高效液相色谱分析哈尔滨商业大学电子课件
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《高效液相色谱法》课件
– 分离机理：组分分子与流动相分子竞争吸附剂表面 活性中心
– 固定相：硅胶 – 流动相：底剂（烷烃）+ 极性调节剂
– 出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱
3.2 液液分配色谱法 – 分离机制：利用组分在两相中分配系数的差异 – 分类:
正相色谱 • 固定液极性 > 流动相极性 NPLC • 极性小的组分先出柱，极性大
➢ 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站 ➢ 检测器:
紫外检测器 荧光检测器 蒸发光散射检测器 其它检测器
• 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站 Agilent 1100紫外检测器工作原理
色谱－光谱图
波长(nm)
T/min
• 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站
WATERS
WATERS
– 分离机制：定向作用力、诱导作用力、或氢键作用 力的差别
– 固定相：极性大的氰基或氨基键合相 – 流动相：极性小的底剂（烷烃）+ 极性调节剂
– 流动相极性与k的关系： 流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓ 结构相近组分，极性大的组分后出柱
3.3 化学键合相色谱法 3.3.3 离子对色谱法（IPC，PIC）
– 适用范围：3.0≤pKa≤7.0 的弱酸 7.0≤pKa≤8.0 的弱碱
– 抑制剂: Biblioteka 酸（HAc）、弱碱（NH3·H2O）或缓冲液
4. 固定相
4.1 液-固色谱固定相 – 硅胶 无定形全多孔硅胶 球形全多孔硅胶
YWG YQG
– 高分子多孔微球
YSG
特点：柱选择性好，峰形好，柱效低
4.2 化学键合相 特点： – 不易流失；热稳定性好；化学性能稳定 – 载样量大；适于梯度洗脱
– 固定相：硅胶 – 流动相：底剂（烷烃）+ 极性调节剂
– 出柱顺序：强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱
3.2 液液分配色谱法 – 分离机制：利用组分在两相中分配系数的差异 – 分类:
正相色谱 • 固定液极性 > 流动相极性 NPLC • 极性小的组分先出柱，极性大
➢ 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站 ➢ 检测器:
紫外检测器 荧光检测器 蒸发光散射检测器 其它检测器
• 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站 Agilent 1100紫外检测器工作原理
色谱－光谱图
波长(nm)
T/min
• 输液泵→进样器→色谱柱→检测器→工作站
WATERS
WATERS
– 分离机制：定向作用力、诱导作用力、或氢键作用 力的差别
– 固定相：极性大的氰基或氨基键合相 – 流动相：极性小的底剂（烷烃）+ 极性调节剂
– 流动相极性与k的关系： 流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓ 结构相近组分，极性大的组分后出柱
3.3 化学键合相色谱法 3.3.3 离子对色谱法（IPC，PIC）
– 适用范围：3.0≤pKa≤7.0 的弱酸 7.0≤pKa≤8.0 的弱碱
– 抑制剂: Biblioteka 酸（HAc）、弱碱（NH3·H2O）或缓冲液
4. 固定相
4.1 液-固色谱固定相 – 硅胶 无定形全多孔硅胶 球形全多孔硅胶
YWG YQG
– 高分子多孔微球
YSG
特点：柱选择性好，峰形好，柱效低
4.2 化学键合相 特点： – 不易流失；热稳定性好；化学性能稳定 – 载样量大；适于梯度洗脱
高效液相色谱法(HPLC) ppt课件
此法在杂环类药物的鉴别实验中有广泛应用。
ppt课件
32
流动相选择该注意的几点问题
1、尽量使用高纯度试剂做流动相，防止微 量杂质长期积聚而损坏色谱柱；
2、避免流动相与固定相发生相互作用而使 柱效下降或损坏柱子；
3、试样在流动相中应有适宜的溶解度，防 止产生沉淀并在柱中沉积；
4、流动相同时还应满足检测器的需求。
高效液相色谱法 （HPLC）
ppt课件
1
色谱法定义
• 色谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理分 离技术，将它用于分析化学并配合适当的检测 手段，就成为色谱分析法。
• 色谱法中，流动相可以是气体，也可以是液体， 由此可分为气相色谱法（GC）和液相色谱法 （LC）。固定相既可以是固体，也可以是涂在 固体上的液体，由此又可将气相色谱法和液相 色谱法分为气-液色谱、气-固色谱、液-固色谱、 液-液色谱。
阳离子交换：R—SO3H +M+ = R—SO3 M + H + 阴离子交换：R—NR4OH +X- = R—NR4 X + OH固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；
流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液 ；
阳离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；
应用：离子及可离解的化合物、氨基酸、核酸等。
而ＨＰＬＣ改变的是流动相极性，使样品各组分
在最佳条件下得以分离。
ppt课件
10
四、液相色谱分析法的原理
• （二）高效液相色谱的分离过程 •
• 同其他色谱过程一样，ＨＰＬＣ也是溶质在固 定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。 它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或 分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶 质得以分离。
ppt课件
32
流动相选择该注意的几点问题
1、尽量使用高纯度试剂做流动相，防止微 量杂质长期积聚而损坏色谱柱；
2、避免流动相与固定相发生相互作用而使 柱效下降或损坏柱子；
