生物素亲和素系统

生物素-亲和素系统
亲和素 链霉亲和素 生物素 生物素衍生物及配体连接 生物素亲和素系统的应用 链霉亲和素磁珠制备 链霉亲和素包被板制备 生物素连接抗原/抗体实验 生物素—链霉亲和素系统在项目的试验
郑州安图生物 2008年
亲和素(Avidin)
一、来源： 亲和素主要存在于鸡蛋清中，可通过离子交换和分子筛方法提 纯，从1L蛋清中可提取纯亲和素15-25mg。亲和素可以在PH 5-7的高盐 缓冲液中结晶出来，但没有报道在等电点附近的缓冲液中可以结晶析出。
三、活性：SA 和AV 的活性都是结合生物素的量来表示，1mg蛋白结合生物 素的微克数就是该蛋白的活性单位。从分子量计算，AV的最高活性是 15u，完整SA是14u，核心SA 的分子量较低，最高活性可达l8u，但由于 1分子蛋白都结合4分子生物素，故它们的应用效果相同。
AV的活性基团是肽链中的4个色氨酸残基，SA 的活性基团也是肽链中的色 氨酸残基，当用对色氨酸特异的Koshlands试剂处理后，SA就丧失了和生 物素结合的能力。最近实验又显示，酪氨酸残基对蛋白的活性也有作用， AV的每条肽链中只有一个酪氨酸残基(Tyr)，硝基苯磺酰氟(Nbs-F)只要平 均修饰它的0.5个Tyr，就可使其完全失去活性。SA的每条肽链中含6个Tyr 残基， Nbs-F也修饰其中的一半即3个可便SA失去结合生物素活性。 四：等电点： PH= 6.0
温度、盐的影响：游离亲和素在85℃就会失活，但是生物素-亲和素复合物可 在短时间内耐受132 ℃的高温。生物素-亲和素复合物对热的耐受能力依赖于 盐的存在，在没有盐存在时， 100 ℃10分钟约有88%的生物素-亲和素复合物 解离，但在有盐存在的条件下，需120 ℃15分钟复合物才能完全解离。
PH、变性剂影响：生物素-亲和素复合物在PH 2-13或8M盐酸胍（中性）条件 下不会受到影响，并可以用硫酸锌沉淀，但是沉淀出的复合物用70%蚁酸处 理1小时会使亲和素不可逆失活。
二、分子量：亲和素由四个相同的亚单位组成，每个亚单位的肽链中有128个 氨基酸残基，其中每条肽链含4个甘露糖，3个氨基葡糖，含糖量达1O%。 每个亚单位的分子量约为15600，整个亲和素分子的分子量66000-69000。
三、亲和力：亲和素的每个亚单位可结合一个生物素分子，即一个AV可结合4 个生物素分子，二者之间的亲和力极强，亲和素常数（Ka）为10^15Ｌ
／ mol，比抗原与抗体间的亲和力（Ka＝10^5～11L／mol）至少高1万 倍，因此二者பைடு நூலகம்结合特异性高和稳定性好。1mg纯的亲和素的活性约为 13—15U。
三、等电点： PH= 10.5
四、活性基团：亲和素对官能团的修饰不敏感，对其20%的羧基基团进行脂 化和59%的氨基基团进行酰胺化都不会影响其与生物素的结合。但是当 对色氨酸和赖氨酸残基进行修饰时会显著影响其与生物素的结合活性。 即使用对色氨酸特异性的2-hydroxy-5-nitrophenyl bromide试剂对亲和 素每个亚基上的一个色氨酸氧化，亲和素就完全丧失了与生物素的结合 能力。赖氨酸对亲和素与生物素的结合也起着重要作用，氨基特异性试剂 2，4二硝基氟苯与游离亲和素的反应较结合生物素的亲和素反应速度快说 明了这一点。当每个亲和素亚基上引入二硝基基团后，亲和素的活性就会 消失，证明亲和素亚基上的3个赖氨酸残基可能在生物素的结合位点。但是 像三硝基氟苯和丹磺酰氯由于不易接近生物素的结合位点附近的赖氨酸残 基因此不会对亲和素的活性造成影响。
二、分子量：一条完整的SA肽链中有159个氨基酸残基，其中甘、丙氨基酸 含量较大，且又不含任何糖基，分子量为16450。SA 在培养过程中受蛋 白酶的作用，肽链可从N端的lO～l2位和G末端19-21位处断裂，使每条 肽链只含125-127个氨基酸残基，分子量降为13O96～13254，此即核心 SA，核心SA的分子量约54KD。后者的每条肽链仍可结合一个生物素分 子， 即一个完整的核心SA 仍可结合4个生物素分子。
在ELISA 中的应用： 由于SA 的等电点低，表面带的正电荷少，因 此它和聚苯乙烯板载体的静电吸附力弱，SA的阴性对照显色明显比 AV低，这样在ELIsA 上应用SA 可进一步提高方法的灵敏度。
链霉亲和素（SA）结构图
亲和素与链霉亲和素的比较
相同点： 1、生物素结合能力： AV:13-15U, SA:14-18U 2、活性中心依赖于色氨酸-赖氨酸： 亲和素在氨基酸序列的70-70和110-111 两个位点含有色氨酸-赖氨酸，链霉亲和素在氨基酸序列的79-80和120-121两 个位点含有色氨酸-赖氨酸，但是亲和素较链霉亲和素更易于被N-溴代琥珀酰 亚胺氧化。
表面活性剂影响：C14 标记的亲和素与固相生物素的结合不受1% SDS, Tween 20, Tween 40, Triton X-100和两性表面活性剂的影响。而生物素化蛋白与固 相亲和素的结合会受这些表面活性剂的影响而减弱，易于解离。因此将生物素 化蛋白从固相亲和素上解离使用SDS和高温（95.6）即可。暗示亲和素与生物 素化分子的结合会受表面活性剂的影响而降低。
七、亲和素与生物素结合的随机性：尽管亲和素与生物素结合时需要亲和素亚基间 的相互作用，但是多种实验证据表明亲和素与生物素的结合是随机的，即当一个亚 基结合生物素后不会对其他亚基与生物素的结合造成影响，而链霉亲和素与生物素 的结合具有协同效应。
链霉亲和素(Streptavidin)
一、来源：链霉亲和素是Streptomyces avidinii菌培养过程中的分泌产 物，主要通过2一亚氨基生物素亲和层析法提纯，1L培养液中含蛋白 10-60mg；目前也有基因重组技术表达的链霉亲和素。
五、稳定性：亲和素对6M尿素和3M盐酸胍有耐受性，当盐酸胍浓度至3.5M时 其生物素结合能力下降，至6M时四聚体降解为单体，但是当盐酸胍浓度再 降低至3M时其结合生物素的能力又能恢复。亲和素与生物素的结合能力很 强，在8M盐酸胍PH1.5条件下，亲和素与生物素可以完全解离。
六、亲和素-生物素复合物稳定性：生物素-亲和素是已知的蛋白和配体间非共 价结合的最强作用力（Ka=10^15M-L)，生物素和亲和素间的结合很迅速， 而且一旦结合，不易受PH，温度，有机溶剂及蛋白酶的影响。