极端嗜盐古菌质粒pSCM201衍生穿梭表达载体的构建及应用

Re search Paper研究报告微生物学报Acta Microbiologica Sinica 49(8):1040-1047;4August 2009ISS N 0001-6209;C N 11-1995ΠQ http :ΠΠ Πactamicrocn基金项目:国家自然科学基金(30671141);国家“863计划”(2006AA09Z 401)3通信作者。

T el ΠFax :+86210264807472;E 2mail :xiangh @作者简介:苗荻(1983-),女,北京人,硕士研究生,主要从事微生物分子遗传学研究。

E 2mail :miaous @1631com 收稿日期:2009203216;修回日期:2009204203极端嗜盐古菌质粒pSCM201衍生穿梭表达载体的构建及应用苗荻,孙超岷,向华3(中国科学院微生物研究所,微生物资源前期开发国家重点实验室,北京　100101)摘要:【目的】利用有自主知识产权的嗜盐古菌θ型复制质粒和启动子,构建在极端嗜盐古菌模式菌株西班牙盐盒菌(Haloarcula hispanica )中方便使用、功能完善的基因表达载体。

【方法】以pSC M201的最小复制子为基础,通过引入莫维诺林抗性基因,大肠杆菌质粒复制子以及氨苄抗性基因,构建了一个新的嗜盐古菌2大肠杆菌穿梭载体。

利用定点突变和末端补平法依次将其中多余的酶切位点去除后,再添加hsp 5启动子核心序列、人工合成的多克隆位点以及蛋白纯化标签His ・T ag 等重要元件成功构建了嗜盐古菌表达载体pSC M307。

将报告基因bgaH 插入到该载体的多克隆位点中并转化H .hispanica AS2049,通过X 2gal 平板筛选和β2半乳糖苷酶酶活实验检测pSC M307的表达能力。

【结果】pSC M307具有独立的自主复制能力,其多克隆位点方便实用,报告基因bgaH 在hsp 5启动子控制下实现了高效表达。

【结论】成功构建了嗜盐古菌领域中第一个方便使用的基因表达载体。

关键词:嗜盐古菌;pSC M201;穿梭载体;表达载体中图分类号:Q933 文献标识码:A 文章编号:000126209(2009)0821040208 极端嗜盐古菌相对于其他古菌来说,易于实验室培养及遗传转化,因此已成为研究古菌生命机制最重要的材料之一[1]。

嗜盐古菌富含质粒,在某些菌株中各类质粒可占宿主菌DNA 总量的25%[2],这就为我们构建多样化的载体系统奠定了基础。

加之PEG 介导的原生质体转化方法的建立[3]以及莫维诺林(mevinolin ,Mev )等抗生素抗性选择标记基因的鉴定[4],都相应地推动了极端嗜盐古菌遗传操作系统的逐步完善,促进了嗜盐古菌在分子生物学领域的快速发展。

在已描述的一些极端嗜盐古菌质粒中,其复制方式可以分为两类,一类是滚环型质粒,如pNB101、pZ MX 201[5]等;另一类如pH V2、pHH1等,被推测可能属于θ型复制[2],但都没有直接的实验证据证明。

以这些质粒为基础,已发展了一系列的克隆载体,这些载体均含有极端嗜盐古菌质粒复制子,大肠杆菌质粒复制子以及用于在极端嗜盐古菌和大肠杆菌中筛选转化子的抗性选择标记。

例如pH V2和pHH1就分别被用于构建了目前在嗜盐古菌中普遍使用的穿梭克隆载体pW L102[6]和pUBP2[7]。

将极端嗜盐古菌的克隆载体与极端嗜盐古菌特殊的启动子及其他一些表达调控元件加以组合可构建成表达载体,实现基因的同源或异源表达,以进行基因功能的分析鉴定。

目前,已经有来自盐杆菌属(Halobacterium sp.)的细菌视蛋白基因bop 启动子[8]、来自盐沼盐杆菌(Halobacterium salinarium )的铁氧还蛋白基因启动子[9]以及来自沃氏富盐菌(Halo ferax volcanii )的tRNA 基因启动子[10]等被用于嗜盐古菌基因表达的研究,但是成熟的表达载体仍未见报道。

