dNTPmixture溶液10mM-生工生物工程
生物工程上游技术实验-生工16级
六、实验结果
基因组DNA的浓度和纯度；观察并分析电泳图片
七、实验报告 按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。
实验五 RNA的制备和质量鉴定
一、实验目的
掌握利用试剂盒提取植物细胞总RNA的方法。
二、实验原理
7)向上清液中加等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）， 振荡混匀抽提，离心(14 000 r/min，5min)，溶液将出 现分层。
8) 移取上层水相溶液（约450~500µ L）于另一干净离心管， 加等体积氯仿，振荡混匀抽提，离心(14 000 r/min， 5min)，溶液将出现分层。 9)移取上层水相溶液于另一干净离心管，加入1/10体积的 醋酸钠（pH5.2）和2倍体积无水乙醇混匀，冰浴30min。
六、实验结果
观察并分析电泳图片。
七、实验报告
按实验内容完成实验报告及教材上的思考题。
实验四 大分子DNA的制备和质量鉴定 一、实验目的
采用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法从植物组织 中提取基因组DNA，并进行DNA纯度分析和琼脂糖 凝胶电泳检测。
二、实验原理
核酸是生物体的重要成分，在细胞中常与蛋白质结合在一 起，以核蛋白形式存在。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞 壁和细胞膜，使核蛋白释放出来。 在浓NaCl溶液(1~2mol/L)中，DNA核蛋白的溶解度大， RNA核蛋白的溶解度小；而在稀NaCl溶液(0.14mol/L)中， DNA核蛋白的溶解度小，RNA核蛋白的溶解度大。因此，可 利用不同浓度的NaCl溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品 中分别抽提出来。CTAB是一种阳离子去污剂，具有从低浓 度盐溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高浓度盐溶液 中CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，而不能沉淀核酸。
分子生物学常见溶液配置方法
一.常用贮液与溶液1mol/L亚精胺（Spermidine）: 溶解2.55g亚精胺于足量的水中，使终体积为10ml。
分装成小份贮存于-20℃。
1mol/L精胺（Spermine）：溶解3.48g精胺于足量的水中，使终体积为10ml。
分装成小份贮存于-20℃。
10mol/L乙酸胺（ammonium acetate）：将77.1g乙酸胺溶解于水中，加水定容至1L后，用0.22um孔径的滤膜过滤除菌。
10mg/ml牛血清蛋白(BSA）：加100mg的牛血清蛋白（组分V或分子生物学试剂级，无DNA酶）于9.5ml水中（为减少变性，须将蛋白加入水中，而不是将水加入蛋白），盖好盖后，轻轻摇动，直至牛血清蛋白完全溶解为止。
不要涡旋混合。
加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20℃。
1mol/L二硫苏糖醇（DTT）：在二硫苏糖醇5g的原装瓶中加32.4ml水，分成小份贮存于-20℃。
或转移100mg的二硫苏糖醇至微量离心管，加0.65ml的水配制成1mol/L二硫苏糖醇溶液。
8mol/L乙酸钾（potassium acetate）：溶解78.5g乙酸钾于足量的水中，加水定容到100ml。
1mol/L氯化钾（KCl）：溶解7.46g氯化钾于足量的水中，加水定容到100ml。
3mol/L乙酸钠（sodium acetate）：溶解40.8g的三水乙酸钠于约90ml水中，用冰乙酸调溶液的pH至5.2，再加水定容到100ml。
0.5mol/L EDTA:配制等摩尔的Na2EDTA和NaOH溶液（0.5mol/L），混合后形成EDTA的三钠盐。
或称取186.1g的Na2EDTA·2H2O和20g的NaOH，并溶于水中，定容至1L。
1mol/L HEPES：将23.8gHEPES溶于约90ml的水中，用NaOH调pH（6.8-8.2），然后用水定容至100ml。
1mol/L HCl：加8.6ml的浓盐酸至91.4ml的水中。
BioRT逆转录扩增（RT-PCR）试剂盒说明书（一步法）
b、按以下条件进行PCR反应94℃3m i n94℃30s25-35循环***37℃-65℃**30s72℃****45s-7min72℃5min注：*RT产物可增加至5μl 。
**退火温度根据引物Tm值调整，一般为Tm-5℃。
Control引物退火温度为55℃。
*** 当实验样品RNA特别稀少时，可将循环数增加至40-45循环。
**** 延伸时间根据PCR产物大小确定，一般1kb/min 。
Control引物延伸时间45s。
c、反应结束后，取3-5 μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，确认PCR反应产物。
如果此PCR产物需用于以后实验，应将PCR产物冷冻保存。
RNA control反应时，退火温度55度，30个循环，扩增片段大小为500bp。
