酶学

利用伴刀豆球蛋白与葡萄糖氧化酶糖链间的特 异生物亲和力实现葡萄糖氧化酶的定向固定化, 操作简单,并且固定化过程中交联剂不直接与酶 分子接触, 避免了交联剂对酶分子造成的化学损 伤, 无必需氨基酸残基参与共价结合, 因此相对 于非定向固定化具有明显的优点。
5、固定化酶的性质
5.1 酶的最适温度
由图4 可见, 温度对溶液酶的活力影响较大。游 离酶最适温度为3 7 ℃ , 升高温度, 游离酶的活 力迅速下降。定向固定化葡萄糖氧化酶及非定 向固定化酶的最适温度是5 7 ℃ , 另外温度升 高, 定向固定化酶活力下降较慢, 所以定向固定 化葡萄糖氧化酶能耐受较高的温度。
Enzyme
姓名：廖丽莎 班级：食科三班 学号：20083573
定向固定化葡萄糖氧化酶及其酶学性质的研究
——食品科学 2009.Vol. 30, No. 01
葡萄糖氧化酶概述 酶的定向固定化及方法 葡萄糖氧化酶的定向固定化 影响固定化酶活力的因素 固定化酶的性质 结论
1、葡萄糖氧化酶的简介
戊二醛是固定化酶常用的双功能试剂, 一方面起 着连接酶和载体的作用, 但另一方面戊二醛本身 对酶会造成化学损伤降低酶活性, 其用量是影响 固定化酶活性的重要因素之一, 只有用适当浓度 的戊二醛作为交联剂,才能获得较高活力的固定化 酶由图1 可见, 戊二醛浓度增加, 固定化酶的活力 随之升高, 当戊二醛浓度达到0 . 1% 时, 固定化酶 活力达到最大。
4. 1. 3 酶浓度对固定化酶活力的影响
• 0 .1% 浓度的戊二醛交联后的壳聚糖膜与 0.02m g/m l p H 7 的ConA 交联17h , 然后 将微球浸于0. 01 ~ 0 . l mg/m l 范围内不同 浓度的酶溶液中1 7 h ,制备定向固定化酶。 测定固定化酶活力, 结果见图3 。
4. 1. 2 伴刀豆球蛋白浓度对固定化酶活力的影响
用0.1% 浓度的戊二醛交联后的壳聚糖膜与 0 .01 ~0 .l m g/ m l 范围内不同浓度的p H 7 的ConA 交联17h , 然后将膜浸于l m g/ m l 的酶溶液1 7 h , 制备定向固定化酶,测定固 定化酶活力, 结果见图2.
由图3 可见, 随着酶液的浓度的增加, 固定 化酶的活力不断的增加。当酶浓度达到 0.08 mg/ml 时, 酶的活力达到最高值。这 可能是酶浓度较少时, 固定在微球上的酶 量也较少, 固定化酶的活力较低; 但酶量过 大时,使酶分子相互之间空间重叠, 造成酶 活性中心空间结构发生变化, 从而使酶的 表观活力下降。为了使制备的固定化酶的 活力较大,采用0 . 08 m g/m l 比较合适。
（2）葡萄糖氧化酶定向固定化: 壳聚糖膜与一定 浓度的戊二醛溶液交联Z h , 用去离子水洗涤壳聚 糖膜直到洗夜中无戊二醛残留为止。然后, 取一 定体积活化的C o n A溶液浸泡壳聚糖膜1 7 h , 再 用去离子水洗涤至洗液中无游离蛋白为止。最后 用一定浓度的酶液浸泡壳聚糖膜17 h , 再用去离 子水洗涤至洗液中无酶蛋白为止, 即得定向固定 化葡萄糖氧化酶膜。
5.2 酶的最适PH
