安捷伦高效液相色谱基本原理-理论
浅谈高效液相色谱仪原理与应用 液相色谱工作原理
浅谈高效液相色谱仪原理与应用液相色谱工作原理在试验中，高效液相色谱仪常被用于分析高沸点不易挥发的、受热不稳定的和分子量大的有机化合物，那么今日我们就来看看高效液相色谱仪结构原理与其应用。
高效液相色谱仪高效液相色谱仪（HPLC）是应用高效液相色谱原理，紧要用于分析高沸点不易挥发的、受热不稳定的和分子量大的有机化合物的仪器设备。
它由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分构成。
储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相）内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的调配系数，在两相中做相对运动时，经过反复多次的吸附—解吸的调配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分别成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。
HPLC广泛应用于生命科学、食品科学、药物讨论以及环境讨论中。
高效液相色谱仪结构与工作原理高效液相色谱仪的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分构成。
储液器中的流动相被高压泵打入系统，样品溶液经进样器进入流动相，被流动相载入色谱柱（固定相）内，由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的调配系数，在两相中作相对运动时，经过反复多次的吸附—解吸的调配过程，各组分在移动速度上产生较大的差别，被分别成单个组分依次从柱内流出，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪，数据以图谱形式打印出来。
高效液相色谱仪的应用高效液相色谱仪应用特别广泛，几乎遍及定量定性分析的各个领域。
例如环境气体分析、药物分析、茶叶的成分分析、食品分析、生物制药、化工化工、脂肪酸分析、氨基酸分析等方面。
而高效液相色谱法只要求样品能制成溶液，不受样品挥发性的限制，流动相可选择的范围宽，固定相的种类繁多，因而可以分别热不稳定和非挥发性的、离解的和非离解的以及各种分子量范围的物质。
与试样预处理技术相搭配，HPLC所达到的高辨别率和高灵敏度，使分别和同时测定性质上特别相近的物质成为可能，能够分别多而杂相体中的微量成分。
安捷伦超高效液相色谱-三重四级杆质谱仪器讲解
液质联用仪本实验室使用的液质联用仪是安捷伦公司6400系列的一款产品，包括超高效液相色谱1290和质谱主机G6460，以及与其配套的计算机和打印机，他们之间通过网络协议通讯，并通过网络交换机连接在一起。
本仪器于2014年年初安装使用，价值两百多万元。
物质只要能溶于液体，均可以被检测。
本实验室主要用于农产品样品的农药残留定性检测，超高效液相色谱1290是整个系统的分离和进样装置，样品在色谱柱中经初步分离，通过接口进入质谱。
质谱以离子源、质量分析器和检测器为核心。
离子源是将分析物中的中性化合物离子化，并将产生的离子在电场的作用下进入离子传输毛细管。
离子传输毛细管是离子的导入通道，它将离子源产生的离子传输进入质谱，同时，隔绝了外部的常压与质谱内部的高真空。
离子通过毛细管后，进入离子光学组件，它包括skimmer1，八极杆以及lens1和lens2，进一步除去了溶剂以及中性分子，也是一个高效的离子传输组件，并聚焦随机运动的离子进入三重四极杆质量分析器。
G6460的质量分析器是三重四级杆，是由三组四极杆空间串联而成，一个质谱就是一个四级杆，所以三重四级杆质谱是空间串联的多级质谱分析，也叫做QQQ质谱。
第一个四级杆根据设定的质合比范围扫描和选择所需的离子。
第二个四级杆，也称碰撞池，用于聚集和传送离子。
在选择离子飞行的途中，引入碰撞气体氮气，第三个四级杆用于分析在碰撞池中产生的碎片离子。
实际上，碰撞池采用了六极杆的设计，拥有更好的聚焦及传输功能，四级杆就被淘汰了，但还沿用三重四级杆的名称。
G6460质谱的检测器包括高能打拿极和电子倍增器，此外，质谱需要在真空环境下工作，它的真空系统由前级真空泵和分子涡轮泵组成，前级真空一般在 1.8-2.5Torr之间，高真空在1.9-2.3*10-5Torr之间。
原理：它以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。
样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。
高效液相色谱仪工作原理
高效液相色谱仪工作原理高效液相色谱仪（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是一种广泛应用于实验室中的分析仪器，它通过分离复杂样品中的化学成分，并用于定量和定性分析。
本文将介绍HPLC的工作原理，包括其基本组成部分、样品处理和分析过程。
一、HPLC的基本组成部分HPLC主要由以下几个基本组成部分构成：流动相系统、进样系统、色谱柱和检测器。
1. 流动相系统：流动相是指在色谱柱中流动的溶液，它由溶剂和缓冲液组成。
溶剂起到溶解样品和推动流动的作用，而缓冲液则用于控制流动相的pH值和离子强度。