使用提示1. RNA模板可以采用总RNA或mRNA，建议使用Biozol(BSC51M1)制备高质量RNA；2. RT实验应避免RNase污染，可采用以下措施：1）因人的皮肤表面和唾液都有RNase，因此实验中应戴一次性手套和口罩；2） RT实验应使用专门的仪器和耗材，建议在专门区域操作RNA；3） RT实验相关耗材应使用干热灭菌（180℃，60分钟）或用0.1％ DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃处理12小时后在121℃高压灭菌30分钟；3. AMV逆转录酶，DNA聚合酶和RNase抑制剂在取用之前应离心后再吸取，吸取时动作要慢，使用后应尽快放回-20℃；4. dNTP应避免反复冻融以免失效；5. 引物的选择可根据具体情况，Oligo-dT适用于具有PolyA尾的RNA(一般是真核生物的mRNA)，Random Hexamer Primer适用于所有RNA(包括mRNA,rRNA,tRNA等)，尤其适用于有复杂二级结构的RNA，特异性引物适用于已知模板序列的RNA；6. PCR反应中MgCl2浓度可依据不同条件进行调整，当目的片段长度大于2kb时，我们建议增加MgCl2浓度，以0.5mM间隔梯度增加。
分子生物学实验方法与步骤【可编辑全文】
可编辑修改精选全文完整版分子生物学实验方法与步骤表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析一、原理细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。
强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS 结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。
采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。
因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。
二、试剂准备1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。
2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。
3、1M Tris-HCl(pH 6.8：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。
4、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。
5、10电泳缓冲液(pH 8.3：Tris 3.02 g，甘氨酸18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。
6、10%过硫酸铵（AP）： 1gAP加ddH2O至10ml。
7、2SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.82.5ml，-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油2.0ml，0.1%溴酚兰1.0ml，ddH2O 3.5ml。
8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸 46ml，ddH2O 225ml。
9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。
二、操作步骤采用垂直式电泳槽装置（一）聚丙烯酰胺凝胶的配制1、分离胶(10%的配制:ddH2O 4.0ml30%储备胶 3.3ml1.5M Tris-HCl2.5ml10% SDS 0.1ml10% AP 0.1ml取1ml上述混合液,加TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺10μl 封底,余加TEMED4μl ,混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平。
猪硫辛酸合成酶基因的克隆及组织表达
猪硫辛酸合成酶基因的克隆及组织表达曹菁菁;张晓梅;鲁维飞;郭豫杰;韩立强;王林枫;杨国宇【摘要】本试验通过电子延伸及RT-PCR技术克隆猪硫辛酸合成酶(lipoic acid synthase,Lias)基因,并进一步研究了该基因在猪体内组织的表达分布.基于电子延伸序列设计1对引物,成功克隆了猪Lias基因(GenBank登录号:JN797612.1),并进行了序列分析,同时利用RT-PCR方法分析了Lias基因的组织表达规律.克隆的猪Lias基因长度为1119 bp,包括1个完整的开放阅读框,编码372个氨基酸;克隆的猪Lias基因与小鼠、褐鼠、人、牛的核苷酸序列同源性分别为71.5％、69.0％、77.3％、70.4％;推导的cDNA编码区(CDS)的氨基酸序列与小鼠、褐鼠、人、牛的同源性分别为91.5％、79.4％、89.4％、88.2％;构建的系统进化树结果显示,猪与小鼠、褐鼠的亲缘关系最近;组织表达分布结果表明,Lias基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、十二指肠、空肠、直肠、回肠、脂肪、皮肤和肌肉中都有表达;Gel-Pro软件分析结果表明,Lias基因在肾脏和脂肪组织中表达丰度最高,其次是直肠和回肠.