DNA复制的酶学和拓扑学
DNA的生物合成(基因信息传递)
复制的基本规律(重点) ➢ 复制的方式 —半保留复制 (semi-conservative replication) ➢ 双向复制 (bidirectional replication) ➢ 半不连续复制 (semi-discontinuous replication)
复制中不连续的两条单链
切断、整理后的两链
结果 (dNTP)n+1
不连续→连续链 改变拓扑状态
第三节 DNA生物合成过程
The Process of DNA Replication
一、原核生物的DNA生物合成
（一）复制起始：DNA解链形成引发体
需要解决两个问题： 1. DNA解开成单链，提供模板。 2. 形成引发体，合成引物，提供3-OH末端。
二、DNA聚合酶催化核苷酸之间聚合
➢全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent
DNA polymerase，DNA-pol)
➢ 活性： 1. 53 的聚合活性 2. 核酸外切酶活性
①3 5外切酶活性: 能辨认错配的碱基对，并将其水解
②5 3外切酶活性: 能切除突变的 DNA片段。
CG
AT
AT
CG
CG
TA
TA
GC
GC
GC
GC
子代DNA
二、DNA复制从起始点向两个方向延伸
➢ 原核生物复制时，DNA从起始点(origin)向两个方向解链， 形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。
ori
ter
A
B
A. 环状双链DNA及复制起始点
C
B. 复制中的两个复制叉
C. 复制接近终止点(termination, ter)
DNA复制的酶学
DNA-pol III:
由10种亚基组成的不对称聚合体 种亚基组成的不对称聚合体 催化效率最高
(一) DNA聚合酶催化的反应 一 聚合酶催化的反应
1. 5至3的聚合活性 催化四种dNTP一个一个地接到DNA 催化四种dNTP一个一个地接到DNA 一个一个地接到 链上去。 链上去。 (dNMP)n + dNTP → (dNMP)n+1 + PPi
聚合反应机理： 聚合反应机理：
5'
P
5'
DNA连接酶在复制、DNA修复、 连接酶在复制、 修复、 连接酶在复制 修复 重组、剪接中均起缝合缺口作用。 重组、剪接中均起缝合缺口作用。 中均起缝合缺口作用 是重要的工具酶之一。 是重要的工具酶之一。 工具酶之一
复制相关蛋白的基因： 复制相关蛋白的基因：dna A、dna B、 、 、 dna C… …dna X 相应的表达产物蛋白质： 相应的表达产物蛋白质：Dna A、Dna B、 、 、 Dna C … …Dna X Dna A：辨认复制起始位点 ： Dna B：解螺旋酶 ： Dna C：辅助解螺旋酶使其在起始点上 ： 合并打开双链。 结 合并打开双链。
5→3外切酶活性： →3外切酶活性： 切除引物 切除突变的片段 3→5外切酶活性： →5外切酶活性： 切除错配的核苷酸
3' C T T C A G G A G A A G T C C G G C G 5'
DNA拓扑异构酶概述
DNA拓扑异构酶综述摘要：DNA拓扑异构酶为催化DNA拓扑学异构体相互转变的酶之总称，是一种见于真核细胞和原核细胞中的重要生物酶，其对DNA转录、复制、染色体分离及基因表达等过程中的DNA 拓扑结构起着重要的调控作用。
研究发现，与正常细胞不同，DNA 拓扑异构酶在肿瘤细胞中表现出不受其他因素影响的高水平表达，而许多抗肿瘤药物的作用机制也与DNA拓扑异构酶密切相关，因此它作为抗肿瘤药物的重要靶点引起了研究者的广泛关注。
此外，科学家们还发现拓扑异构酶在神经发育调节上也起着一定的作用，虽然机制还需要进一步研究，但这一发现就有着重要意义。