由图5 可见, 游离葡萄糖氧化酶的最适pH值为6 , 定向固定化葡萄糖氧化酶和非定向固定化酶的 的最适p H值是4 , 向酸性一侧发生了偏移。影 响固定化酶最适p H值的主要因素是载体的带电 性质,壳聚糖带有正电荷,用其制备的固定化酶的 最适p H 值比游离酶的最适p H 值低。另外, 定 向固定化葡萄糖氧化酶, 在大于最适p H 值范围 内时活力改变相对较小。
2.2固定化酶的方法
目前主要的固定化方法有:1、用交联凝胶或 纤维包埋; 2、连接在固体聚合物表面; 3、物理 吸附; 4、 微胶囊化。酶的固定化的一个主要缺 点是固定化酶的活性通常会大幅度下降, 其原因 是它的活性位点可能会因为固定化酶的位阻障碍 而妨碍底物进入到酶的活性位点, 另外还会发生 酶和载体产生多点的结合从而使酶失活。 固定化酶可以提高酶的稳定性, 但通常酶通 过酶分子上的多个赖氨酸残基随意固定在载体上, 这样会使酶的活性显著下降, 采用定向固定化酶 不仅可以提高酶的稳定性, 而且可以保存它的活 性。
3.2 定向固定化的过程
3. 2. 1 壳聚糖膜的制备
取适量壳聚糖溶于l% 醋酸溶液中, 配成2. 5% 壳聚糖溶液, 均匀倾倒在有机玻璃板 上, 用量控制在0.17ml/cm2,5 0 ℃ 下干 燥成膜。该膜用1% 氢氧化钠溶液中和, 水洗至中性备用。
3. 2. 2 葡萄糖氧化酶的定向固定化 （1）伴刀豆球蛋白的活化: 将伴刀豆 球蛋白ConA 溶于含0.1mol/L K C I 、 0 . l mmol/LCaCl2、0 . l mmol/LMn C I 2的0.1mol/L磷酸盐缓冲液(P H 7) 中, 配成一定浓度的蛋白溶液,并于4 ℃ 冰箱中活化6 h 。
3、葡萄糖氧化酶的定向固定化
3.1 概述 来源于Aspergillus niger 的葡萄糖氧化酶是一种糖 蛋白, 含糖量占10% 一16% , 糖链主要由甘露糖 构成。伴刀豆球蛋白(ConA )作为一种凝集素, 对 含有甘露糖或葡萄搪的糖蛋白有特异的亲和力, 因 此可以和葡萄糖氧化酶的糖基部分特异性结合在 一起。 本处利用戊二醛将ConA 和壳聚糖交联在一起,然后 葡萄糖氧化酶的糖基部分和ConA 连接起来, 实现 葡萄糖氧化酶的定向固定化。
葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase,简称GOD），其系 统命名为β－D－葡萄糖氧化还原酶（EC1.1.3.4）， 它能高度专一性地催化β－D－葡萄糖与空气中的氧反 应，使葡萄糖氧化成为葡萄糖酸和过氧化氢。该酶广 泛分布于动物、植物及微生物体内，工业上主要利用 黑曲霉和青霉属菌株进行发酵生产。 作为一种新型酶制剂，由于GOD具有去葡萄糖、脱氧、 杀菌等特性，而且安全无毒副作用，因此在食品的加 工保鲜、医学等上都有广泛的应用。1999年，农业部 将它定为12种允许使用的饲料酶制剂添加剂之一。
glucose oxidase 是一种需氧脱氢酶。采用葡萄糖 氧化酶可以除去食品和容器中的氧，从而有效地 防止食物的变质，因此可以应用于茶叶、冰淇淋、 奶粉、啤酒、果酒及其他饮料制品的包装中。葡 萄糖氧化酶是从特异青霉（Penicillium notatum） 等霉菌和蜂蜜中发现的酶。它能催化D-葡萄糖 +O2、D-葡糖酸（的δ-内酯）+H2O2的反应。 EC1．1．3．4．特异青霉（P．notatum）的酶 以其显有抗菌性而引入注意。
2、酶的定向固定化
为什么要 将酶固定 化呢?