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2013(040)009【总页数】5页(P75-79)【关键词】猪;硫辛酸合成酶基因;克隆;组织表达【作者】曹菁菁;张晓梅;鲁维飞;郭豫杰;韩立强;王林枫;杨国宇【作者单位】河南农业大学,农业部动物生化与营养重点开放实验室,河南郑州450002;河南农业大学,农业部动物生化与营养重点开放实验室,河南郑州 450002;河南农业大学,农业部动物生化与营养重点开放实验室,河南郑州 450002;河南农业大学,农业部动物生化与营养重点开放实验室,河南郑州 450002;河南农业大学,农业部动物生化与营养重点开放实验室,河南郑州 450002;河南农业大学,农业部动物生化与营养重点开放实验室,河南郑州 450002;河南农业大学,农业部动物生化与营养重点开放实验室,河南郑州 450002【正文语种】中文【中图分类】Q786硫辛酸最初是在酵母、菠菜和肉类中发现的生物因子，其主要生物活性是抗氧化，是已发现的唯一具备脂水兼容性的抗氧化剂(Gokhan等，2008;Smith 等，2004)，学名为 6，8－二硫辛酸(6，8－thioctic acid)，其分子内含有二硫键，是丙酮酸脱氢酶、2－酮戊二酸脱氢酶、支链ɑ酮酸脱氢酶、3羟基丁酮酸脱氢酶、甘氨酸裂解系统等(Cronan等，2005)代谢中关键酶的辅因子。
PH0113 dNTP Mixture 2.5mM实验方法
Catalog No：PH0113 Size： 0.5mL | 5×0.5mL | 1mL Store at -20℃
dNTP Mixture 可以用于以下分子生物学反应：PCR、实时 PCR、高保真 PCR、长片段 PCR、cDNA 合成、RT-PCR、DNA 标记和 DNA 测序等。 本产品分为 2.5 mM each、10 mM each 两种浓度。均为 dATP、dGTP、dCTP、dTTP 的等摩尔混合物。dNTP 纯度均达到 99％以上（HPLC 纯度），不含 DNase 和 RNase，适合多种聚合酶的扩增反应。 用于 PCR 的标准使用量： 2.5mM dNTP 是 50 μl 反应体系用 4 μl（终浓度为各 200 μM）。 10mM dNTP 是 50 μl 反应体系用 1 μl（终浓度为各 200 μM）。
PCR 鉴定
①以λDNA 为模板进行 PCR 反应，能很好扩增 500bp~20kb 产物。 ②以 HL60 细胞由来的 RNA 为模板，对 TFR 领域进行 RT-PCR 反应，能很好扩增 4.4kb 片段。
分子生物学实验指导
实验一RT-PCR法钓取小鼠肝脏GAPDH基因一、TRlzol试剂提取小鼠肝脏总RNATRIzol RNA提取试剂盒是由GIBCOBRL公司推出的产品，其操作方法简捷、方便，lh之内即可完成，所制备的RNA可用于cDNA合成及Northern blot等。
【试剂】TRlZOL试剂氯仿异丙醇75％乙醇（DEPC水配制）无RNase水【操作方法】（1）收获细胞1~5×106；或50-100mg组织，加TRlzol试剂lml匀浆。
（2），移入1.5ml Ep管中，室温静置5min。
（3）每1ml TRIZOL中加氯仿0.2m1，摇振15s，置室温2～3min。
（4）4℃离心，12,000g×15min。
（5）仔细吸取上层水相，移至另一Ep管中。
（6）加0.5ml异丙醇，混匀，置室温10min。
（7）4℃离心，12,000g×10min。
（8）弃上清，加75％乙醇1m1，轻轻摇振，充分洗涤沉淀，4℃离心，7500g×5min。
（9）弃上清，真空干燥后，沉淀重悬于50μl无RNase水中。
一70℃保存备用。
二、核酸的定量（1）分光光度法测定核酸浓度。
组成核酸分子的碱基，均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收波长为250~270nm之间。
例如腺嘌呤的最大紫外线吸收值在260.5nm，胞嘧啶：267nm 鸟嘌呤：276nM胸腺嘧啶：264.5 nm尿嘧啶259nm。
这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后，其最大吸收峰不会改变，但核苷酸最大吸收波长是260nm，吸收低谷在230nm，这个物理特性为紫外分光光度法测定核酸溶液浓度提供了基础。
在波长260nm紫外线下，1OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50ug/ ml；单链DNA或RNA为40ug/ml；单链寡核苷酸为20ug/ml。
另外，还可以通过测定260nm和280nm的紫外线吸收值，然后根据其比值来估计核酸的纯度。
DNA样品的比值为1.8，RNA样品的比值为2.0。
高通量测序分析蚕豆种子内生细菌的多样性
中国农业科技导报，2021,23(2)：73-80Journal of Agricultural Science and Technology高通量测序分析蚕豆种子内生细菌的多样性刘璐1,名晓东1,张晓艳2,郝俊杰2,付丽平1,王乾坤1,吕鑫1,陈旺1,刘全兰1*(1.青岛科技大学海洋科学与生物工程学院，山东青岛266042；2.青岛市农业科学研究院，山东青岛266100)摘要:为了分析蚕豆种子内生细菌的多样性，采用1llumina MiSeq高通量测序技术，从日本大白皮(S18P23.1、S18P23.2)和启豆2号(S18P24.1.S18P24.2)的种子获得16S RNA V3~V4区有效序列133855条。
将高于97%相似度的序列划分为一个操作分类单元(operational taxonomic unit,OTU),优化后得到1598个OTUs。