2. 进样系统：进样系统用于将待分析的样品引入色谱柱中。
常见的进样方式有自动进样器和手动进样器两种。
3. 色谱柱：色谱柱是分离和分析样品的关键部分。
它通常由含有吸附剂或离子交换树脂的管状介质构成，样品分离通过溶液在色谱柱中的传递来实现。
4. 检测器：检测器用于监测从色谱柱中流出的化合物。
常见的检测器包括紫外-可见吸收检测器（UV-Vis）、荧光检测器、质谱检测器等。
二、HPLC的样品处理和分析过程HPLC的样品处理和分析过程一般包括以下几个步骤：前处理、样品进样、色谱分离和检测。
1. 前处理：前处理主要是将待分析的样品净化和浓缩，以去除杂质和提高分析灵敏度。
常见的前处理方法包括固相萃取、液液萃取、净化柱等。
2. 样品进样：进样是将处理过的样品引入进样系统的过程。
样品进样的方式有自动进样和手动进样两种。
自动进样器可以实现多个样品的连续进样，提高工作效率。
3. 色谱分离：色谱分离是HPLC的核心步骤，通过样品在色谱柱中的分配系数差异来实现样品分离。
不同的色谱柱和流动相的选择可实现对不同化合物的分离。
4. 检测：检测器用于监测从色谱柱中流出的化合物，获取它们的信号。
不同的检测器根据其原理和应用场景选择，从而实现对不同样品的定性和定量分析。
三、HPLC的分析应用HPLC在各个领域广泛应用于化学分析和质量控制。
高效液相工作原理及使用
高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9´107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。
特点1．高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。
一般可达150～350×105Pa。
2. 高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。
高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于1h 。
3. 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。
4.高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。
如荧光检测器灵敏度可达10-11g。
另外，用样量小，一般几个微升。
5.适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。
而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。
对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的75% ～80% ）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。
据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。
高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。
用不同类型的高效液相色谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。
其不同之处是高效液相色谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好，且须在色谱仪中进行。
高效液相色谱HPLC基本原理
色谱柱的温度控制：优化色谱柱的 温度提高分离效率
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色谱柱的维护：定期清洗和维护色 谱柱保证其性能稳定
色谱柱的填充：优化色谱柱的填充 方式提高分离效果
流动相的组成：有机溶剂和水
流动相的选择原则：根据样品性质和检测器类型选择
流动相的优化方法：通过改变有机溶剂和水的比例、改变有机溶剂的种类、改变有机 溶剂的浓度等方法进行优化
流动相的优化效果：提高分离效果、提高检测灵敏度、降低检测时间等
固定相的选择： 根据样品性质 和分离要求选 择合适的固定
相
固定相的粒径： 粒径越小分离 效果越好但会 增加压力和延
长分析时间
固定相的表面 处理：表面处 理可以提高固 定相的稳定性
和选择性
固定相的填充： 填充方式会影 响柱效和分离 效果常用的填 充方式有轴向 填充、径向填 充和螺旋填充
汇报人：
智能化：I技术在HPLC中的应用提 高分析效率和准确性
高通量：高通量HPLC技术的发展提 高分析速度和通量
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微型绿色环保：环保型HPLC技术的发展 降低对环境的影响和污染
气相色谱-质 谱联用：提高 检测灵敏度和
准确性
样品采集：选择合适的样品采 集方法如抽样、取样等
样品预处理：对样品进行预处 理如过滤、离心、稀释等
样品保存：选择合适的样品保 存方法如冷藏、冷冻等
样品分析：对样品进行分析如 定性、定量等
进样器选择：根据样品性质 和实验要求选择合适的进样 器
样品准备：选择合适的样品 进行适当的处理和稀释