3、试样在流动相中应有适宜的溶解度，防 止产生沉淀并在柱中沉积；
4、流动相同时还应满足检测器的需求。
高效液相色谱法 （HPLC）
ppt课件
1
色谱法定义
• 色谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理分 离技术，将它用于分析化学并配合适当的检测 手段，就成为色谱分析法。
• 色谱法中，流动相可以是气体，也可以是液体， 由此可分为气相色谱法（GC）和液相色谱法 （LC）。固定相既可以是固体，也可以是涂在 固体上的液体，由此又可将气相色谱法和液相 色谱法分为气-液色谱、气-固色谱、液-固色谱、 液-液色谱。
阳离子交换：R—SO3H +M+ = R—SO3 M + H + 阴离子交换：R—NR4OH +X- = R—NR4 X + OH固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；
流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液 ；
阳离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；
应用：离子及可离解的化合物、氨基酸、核酸等。
而ＨＰＬＣ改变的是流动相极性，使样品各组分
在最佳条件下得以分离。
ppt课件
10
四、液相色谱分析法的原理
• （二）高效液相色谱的分离过程 •
• 同其他色谱过程一样，ＨＰＬＣ也是溶质在固 定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。 它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或 分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶 质得以分离。
高效液相色谱分析法剖析课件
原理
通过高压泵将流动相（溶剂）泵入装有固定相（填料）的色 谱柱，当不同组分的混合物经过色谱柱时，由于在固定相和 流动相之间的分配系数不同，导致不同的组分以不同的速度 通过色谱柱，从而实现各组分的分离。
高效液相色谱法的应用领域
药物分析
用于药物的分离、纯化 和含量测定，以及药物
代谢产物的分析。
食品安全
THANKS
感谢观看
03
土壤中农药残留分 析
高效液相色谱法能够检测土壤中 残留的农药成分，为土壤污染治 理提供依据。
生物样品分析
生物体内药物浓度测定
通过高效液相色谱法，可以测定生物 体内药物的浓度，有助于临床用药的
指导和疗效评估。
生物体内代谢产物分析
高效液相色谱法能够检测生物体在代 谢过程中产生的代谢产物，有助于了
解生物体的生理和生化过程。
建立色谱条件
选择色谱柱
根据待测物的性质选择合适的色谱柱类型和规格。
确定流动相
根据待测物的性质确定合适的流动相组成，包括溶剂、比例、pH 值等。
设置检测器
根据待测物的性质选择合适的检测器类型，如紫外可见光检测器、 荧光检测器等。
进样分析
样品进样
将处理好的样品按照规定的进样量注入色谱柱。
洗脱分离
通过流动相的洗脱作用，使待测物在色谱柱上分离成单个组分。
02
高效液相色谱系统的组成
色谱柱
01
02
03
功能
色谱柱是高效液相色谱系 统的核心部件，用于分离 样品中的不同组分。
类型
常用的色谱柱有硅胶、氧 化铝、活性炭、聚合物等 材质，根据不同的分离需 求选择合适的色谱柱。
性能指标
色谱柱的性能指标包括粒 径、孔径、柱长、柱内径 等，这些参数直接影响分 离效果和分离时间。
通过高压泵将流动相（溶剂）泵入装有固定相（填料）的色 谱柱，当不同组分的混合物经过色谱柱时，由于在固定相和 流动相之间的分配系数不同，导致不同的组分以不同的速度 通过色谱柱，从而实现各组分的分离。
高效液相色谱法的应用领域
药物分析
用于药物的分离、纯化 和含量测定，以及药物
代谢产物的分析。
食品安全
THANKS
感谢观看
03
土壤中农药残留分 析
高效液相色谱法能够检测土壤中 残留的农药成分，为土壤污染治 理提供依据。
生物样品分析
生物体内药物浓度测定
通过高效液相色谱法，可以测定生物 体内药物的浓度，有助于临床用药的
指导和疗效评估。
生物体内代谢产物分析
高效液相色谱法能够检测生物体在代 谢过程中产生的代谢产物，有助于了
解生物体的生理和生化过程。
建立色谱条件
选择色谱柱
根据待测物的性质选择合适的色谱柱类型和规格。
确定流动相
根据待测物的性质确定合适的流动相组成，包括溶剂、比例、pH 值等。
设置检测器
根据待测物的性质选择合适的检测器类型，如紫外可见光检测器、 荧光检测器等。
进样分析
样品进样
将处理好的样品按照规定的进样量注入色谱柱。
洗脱分离
通过流动相的洗脱作用，使待测物在色谱柱上分离成单个组分。
02
高效液相色谱系统的组成
色谱柱
01
02
03
功能
色谱柱是高效液相色谱系 统的核心部件，用于分离 样品中的不同组分。
类型
常用的色谱柱有硅胶、氧 化铝、活性炭、聚合物等 材质，根据不同的分离需 求选择合适的色谱柱。
性能指标
色谱柱的性能指标包括粒 径、孔径、柱长、柱内径 等，这些参数直接影响分 离效果和分离时间。
高效液相色谱分析 教学PPT课件
四、离子交换色谱
此法是利用离子交换原理和液相色谱技术相结 合，测定各类阴、阳离子的分离分析方法。它既 适于无机离子，也适于有机物分离，如蛋白质、 氨基酸、核酸等。
1. 原理：利用不同待测离子对固定相的亲和能力 （或离子交换能力）的差别来实现分离的。
阳离子交换: R - SO-3H M R SO-3M H
从速率理论各项的差别看HPLC与GC的区别
H A B Cu u
1）涡流扩散项A 2）分子扩散项 B/u
A=2dp B=2Dl
3）传质阻力项
包括固定相传质阻力系数和流动相传质阻力系数
Hs
Cs df2 Ds
u
Hm
Cm
d
2 p
Dm
u
Hsm
Csm d p2 Dm
u
改进固定相成为提高液相色谱柱效的一个重要问题
惰性核
薄膜型
表面多孔型
四、排阻色谱法固定相
• 软质凝胶：水为流动相，孔径大小由交联剂控制 • 半硬质凝胶：适用于非极性有机溶剂，不能随意 更换溶剂，能耐较高压力，流速不宜大
• 硬质凝胶：多孔硅胶、多孔玻珠；多孔硅胶化学 稳定性好，热稳定性好，机械强度高，吸附问题需 要进行特殊处理。
• 选择填料时首先要考虑相对分子质量排阻极限
三、离子对色谱法（IPC）
主要用来分离强极性有机酸和有机碱。
原理：将与待测物离子A电荷相反的离子B（称为 对离子或反离子）加入到流动相中，使待测离子 与对离子形成离子对AB，该AB离子对的性质与A 离子或B离子的性质不同，即间接改变了待测离子 的保留特性。