内生细菌种群分析结果表明，拟杆菌门(Bacteroidetes,丰度为30%-33%)、变形菌门(Proteobacteria,23%~25%)、厚壁菌门(Firmicutes,23%-25%)和放线菌门(Actinobacteria,5%~7%)为两个蚕豆品种共有的优势菌门，但属水平的优势菌群在供试蚕豆种子中均有差异。
这些结果表明，蚕豆种子具有 丰富的内生细菌资源，含有多种具有益功能性状的细菌类群，值得进一步跟踪研究这些益生菌在蚕豆种植到土壤后的变化规律;启豆2号种子中益生菌的种类和丰度高于日本大白皮，值得进一步分离和研究这些益生菌的益生或促生特性，筛选获得在食品和生物肥料等领域有应用潜力的菌株。
关键词：高通量测序;蚕豆；内生细菌;多样性doi:10.13304/j.nykjdb.2019.0860中图分类号:S664.143.6文献标识码：A文章编号：1008-0864(2021)02-0073-08Diversity of Endophytic Bacteria in Faba BeanSeeds by High-Throughput SequencingL1U Lu1,M1NG Xiaodong1,ZHANG Xiaoyan2,HAO Junjie2,FU Liping1,WANG Qiankun1,LYU Xin1,CHEN Wang1,L1U Quanlan1*(1.College of Marine Science and Biological Engineering,Qingdao Lniversity of Science&Technology,ShandongQingdao266042,China； 2.Qingdao Academy of Agricultural Sciences,Shandong Qingdao266100,China)Abstract：1n order to analyze the species abundance and diversity of endophytic bacteria in faba bean seeds,taking Japan^s white skin(S18P23.1,S18P23.2)and Qidou2(S18P24.1,S18P24.2)as materials,133855effective sequences were obtained by1llumina MiSeq high-throughput sequencing of the16S rRNA V3~V4region.The sequence with similarity above97%was divided into one operational taxonomy unit(OTU),so1598OTUs were obtained after optimization.The results showed that majority of the endophytic bacteria belonged to Bacteroidetes (30%~33%),Proteobacteria(23%~25%),Firmicutes(23%~25%),and Actinobacteria(5%~7%),which were therefore the dominant bacterial Phyla in these four faba bean seeds.The dominant genera at genus level in these endophytic bacteria sequenced from faba bean seeds were different.Above results indicated faba bean seeds were rich in endophytic bacteria,the abundance of probiotics in one faba bean variety(Qidou2)were higher than another variety(Japan's white skin).Key words:high-throughput sequencing；faba bean seed；endophytic bacterium；diversity蚕豆(Vicia faba L.)属豆科蝶形花亚科野豌豆族野豌豆属，起源于亚洲西南部和非洲北部[1-2]o蚕豆营养丰富，含有蛋白质、糖类、脂质、膳食纤维以及钙、铁、胡萝卜素、维生素等;蚕豆中含有人体中不能合成的8种必需氨基酸，其中赖氨酸含量较高[3]o蚕豆还有利湿消肿、清热健收稿日期：2019-10-17；接受日期：2019-12-18基金项目：国家食用豆产业技术体系项目(CARS-08)；青岛市农业科学研究院院长基金项目。
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Cat. No. : B500056 Package: 500 μl Storage: -20°C Brand: 生工
c 产品说明 te 产品置于用 NaOH 滴定 pH 至 7.0 的水溶液
中。dNTP 是单品销售的 dATP、dCTP,、
io dGTP 和 dTTP 的 10 mM 等摩尔核酸混合
液。
应用
B 所有分子生物学应用，包括 PCR，高保真度
和 长 PCR ， Lamp-PCR ， cDNA 合 成 ，
n RT-PCR，DNA 标记和测序。 o 质量控制
1. PCR 测试。
ng 2. 通过 HPLC 证实每种成分的纯度大于
99%。 3. 不含内切酶，脱氧核糖核酸酶，核糖核Fra bibliotek酸酶和切口活性。
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