进样操作：将样品注入进样 器确保样品完全进入色谱柱
安捷伦超高效液相色谱-三重四级杆质谱仪器讲解
液质联用仪本实验室使用的液质联用仪是安捷伦公司6400系列的一款产品，包括超高效液相色谱1290和质谱主机G6460，以及与其配套的计算机和打印机，他们之间通过网络协议通讯，并通过网络交换机连接在一起。
本仪器于2014年年初安装使用，价值两百多万元。
物质只要能溶于液体，均可以被检测。
本实验室主要用于农产品样品的农药残留定性检测，超高效液相色谱1290是整个系统的分离和进样装置，样品在色谱柱中经初步分离，通过接口进入质谱。
质谱以离子源、质量分析器和检测器为核心。
离子源是将分析物中的中性化合物离子化，并将产生的离子在电场的作用下进入离子传输毛细管。
离子传输毛细管是离子的导入通道，它将离子源产生的离子传输进入质谱，同时，隔绝了外部的常压与质谱内部的高真空。
离子通过毛细管后，进入离子光学组件，它包括skimmer1，八极杆以及lens1和lens2，进一步除去了溶剂以及中性分子，也是一个高效的离子传输组件，并聚焦随机运动的离子进入三重四极杆质量分析器。
G6460的质量分析器是三重四级杆，是由三组四极杆空间串联而成，一个质谱就是一个四级杆，所以三重四级杆质谱是空间串联的多级质谱分析，也叫做QQQ质谱。
第一个四级杆根据设定的质合比范围扫描和选择所需的离子。
第二个四级杆，也称碰撞池，用于聚集和传送离子。
在选择离子飞行的途中，引入碰撞气体氮气，第三个四级杆用于分析在碰撞池中产生的碎片离子。
实际上，碰撞池采用了六极杆的设计，拥有更好的聚焦及传输功能，四级杆就被淘汰了，但还沿用三重四级杆的名称。
G6460质谱的检测器包括高能打拿极和电子倍增器，此外，质谱需要在真空环境下工作，它的真空系统由前级真空泵和分子涡轮泵组成，前级真空一般在 1.8-2.5Torr之间，高真空在1.9-2.3*10-5Torr之间。
原理：它以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。
样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。
安捷伦1260高效液相色谱培训
2 培训ppt
色谱原理
色谱法的分离原理是：溶于流动相 (mobile phase)中的各组分经过固定相时 (stationary phase)发生作 用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲
。又称为色层法、层析法
3 培训ppt
高效液相色谱仪
高效液相色谱仪的结构：一般可分为5 个主要部分：高压输液系统、进样系统、色 谱分离系统、检测系统、数据处理系统。其 工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动 相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制 器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流 经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色 谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器， 记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此 得到液相色谱图。
(5)蒸发光散射检测器
13 培训ppt
日常维护
常见色谱故障----基线噪音
可能原因:a、检测池脏 b、检测池灯能量下降 c、由泵引起的脉冲 d、检测器上的温度效应 e、检测其中有气泡通过
常见色谱故障----基线漂移
可能原因:a、梯度洗脱所用溶剂有吸收 b、流动相脏 c、色谱柱没有用流动相平衡 d、系统中污染物溢出 e、实验温度不稳定
7 培训ppt
三、 色谱分离系统
色谱分离系统包括：色谱柱、固定相和流动相。其中，色谱 柱是其核心部分。
1、色谱柱的构造 色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接 头、螺丝等组成。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内 衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属 管用得较多。 2、色谱柱的类型 色谱柱按照用途分为分析型和制备型两类。 a、常规分析柱（常量柱）一般色谱柱长10～30cm，内径为 2～5mm（常量4.6mm，国内有4mm和5mm），凝胶色谱柱内径 3～12mm，制备往内径较大，可达25mm 以上。 b、窄径柱（细管径柱、半微量柱）柱长10～30cm，内径1～ 2mm
安捷伦高效液相色谱法
3 分离系统——色谱柱