还可借助离子对的生成给试样引入紫外吸收活发 荧光的基团，以提高检测的灵敏度。
早期通过在担体上涂渍一薄层固定液制备固定 相, 现多为化学键合固定相（通过化学反应将有机 分子键合在载体表面所形成的柱填充剂，具有稳定、 流失小、适于梯度淋洗等特点 ）。
《高效液相色谱分析》课件
器等。
检测参数设置
根据实验条件和检测器 类型，设置合理的检测
参数。
数据处理与分析
数据留时间 和峰面积等信息。
定性分析
根据已知标准品和保留时间等信息，对未知 样品进行定性分析。
数据清洗
对采集的数据进行清洗和整理，去除异常值 和噪声数据。
定量分析
利用峰面积法等手段，对未知样品进行定量 分析，计算样品中各组分的含量。
通过高效液相色谱法分析药物在体内的代谢产物，有助于了解药 物的作用机制和代谢途径。
药物含量测定
高效液相色谱法可用于药物的含量测定，确保药物的有效性和安 全性。
在食品分析中的应用
食品添加剂检测
高效液相色谱法可用于检 测食品中的防腐剂、色素 等添加剂，保障食品安全 。
营养成分分析
通过高效液相色谱法分析 食品中的维生素、矿物质 等营养成分，有助于了解 食品的营养价值。
01
选择合适的流动相
根据实验要求，选择适当的流动相 ，如甲醇、乙腈、水等。
流动相的配置
按照实验所需的浓度和比例，将流 动相混合。
03
02
流动相的纯化
确保流动相的纯度，必要时进行脱 气和过滤处理。
更换流动相
根据需要更换流动相，确保实验结 果的准确性和可靠性。
04
检测波长的选择
1 2
选择合适的检测波长
在化学领域中，高效液相色谱法可用于分离有机化合物、 分析混合物中的组分等；在生物学领域中，可应用于蛋白 质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
在医学领域中，高效液相色谱法可用于药物分析、临床检 验、毒物分析等；在环境科学领域中，可应用于水质检测 、土壤中污染物的分析等。
CHAPTER 02
高效液相色谱仪的组成
检测参数设置
根据实验条件和检测器 类型，设置合理的检测
参数。
数据处理与分析
数据留时间 和峰面积等信息。
定性分析
根据已知标准品和保留时间等信息，对未知 样品进行定性分析。
数据清洗
对采集的数据进行清洗和整理，去除异常值 和噪声数据。
定量分析
利用峰面积法等手段，对未知样品进行定量 分析，计算样品中各组分的含量。
通过高效液相色谱法分析药物在体内的代谢产物，有助于了解药 物的作用机制和代谢途径。
药物含量测定
高效液相色谱法可用于药物的含量测定，确保药物的有效性和安 全性。
在食品分析中的应用
食品添加剂检测
高效液相色谱法可用于检 测食品中的防腐剂、色素 等添加剂，保障食品安全 。
营养成分分析
通过高效液相色谱法分析 食品中的维生素、矿物质 等营养成分，有助于了解 食品的营养价值。
01
选择合适的流动相
根据实验要求，选择适当的流动相 ，如甲醇、乙腈、水等。
流动相的配置
按照实验所需的浓度和比例，将流 动相混合。
03
02
流动相的纯化
确保流动相的纯度，必要时进行脱 气和过滤处理。
更换流动相
根据需要更换流动相，确保实验结 果的准确性和可靠性。
04
检测波长的选择
1 2
选择合适的检测波长
在化学领域中，高效液相色谱法可用于分离有机化合物、 分析混合物中的组分等；在生物学领域中，可应用于蛋白 质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
在医学领域中，高效液相色谱法可用于药物分析、临床检 验、毒物分析等；在环境科学领域中，可应用于水质检测 、土壤中污染物的分析等。
CHAPTER 02
高效液相色谱仪的组成
《高效液相色谱仪》课件
《高效液相色谱仪》ppt课件
目 录
• 高效液相色谱仪简介 • 高效液相色谱仪的组成和工作原理 • 高效液相色谱仪的操作流程 • 高效液相色谱仪的维护与保养 • 高效液相色谱仪的实验技术与应用实例
01
高效液相色谱仪简介
定义与特点
定义
高效液相色谱仪是一种分离和分 析复杂混合物中各组分的仪器， 基于物质在固定相和流动相之间 的分配差异实现分离。
。
食品工业
用于检测食品中的添加剂、农 药残留和营养成分等。
高效液相色谱仪的发展历程
起源
20世纪50年代初，基于经典液 相柱色谱的原理，开发出了高
效液相色谱法。
发展
20世纪60年代，出现了填充柱 和柱切换技术，提高了分离效 率。
革新
20世纪70年代，出现了高效微 粒固定相和新型检测器，提高 了灵敏度和选择性。
流动相的纯化和过滤
确保流动相的纯度和清洁度，以避免对色谱柱和检测器造成污染。
流动相的脱气
使用真空脱气法或超声波脱气法去除流动相中的气泡，以避免对色 谱分离造成干扰。
色谱柱的安装与选择
安装色谱柱
按照仪器说明书正确安装色谱柱 ，确保密封性和稳定性。
色谱柱的选择
根据样品的性质和分离要求，选择 合适的色谱柱类型和规格。
检测器对流出的组分进行 检测，并将信号记录下来 ，形成色谱图。
高效液相色谱仪的分离原理
分配原理
组分在固定相和流动相之 间的分配平衡是实现物质 分离的基础。
吸附与解吸平衡
组分在固定相上的吸附与 流动相中的溶解度差异导 致分离。
分子间作用力
分子间的相互作用力（如 范德华力、氢键等）影响 组分的吸附与解吸平衡。
物的分子结构和化学键信息。
目 录
• 高效液相色谱仪简介 • 高效液相色谱仪的组成和工作原理 • 高效液相色谱仪的操作流程 • 高效液相色谱仪的维护与保养 • 高效液相色谱仪的实验技术与应用实例
01
高效液相色谱仪简介
定义与特点
定义
高效液相色谱仪是一种分离和分 析复杂混合物中各组分的仪器， 基于物质在固定相和流动相之间 的分配差异实现分离。
。
食品工业
用于检测食品中的添加剂、农 药残留和营养成分等。
高效液相色谱仪的发展历程
起源
20世纪50年代初，基于经典液 相柱色谱的原理，开发出了高
效液相色谱法。
发展
20世纪60年代，出现了填充柱 和柱切换技术，提高了分离效 率。
革新
20世纪70年代，出现了高效微 粒固定相和新型检测器，提高 了灵敏度和选择性。
流动相的纯化和过滤
确保流动相的纯度和清洁度，以避免对色谱柱和检测器造成污染。
流动相的脱气
使用真空脱气法或超声波脱气法去除流动相中的气泡，以避免对色 谱分离造成干扰。
色谱柱的安装与选择
安装色谱柱
按照仪器说明书正确安装色谱柱 ，确保密封性和稳定性。
色谱柱的选择
根据样品的性质和分离要求，选择 合适的色谱柱类型和规格。
检测器对流出的组分进行 检测，并将信号记录下来 ，形成色谱图。
