卵黄亲合素及类亲合素 等。后两种因其特异性亲合力低，研究不多，前两种目前已 深入研究并得到广泛应用。 结构：4个相同亚基组成的四聚体糖蛋白，富含色氨酸，它 是与生物素结合的基团。
分子式：C10H16O3N2S 分子量：244.31 等电点：PH=3.5 溶解特性：难溶于水，易 溶于二甲基甲酰胺(DMF) 两个环状结构： I环（咪唑酮环）为与亲 和素结合的主要部位； II环（噻吩环）为结合抗 体和其它生物大分子的部 位，C2上戊酸侧链的未端 羧基是结合生物大分子的 唯一结构
Ag+B· Ab Ag-Ab· B
亲合素(A)
A
Ag-Ab· B-A
B· E
Ag-Ab· B-A-B· E
底物
酶标生物素
生物素化的抗体
+A
+A
BA法（标记亲和素-生物素法）
亲和素和生物素系统
链霉亲和素（streptavidin ）是一种从链霉菌培养物中提取的蛋白质，相对分子质量60000，且不含糖链。 此方法与ABC 法相比，不需A、B 两液提前混合，操作者容易掌握，稳定性高，由于采用了低等电点的链霉亲和素，其内源性生物素 干扰要低于ABC 法。 将亲和素与标记酶（HRP）结合，一个亲和素可结合多个HRP
链霉亲和素结合位点，可以和各种生物素标记抗体结合。
生物素（biotin ），也称维生素H，是一种分子质量为244Da 的小分子维生素。
避免了组织中的非特异性染色。 标记链霉亲和素-生物素法（Labelled streptavidin biotin ，LSAB）
同亲和素一样，链霉亲和素也具有4个生物素结合位点，亲和力高达10－15 mol/L，是一种更完美的生物素结合蛋白。 同亲和素一样，链霉亲和素也具有4个生物素结合位点，亲和力高达10－15 mol/L，是一种更完美的生物素结合蛋白。 同亲和素一样，链霉亲和素也具有4个生物素结合位点，亲和力高达10－15 mol/L，是一种更完美的生物素结合蛋白。 亲和细胞化学不同于免疫细胞化学，亲和细胞化学是利用两种物质之间的高度亲和能力而相互结合的化学反应。
• 抗体分子经生物素化后，其结合抗原的能 力不受损失，细胞经生物素化后仍能保持 正常的分裂、增殖能力，因此被用作抗体、 细胞的标ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ。
亲和素
• 亲和素（avidin）是一种分子质量为 68000Da的一种碱性糖蛋白。亲和素具有 与其他示综物质，如，荧光素、酶、胶体 金等，结合的能力。
• 生物素和亲和素之间有极强的亲和力，比 抗体对抗原的亲和力要高出100 万倍。
蛋白质浓度测定的方法及原理
蛋白质浓度是指在给定体积的溶液中所含有的蛋白质的量。
常用的蛋白质浓度测定方法包括比色法、生物素-亲和法和BCA法等。
1.比色法:
●原理：利用蛋白质与某种化学试剂发生反应后产生颜色，并通过测量溶液的吸光度
来推算蛋白质浓度。
常用的试剂有布拉德福德试剂、劳氏试剂和二酰肼试剂等。
●步骤：将待测样品与试剂混合后，在特定波长下测量吸光度，然后通过标准曲线或
计算公式来确定蛋白质浓度。
2.生物素-亲和法:
●原理：利用生物素-亲和素相互作用原理，通过检测生物素与亲和素的结合程度来
测定蛋白质浓度。
生物素可以与亲和素（如珠蛋白素）非常稳定地结合，并且该结
合可以被检测方法所测量。
●步骤：将待测样品中的蛋白质与生物素标记的亲和素结合，经过洗涤去除未结合物
质后，使用特定方法（如酶联免疫吸附法）测量结合的生物素含量，并通过标准曲
线或计算公式来确定蛋白质浓度。
3.BCA法（双硫键还原法）:
●原理：利用蛋白质中的还原性氨基酸（如半胱氨酸）与BCA试剂发生反应，在碱
性条件下生成紫色络合物，可以通过测量溶液的吸光度来推算蛋白质浓度。