色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与 固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜 及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有 限，故金属管用得较多。一般色谱柱长5～30cm， 内径为4～5mm，凝胶色谱柱内径3～12mm，制备往 内径较大，可达25mm 以上。一般在分离前备有一 个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这 样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱 和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保 证分离技的性能不受影响。
20-3高效液相色谱的固定相和流动相
（－）固定相
高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类， 可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化 硅为基质，可承受7.O×108～1.O×109Pa的高压， 可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二 氧化硅表面键合各种官能团，就是键合固定相，可 扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。 硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚 苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为 3.5×108Pa。固定相按孔隙深度分类，可分为表面 多孔型和全多孔型固定相两类。
（3）高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动相 溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳， 或产生“伪峰”。痕量杂质的存在，将使截止波长 值增加50～IOOnm。
（4）化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚 合的溶剂。
(5)低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力， 不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙 晴等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，例戊烷、 乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影 响分离.
（二）化学键合相色谱法（CBPC）
采用化学键合相的液相色谱称为化学键合相色谱法， 简称键合相色谱。由于键合固定相非常稳定，在使用 中不易流失，适用于梯度淋洗，特别适用于分离容量 因子k值范围宽的样品。由于键合到载体表面的官能团 可以是各种极性的，因此它适用于种类繁多样品的分 离。
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前言
色谱柱内部的作用原理
时间 t
ToC
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分离 tr2-tr1 峰宽 Wb1,2
前言
色谱柱内部的作用原理
tr2-tr1
tr2-tr1
较好分离
对比
较差分离
Wb1
Wb2
ToC
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较好分离
对比
Wb1
Wb2
较差分离
前言
色谱柱内部的作用原理
Rs
tr2 tr1 1/ 2 (Wb2 Wb1)
分离度是对色谱基线分 离。
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ToC
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关键参数
保留因子 (k)
k
=
æ ç
tr
è
- t0 t0
ö ÷ ø
保留因子测定了样品组分在固定相与流动相中的保留时间之比。它是用保留 时间除以不保留峰的出峰时间 (t0) 计算得出的。
Wb2
t
关键参数
分离度 — 基线分离
分离度是对色谱柱分离目标峰能力的描 述。分离度将受到柱效 (N)、选择性 (a) 和保留 (k) 的影响。
• 可以进行充分定量分析的可测分离的最 小分离度为 1。
• 可辨别出两个等高峰之间峰谷的最低分 离度为 0.6。
• 稳定的分析方法通常需要分离度达到 1.7 或更高。
该方程式显示出流速 何影响保留因子的。
(F)、梯度时间
(tG)、梯度范围
(ΔΦ)
和柱体积
(Vm)
是如
请记住：为使保留因子保持恒定，分母的改变需要由分子相应按比例改变来 抵消，反之亦然。
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峰容量
定义
峰容量是指在给定时间和分离度条件下可以分离的色谱峰数目 (n)。 峰容量取决于柱长和填料粒径等不同的因素。
关键参数
选择性或分离因子 (α)
a k2
k1
a 选择性
k1 第一个峰的保留因子 k2i 第二个峰的保留因子
选择性是两个峰顶点间时间或距离的量度。如果 α = 1，则两个峰具有相同的 保留时间，并且会被共洗脱。它被定义为容量因子之比。