高效液相色谱仪的分离原理
分配原理
组分在固定相和流动相之 间的分配平衡是实现物质 分离的基础。
吸附与解吸平衡
组分在固定相上的吸附与 流动相中的溶解度差异导 致分离。
分子间作用力
分子间的相互作用力（如 范德华力、氢键等）影响 组分的吸附与解吸平衡。
物的分子结构和化学键信息。
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（2）离子交换键合固定相 薄壳键合型；微粒硅胶键 合型（键合离子交换基团）
树脂类别：
原理：利用生物大分子和固定 相表面存在的某种特异性亲和 力，进行选择性分离。
先在载体表面键合上一种 具有一般反应性能的所谓间隔 臂(环氧、联胺等)，再连接上配 基(酶、抗原等)，这种固载化的 配基将只能和具有亲和力特性 吸附的生物大分子作用而被保 留。改变淋洗液后洗脱。
高效液相色谱分析哈尔滨商业大学 电子课件
（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。
高效液相色谱分析哈尔滨商业大学 电子课件
三、离子交换色谱（ion-exchange
chromatography）
固 定 相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂； 流 动 相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离
子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液； 基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换
第三节 固定相与流动相
一、液相色谱固定相（stationary phases of LC）
1. 液-液分配及离子对分离固定相
（1）全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用 100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多 见；现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；
（2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体）30～
40μm的玻璃微球，表面附着一层 厚度为1 ～ 2μm的多孔硅胶。
表面积小，柱容量底；
高效液相色谱分析哈尔滨商业大学 电子课件
（3）化学键合固定相
化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C
固 定 相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～ 10μm的硅胶吸附剂。
流 动 相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；
适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有 官能团的化合物和异构体有较高选择性。 缺 点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾。
高效液相色谱分析哈尔滨商业大学 电子课件
Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离 子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+X 后；在两相间分配。
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六、排阻色谱色谱
（size- exclusion chromatography）
固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)； 原 理：按分子大小分离。小分子可以扩散
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2、液-固吸附分离固定相
种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等； 结构类型：全多孔型和薄壳型； 粒度：5～10 μm。
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3.离子交换色谱分离固定相
结构类别：
（1）薄壳型离子交换树脂 薄壳玻璃珠为担体，表面 涂约1%的离子交换树脂；
第八章 高效液相色谱分析
高效液相色谱分析哈尔滨商业大学 电子课件
第一节 特点与分类
一、特点：
高压、高效、高速、高沸点、热不稳定有机及生化 试样的高效分离分析方法。
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第二节 高效液相色谱法的主要类型及基本原理
一、液-固吸附色谱（liquid-solid adsorption chromatography）
稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广； c. 硅碳键型： ≡Si—C d. பைடு நூலகம்氮键型： ≡Si—N
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化学键合固定相的特点
1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快； 2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击； 3）耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定； 4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性； 5）有利于梯度洗脱； 存在着双重分离机制： (键合基团的覆盖率决定分 离机理) 高覆盖率：分配为主； 低覆盖率：吸附为主；
原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子 或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水 性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配；
阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十 六烷基三甲铵作为对离子；
阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子； 反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子
二、液-液分配色谱（liquid- liquid partition chromatography）
固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流 动 相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极
性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之，流 动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。 正相与反相的出峰顺序相反； 固 定 相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用； 化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶
剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。 亲和力大，保留时间长； 阳离子交换：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+ 阴离子交换：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH应 用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。
高效液相色谱分析哈尔滨商业大学 电子课件
四、离子色谱（ion chromatography）
到凝胶空隙，由其中通过，出峰 最慢；中等分子只能通过部分凝 胶空隙，中速通过；而大分子被 排斥在外，出峰最快；溶剂分子 小，故在最后出峰。 全部在死体积前出峰；可对相对分子质 量在100-105范围内的化合物按质量分离。
高效液相色谱分析哈尔滨商业大学 电子课件
七、亲和色谱（Affinity chromatograph）
离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一中技术， 其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换 容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和 电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。
有关内容将在第十章第六节中讲授。
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五、离子对色谱（ion pair chromatography）
树脂类别：
原理：利用生物大分子和固定 相表面存在的某种特异性亲和 力，进行选择性分离。
先在载体表面键合上一种 具有一般反应性能的所谓间隔 臂(环氧、联胺等)，再连接上配 基(酶、抗原等)，这种固载化的 配基将只能和具有亲和力特性 吸附的生物大分子作用而被保 留。改变淋洗液后洗脱。
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（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。
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三、离子交换色谱（ion-exchange
chromatography）
固 定 相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂； 流 动 相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离
子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液； 基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换
第三节 固定相与流动相
一、液相色谱固定相（stationary phases of LC）
1. 液-液分配及离子对分离固定相
（1）全多孔型担体 由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用 100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多 见；现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；
（2）表面多孔型担体 （薄壳型微珠担体）30～
40μm的玻璃微球，表面附着一层 厚度为1 ～ 2μm的多孔硅胶。
表面积小，柱容量底；
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（3）化学键合固定相
化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C
固 定 相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～ 10μm的硅胶吸附剂。
流 动 相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；
适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有 官能团的化合物和异构体有较高选择性。 缺 点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾。
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Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离 子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+X 后；在两相间分配。