●步骤：将待测样品与BCA试剂混合后，在适当温度下反应一段时间，然后通过测
量吸光度来确定蛋白质浓度，一般使用分光光度计进行测量。
这些方法都有其优缺点和适用范围，在选择蛋白质浓度测定方法时应根据实验目的和条件综合考虑。
主管检验师资格考试临床免疫学和免疫检验 复习习题 第十一章 生物素-亲和素放大技术(附答案解析)
主管检验师资格考试临床免疫学和免疫检验复习习题第十一章生物素-亲和素放大技术（附答案解析）一、A1型题1、每个亲和素能结合生物素分子的数目是（）A、4B、2C、1D、3E、82、以下关于生物素-亲和素系统（BAS）的说法错误的是（）A、1个亲和素分子可结合4个生物素分子B、1个生物素分子可以结合多个亲和素分子C、生物素易与抗体、酶、多聚核苷酸结合D、亲和素易与酶、铁蛋白、荧光素、核素结合E、亲和素和生物素.有极强的亲和力3、免疫组化技术的优点不包括（）A、高特异性B、高敏感性C、形态学的直观性D、精确定量分析E、能对抗原表达情况进行分析4、BAS在ELISA技术中应用最广泛的反应模式是（）A、ABAB、ABCC、BRABD、BAE、LAB5、免疫组化染色前，对标本进行固定的目的是（）A、保存组织细胞的抗原性B、防止细胞脱落C、防止细胞自溶D、终止胞内酶的活性E、使细胞内蛋白质凝固6、ABC-ELISA将酶标记在（）A、亲和素B、生物素C、抗体D、补体E、抗原7、关于亲和素-生物素系统的错误描述是（）A、用于间接包被B、用于终反应放大C、用于酶免疫测定D、用于胶体金测定E、不用于荧光免疫测定8、ABC-ELISA将酶标记在（）A、亲和素B、生物素C、抗体D、补体E、抗原9、关于生物素标记蛋白质的注意事项，下列说法错误的是（）A、根据抗原或抗体分子结构中所带可标记基团的种类以及分子的理化性质，选择相应的活化生物素和反应条件B、活化生物素与待标记抗原或抗体可以为任意比例C、在生物素与被标记物之间加入交联臂样结构可减少空间位阻影响D、生物素与抗原、抗体等蛋白质结合后，不影响后者的免疫活性E、生物素标记酶时会影响其免疫活性10、亲和素和生物素结合的特点是（）A、免疫反应B、不属于免疫反应C、特异性弱D、亲和力小E、不够稳定二、B型题1、 A.ABCBC.BABD.直接法BASE.间接法BAS<1> 、标记亲和素-生物素的方法为（）；<2> 、亲和素-生物素化酶复合物技术为（）；<3> 、生物素化第二抗体为（）；<4> 、生物素化第一抗体为（）。
abc elisa原理
abc elisa原理ABC ELISA原理ABC ELISA（Avidin-Biotin Complex Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种常用的酶联免疫吸附实验方法，用于检测特定抗原或抗体的存在。
该方法利用亲合性较高的生物素与亲合性较高的亲和素（例如抗体）结合，形成稳定的复合物，从而实现对目标分子的检测。
ABC ELISA的原理是基于酶标记的间接免疫法。
在实验中，首先将待测样品加入到酶标板孔中，使目标抗原或抗体与酶标抗体结合。
然后，通过一系列洗涤步骤去除未结合的物质，以减少背景信号的干扰。
接下来，加入生物素标记的二抗（biotinylated secondary antibody）。
生物素与亲和素（例如亲和素化酶标抗体）结合，形成稳定的复合物。
这样，目标分子就被生物素标记，便于后续的检测。
随后，加入辣根过氧化物酶标记的亲和素（例如辣根过氧化物酶标记的亲和素化酶标抗体）。
辣根过氧化物酶（HRP）能够与生物素结合，在酶标抗体的作用下，HRP会与基质反应产生显色产物。
加入底物溶液，通过底物与HRP的反应，产生可见的颜色变化。
根据颜色的强度可以判断样品中目标抗原或抗体的含量或活性。