酶是一种特殊的生物催化剂, 具有高效性和专一 性; 但酶的稳定性也很差, 一旦活细胞中的酶完 成了催化反应, 就会被蛋白酶降解掉从而失去活 性。 酶所处的环境对酶的活性的影响也很大。酶的疏 水表面上的非极性氨基酸和水接触会形成一种冰 状的水的结构, 这种结构会降低酶的活性, 用糖类 或其他一些分子和酶形成复合物来固定化酶可以 增加酶的稳定性。
2.3传统 所示, 酶 是在随意位点和载体进行连接, 通常的连 接位点是一个ε-氨基酸, 一般是赖氨酸, 因 为酶通常含有多个赖氨酸, 所以酶会和载 体在许多位点进行反应, 这样, 有些位点 的反应就会阻碍底物进入到酶的活性位 点。另外, 当酶随意固定化在载体上时一 般是发生多位点的结合, 这样就会降低酶 的固定化量。
3.2.3 葡萄糖氧化酶的非定向固定化
壳聚糖膜与一定浓度的戊二醛溶液交联2 h , 用去 离子水洗涤壳聚糖膜直到洗夜中无戊二醛残留为 止。然后用一定浓度的酶液浸泡壳聚糖膜1 7 h , 再用去离子水洗涤至洗液中无酶蛋白为止, 即得非 定向固定化葡萄糖氧化酶膜。
4、影响固定化酶活力的因素
• 4. 1. 1 戊二醛浓度对固定化酶活力的影响 在0. 0 2% ~1 . 0% 范围内取不同浓度的戊 二醛溶液与壳聚糖膜交联, 然后将膜浸于p H 7 、0 . l m g/ m l ConA 溶液中17 h , 再 用1 mg/ m l 的酶溶液浸泡1 7 h , 制备定向 固定化酶, 测定固定化酶活力, 结果见图1 。
5.3酶的米氏常数

取1 m l 1 mg/m l 游离酶、12cm 2 非定向 固定化葡萄糖氧化酶膜和定向固定化葡 萄糖氧化酶膜, 选用不同的底物浓度, 3 7 ℃ 下, 测量相应酶促反应的初速度, 用双 倒数作图法, 分别求其米氏常数,结果如图 6 所示。
计算得知, 游离酶的米氏常数Km为9 .4 7mmol /L , 非定向固定化葡萄糖氧化酶的米氏常数Km为 38 .97 mmol/L , 定向固定化葡萄糖氧化酶的米氏 常数Km 为1 5.8 4mmol/L。定向固定化葡萄糖氧 化酶的米氏常数较非定向固定化酶的米氏常数小, 说明定向固定化酶与底物的亲和力大。葡萄糖氧化 酶通过远离活性中心的糖链与载体上的ConA 连接, 实现定向固定化,有利于底物进入酶的活性中心, 所 以与底物的亲和力较大。
6、结论
• 定向固定化可以确保酶分子的空间取向一 致,与非定向固定化酶相比,米氏常数减小, 说明定向固定化酶与底物的亲和力较大。 除此以外, 与游离酶及非定向固定化葡萄糖 氧化酶比较, 定向固定化酶的最适温度、最 适p H 值等酶学特性都有所改变, 定向固定 化葡萄糖氧化酶的最适p H 值向酸性范围发 生了偏移并有更宽的p H 值适用范围, 最适 温度提高。
2.4定向固定化酶的特点
• 通过不同的方法, 把酶和载体在酶的特定位 点上连接起来, 使酶在载体表面按一定的方 向排列, 使它的活性位点面朝固体表面的外 侧排列( 如图1B 所示) , 有利于底物进入到 酶的活性位点里去, 能够显著提高固定化酶 的活性。目前已经发展了一些不同的定向 固定化酶的方法:利用酶和它的抗体之间的 亲和性; 通过酶分子上的糖基部分固定化; 酶和金属离子形成复合物;用分子生物学方 法使酶定向固定化。
ConA 是实现酶定向固定化的重要功能分子, 因此其用 量会显著影响固定化酶活力。从图2 可以看出, 当ConA 浓度为0.02mg/ml时, 酶的活力最高, 之后ConA浓度升 高, 酶的活力下降。这是因为葡萄糖氧化酶的固定化是 依靠ConA 识别并结合葡萄糖氧化酶糖链中的葡萄糖实 现的, ConA 浓度越高, 结合的酶量就越多,活力呈上升趋 势。但是ConA 结合率增加到一定程度,固定化葡萄糖氧 化酶分子密度太大,彼此之间存在空间位阻, 表现出来的 活力下降。所以本实验选择0 . 0 2mg/ml的C o n A 溶液。