影响保留因子的参数： • 固定相 • 流动相 • 柱温
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折合理论塔板高度 (h)
Van Deemter 方程
h = A + B/u + C u
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加和曲线：Van Deemter
传质阻力
涡流扩散 +轴向扩散 流速
Van Deemter 方程
h：折合理论塔板高度
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Van Deemter 方程
涡流扩散
weddy ~ λ dp
λ：色谱柱填料的品质
扩散路径的不同是由于：
不同的路径
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目录 (ToC)
前言 • 色谱柱内部的作用原理 关键参数 • 保留时间与峰宽 • 分离度 — 基线分离 • 分离度 — 基本公式 • 柱效或理论塔板数 • 保留因子 • 选择性或分离因子 影响选择性的因素 • 选择性 — 示例 1 • 选择性 — 示例 2 • 选择性 — 示例 3 • 塔板数
关键参数
分离度 — (U)HPLC 的基本方程式
选择性对分离度的影响最大 • 改变固定相 • 改变流动相 塔板数最容易增加
该图阐明了分离度是选择性、柱效和保留的函数。
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关键参数
时间 t
分离 tr2-tr1 峰宽 Wb1,2
关键参数
保留时间与峰宽
tr2 tr1
h
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W1/2 Wb1
tri 化合物 i 的保留时间 W1/2 半峰高处的峰宽 Wbi 基线峰宽
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影响分离的因素
高塔板数 (N) 可提供： • 尖锐的窄峰 • 更出色的检测能力 • 分离复杂样品的峰容量
但分离度只随塔板数平方根的增大而提高。 • RS ~ N
塔板数的增大受实验条件的限制 • 分析时间、柱压
关键参数
N、α 及 k 对分离度的影响
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影响分离的因素
同一种样品采用不同固定相，但始终采用相同柱温、流动相和梯度进行分析。
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针对不同填料粒径进行测定
• 使用小粒径填料可 以获得较小的理论 塔板高度，从而实 现更高的分离效率
• 对于更小粒径的填 料，流速提高时分 离效率的损失更少
• 化合物和仪器特异 性
• 最佳流速取决于具 体化合物
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柱效或理论塔板数 (N)
2
N
16
tr Wb
2
N
5.54
tr W1/
2
柱效用于比较不同色谱柱的性能。由理论塔板数 N 表示。
具有高塔板数的色谱柱柱效更高。与具有较低塔板数的色谱柱相比，具有高塔 板数的色谱柱在给定保留时间处可以获得更窄的色谱峰。
影响柱效的参数： • 柱长（增加柱长可以提高柱效） • 填料粒径（减小填料粒径可以提高柱效）
影响保留因子的参数：
• 固定相 • 流动相 • 梯度斜率* • 系统驻留体积*
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*仅指梯度洗脱
关键参数
保留因子 (k) — 梯度洗脱
k ` tG F S Vm
2
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Van Deemter 方程
“传质阻力”
wC ~ dp2
不同的扩散路径
多孔填料 流动相的固定层
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Van Deemter 方程
Van Deemter 方程通过综合考虑分离过程中引起峰展宽的物理学、动力学
5.0 m 3.5 m 1.8 m
峰容量
梯度分析
h f (w 2 ) 折合理论塔板高度是峰宽的函数
等度运行： 峰宽仅取决于扩散过程。 梯度运行：
峰宽取决于扩散过程和柱头梯度聚焦。
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影响分离的因素
同一种样品采用相同固定相和柱温，但采用不同流动相进行分析（相同 梯度）。
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影响分离的因素
同一种样品采用相同固定相、流动相及相同梯度，但采用不同柱温 进行分析。
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影响分离的因素
HPLC 中“塔板”的含义
Rs
~
1 4
N
Rs
~
1 4
Lc H
~
1 4
LC 柱长 dp 填料粒径 h 折合理论塔板高度