ABC ELISA方法具有高灵敏度、高特异性和较低的背景信号，被广泛应用于医学、生物学和生物化学等领域。
它可以用于检测血清中的抗体水平、病毒或细菌感染的诊断以及药物研发等。
然而，ABC ELISA方法也存在一些限制。
首先，该方法需要多个步骤和试剂，操作较为繁琐，需要一定的实验技术。
其次，由于标记物的加入，可能会影响目标分子的结构和活性，造成检测结果的偏差。
此外，该方法对样品的处理和存储条件要求较高，以避免样品中其他物质的干扰。
ABC ELISA是一种常用的酶联免疫吸附实验方法，通过亲合素的结合和酶标记的作用，实现对特定抗原或抗体的检测。
该方法具有高灵敏度和高特异性，被广泛应用于生命科学研究和临床诊断中。
生物素-亲和素系统elisa法
生物素-亲和素系统ELISA法是一种基于生物素和亲和素之间高度特异性和高亲和力的免疫检测方法。
这种方法利用生物素和亲和素之间的结合反应，将抗原或抗体与生物素结合，再通过亲和素与生物素之间的结合反应，将抗原或抗体固定在固相载体上。
在ELISA中，生物素-亲和素系统可以用于提高检测的灵敏度和特异性。
首先，亲和素与生物素之间的结合反应非常稳定，可以减少非特异性结合，提高检测的特异性。
其次，每个亲和素可以结合4个生物素，使得反应信号放大，提高检测的灵敏度。
生物素-亲和素系统在ELISA中的应用有多种形式，包括用于固相化抗体或抗原的制备、用于ELISA终反应的放大等。
在固相化抗体或抗原的制备中，先将亲和素（或链霉亲和素）包被于固相载体，抗体或抗原也先与生物素结合，然后通过亲和素-生物素反应而使生物素化的抗体或抗原固相化。
在ELISA终反应的放大中，用生物素化的抗体替代常规ELISA中的酶标抗体，然后连接亲和素-酶结合物（BA-ELISA）、或亲和素及酶标生物京（BAB-ELISA）或ABC试剂（ABC-ELISA），从而使反应信号放大，提高检测灵敏度。
总之，生物素-亲和素系统ELISA法是一种灵敏度高、特异性好的免疫检测方法，可以用于各种抗原或抗体的检测。
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ABC法亲和素与生物素系统的操作流程
亲和素—生物素—过氧化物酶复合物法是许世明于1981年在BAB法和LAB法的基础上改良的，其特点是利用亲和素分别连接生物素标记的第二抗体和生物素标记的酶。
ABC法与LAB法、BAB法不同的是第一抗体不为生物素所标记，生物素标记的第二抗体与ABC复合物相连接，最后进行显色反应定位。
复合物是将过氧化物酶结合在生物素上，再将生物素—过氧化物酶连接物与过量的亲和素反应而制备的。
ABC法与LAB法、BAB法相比较具有敏感性高、特异性强、背景染色淡等优点。
ABC法染色流程如下。
(1)4um石蜡切片常规脱蜡至水，PBS洗3X3min。
(2)IHC的前处理视特异性一抗不同，可采用蛋白酶消化或热诱导的微波抗原修复(AR)，PBS洗3X3min。
(3)3％过氧化氢孵育10min(可省略)，以阻断内源性过氧化物酶活性。
(4)PBS洗3X3min。
(5)10％非免疫性动物血清孵育10min(可省略)，以减少非特异性背景，无需冲洗只需吸去多余血清。
(6)滴加适当稀释的第一抗体，37℃孵育60min或4℃过夜。
(7)PBS洗3X3min。
(8)滴加生物素标记的二抗，37℃孵育30～60min。
(9)PBS洗3X3min。
(10)滴加ABC复合物(提前30min，A液与B液等量混合)，37℃孵育30～60min。
(11)PBS洗3X3min。
(12)0．04％DAB(含0．03％H：02)显色5～10min。
(13)复染，脱水，常规树胶封固和结果观察。