最近,本实验室的孙超岷博士从盐盒菌属Haloarcula sp.AS7094中分离测序了一个新质粒pSC M201,通过透射电镜分析和复制起点作图等方法,证明该质粒为单向θ复制型质粒,并确定了其最小复制子和精确的复制起始位点[11]。

pSC M201的最小复制子为118kb,包括复制起点ori201以及推测的复制蛋白基因rep201,并且通过质粒稳定性实验证明该复制子的稳定性非常好[12]。

本文的研究工作就是在pSC M201这些遗传特性和研究进展的基础上,对其加以改造和完善,构建一个相对成熟的极端嗜盐古菌专用的基因表达载体。

1　材料和方法111　材料11111　菌株和质粒:极端嗜盐古菌Haloarcula sp. AS7094为pSC M201的天然宿主,采用AS2168培养基于37℃培养[13]。

Haloarcula hispanica AS2049为衍生载体的转化宿主,同样采用AS2168培养基于37℃培养;在需要时添加终浓度为5μgΠm L的莫维诺林作为抗性选择[13]。

大肠杆菌(E scherichia coli)JM109为基因克隆的宿主,采用LB培养基于37℃培养[14];在需要时添加终浓度为100μgΠm L的氨苄青霉素作为抗性选择。

pUCmT载体是购自上海生工的pUCm2 T经平滑化后自身环化成的复制形式[11]。

质粒pW L102为莫维诺林抗性基因(Mev r)的来源;质粒pNP22[15]为bgaH基因的来源。

其他的中间衍生载体产物见表1。

11112　引物:本文涉及的所有引物见表2。

11113　主要试剂和仪器:常用的缓冲液均按照文献表1　本文所涉及的质粒T able1　The plasmids used in this studyPlasmids Relevant features References or s ources pW L1021015kb shuttle vector;Am p r,M ev r Lam et al.,1990pMI101615kb remaining part of pW L102,from which pH V2ori and Hin dⅢsite were rem oved;Am p r,M ev rThis w orkpMI102The E.coli replicon of pMI101was replaced with Eco RⅠ2SphⅠfragment from pUCmT;Am p r,M ev rThis w orkpMI103Hin dⅢsite was rem oved from pMI102;Am p r,M ev r This w orkpMI104NdeⅠsite was rem oved from pMI103;Am p r,M ev r This w orkpSC M301The1985bp pSC M201minimal replicon digested by Eco RⅠand K pnⅠwas inserted intopMI104;Am p r,M ev rThis w orkpSC M302Hin d site was rem oved from pSC M301;Am p r,M ev r This w orkpSC M303ClaⅠsite was rem oved from pSC M302;Am p r,M ev r This w orkpSC M307The144bp fragment including Phsp5,MCS and H is・T ag was inserted into pSC M303;Am p r,M ev rThis w orkpSC M3072bgaH The1992bp PCR product of bgaH gene digested by Bam HⅠand Hin dⅢwas inserted intopSC M307;Am p r,M ev rThis w ork表2　本文所涉及的引物T able2　The primers used in this studyPrimers DNA sequences(5′→3′)Restriction sites or mutation sites 218NF ACGG T ACCCG AG AAG CAG CAAG T AG C K pnⅠ209NR CTG AATTCCCAG ACGG AACCACCATC Eco RⅠH A2TF G AATCGGG CAG T AG AA T G CTTCTG AG TTTCGG A in Hin dⅢreplaced with TH A2TR CCG AAACTCAG AAG C A TTCT ACTG CCCG ATTC T in Hin dⅢreplaced with ACT6CF TCACCCGG T AT ATCG A C G CCAG CCCACACT AT T in ClaⅠreplaced with CCT6CR AT AG TG TGGG CTGG C G TCG AT AT ACCGGG TG A A in ClaⅠreplaced with GBgaHF ACGG ATCCATG ACAG TTGG TG TCTG CT ATT Bam HⅠBgaHR G TCAAG CTTTCACTCGG ACG CG AG TC Hin dⅢThe normal restriction sites are underlined.The mutated restriction sites are shown with dotted lines.The alternative nucleotides in mutated sites are boxed.[4]中的相关要求进行配制。

常用限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Ex Taq DNA聚合酶、T4DNA聚合酶等购自T aK aRa公司。

DpnⅠ购自NE B公司。

K OD2 plus DNA聚合酶购自T oY oBo公司,经该酶扩增出的PCR产物为平末端。

DMS O购自Sigma公司。

RNaseA、52溴242氯232吲哚2β2D2半乳糖苷(X2gal)购自欣经科公司。

T2G radient96PCR仪购自Biometra公司;紫外Π可见分光光度计DU800购自贝克曼库尔特1401苗荻等:极端嗜盐古菌质粒pSC M201衍生穿梭表达载体的构建及应用.Π微生物学报(2009)49(8)(中国)公司。

双链DNA合成由北京擎科公司完成。