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六、排阻色谱色谱
（size- exclusion chromatography）
固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)； 原 理：按分子大小分离。小分子可以扩散
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2、液-固吸附分离固定相
种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等； 结构类型：全多孔型和薄壳型； 粒度：5～10 μm。
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3.离子交换色谱分离固定相
结构类别：
（1）薄壳型离子交换树脂 薄壳玻璃珠为担体，表面 涂约1%的离子交换树脂；
第八章 高效液相色谱分析
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第一节 特点与分类
一、特点：
高压、高效、高速、高沸点、热不稳定有机及生化 试样的高效分离分析方法。
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第二节 高效液相色谱法的主要类型及基本原理
一、液-固吸附色谱（liquid-solid adsorption chromatography）
稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广； c. 硅碳键型： ≡Si—C d. பைடு நூலகம்氮键型： ≡Si—N
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化学键合固定相的特点
1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快； 2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击； 3）耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定； 4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性； 5）有利于梯度洗脱； 存在着双重分离机制： (键合基团的覆盖率决定分 离机理) 高覆盖率：分配为主； 低覆盖率：吸附为主；
原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子 或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水 性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配；
阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十 六烷基三甲铵作为对离子；
阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子； 反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子
二、液-液分配色谱（liquid- liquid partition chromatography）
固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流 动 相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极
性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之，流 动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。 正相与反相的出峰顺序相反； 固 定 相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用； 化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶
剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。 亲和力大，保留时间长； 阳离子交换：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+ 阴离子交换：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH应 用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。
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四、离子色谱（ion chromatography）
到凝胶空隙，由其中通过，出峰 最慢；中等分子只能通过部分凝 胶空隙，中速通过；而大分子被 排斥在外，出峰最快；溶剂分子 小，故在最后出峰。 全部在死体积前出峰；可对相对分子质 量在100-105范围内的化合物按质量分离。
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七、亲和色谱（Affinity chromatograph）
离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一中技术， 其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换 容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和 电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。
有关内容将在第十章第六节中讲授。
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五、离子对色谱（ion pair chromatography）