本文对DNA拓扑异构酶的反应、结构、分类及生物功能进行了简要的归纳，介绍了DNA拓扑异构酶抑制剂的研究及分类，并对拓扑异构酶在其他方面上的进展进行了简单的介绍。
关键词：DNA拓扑异构酶拓扑异构酶抑制剂抗肿瘤药物生物功能DNA拓扑异构酶（topoisomerase）调控DNA超螺旋状态，它是存在于细胞核内的一类酶，参与DNA复制、重组、转录、修复等核内关键作用，它们能够催化DNA链的断裂和结合，从而影响DNA的拓扑状态。
真核细胞的拓扑结构由两种关键拓扑异构酶拓扑异构酶I和拓扑异构酶II调节，拓扑异构酶I通过形成短暂的单链裂解-结合循环，催化DNA复制的拓扑异构状态的变化；相反，拓扑异构酶II通过引起瞬间双链酶桥的断裂，然后打通和再封闭，以改变DNA的拓扑状态。
哺乳动物中，拓扑异构酶II又可以分为αII型和βII型。
拓扑异构酶的应用也很广泛，如现已知这些酶是很多抗肿瘤药物的细胞内靶酶，在肿瘤细胞中，拓扑异构酶的含量高于正常细胞，所以以其为靶点的抑制具有一定特异性，因此对它的研究也越来越重视。
1、DNA拓扑异构酶 I拓扑异构酶I催化DNA链的断裂和重新连接，每次只作用于一条链，即催化瞬时的单链的断裂和连接，它们不需要能量辅因子如ATP或NAD。
E.coliDNA拓扑异构酶I又称ω蛋白，大白鼠肝DNA拓扑异构酶I又称切刻-封闭酶(nicking-closing enzyme )。
DNA复制、引物、酶及蛋白质
DNA复制起始引发体的形成及所参与的酶和蛋白质、DNA复制过程一、DNA复制起始引发体的形成及所参与的酶和蛋白质DNA复制起始一共涉及到DnaA（复制起始因子，识别OriC序列）、DnaB（DNA解链酶）、DnaC（召唤DnaB到复制叉）、HU（结合DNA使之弯曲）、引物合成酶、单链DNA结合蛋白、RNA聚合酶、DNA旋转酶、Dam甲基化酶，一共是9种重要的酶或蛋白质，其中DnaA、DnaB、引物合成酶、单链DNA结合蛋白、Dam甲基化酶非常重要。
DNA复制时，往往先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，再由聚合酶从RNA引物3’端开始合成新的DNA链。
对于前导链来说，这一引发过程比较简单，只要有一段RNA引物，DNA聚合酶就能以此为起点，一直合成下去。
对于后随链，引发过程较为复杂，需要多种蛋白质和酶参与。
后随链的引发过程由引发体来完成。
引发体由6种蛋白质构成，预引体或引体前体把这6种蛋白质结合在一起并和引发酶或引物过程酶进一步组装形成引发体。
引发体似火车头一样在后随链分叉的方向前进，并在模板上断断续续的引发生成滞后链的引物RNA短链，再由DNA聚合酶 III 作用合成DNA，直至遇到下一个引物或冈崎片段为止。
由RNA酶H降解RNA引物并由DNA聚合酶 I 将缺口补齐，再由DNA连接酶将每两个冈崎片段连在一起形成大分子DNA.。
1.解链酶(helicase,unwinding enzyme)复制叉的形成则是由多种蛋白质及酶参与的较复杂的复制过程。
在DNA不连续复制过程中，结合于复制叉前面，在起始点处解开双链，反应是在解链酶的催化下进行的。
解链酶有ATP酶活性的酶，两种活性相互偶联，通过水解ATP提供解链的能量。
解链酶的作用就是打开DNA双链之间的氢键。
解链酶分解ATP的活性依赖于单链DNA的存在。
如果双链DNA中有单链末端或切口，则DNA解链酶可以首先结合在这一部分，然后逐步向双链方向移动。
DNA拓扑异构酶概述
DNA拓扑异构酶综述摘要：DNA拓扑异构酶为催化DNA拓扑学异构体相互转变的酶之总称，是一种见于真核细胞和原核细胞中的重要生物酶，其对DNA转录、复制、染色体分离及基因表达等过程中的DNA 拓扑结构起着重要的调控作用。
研究发现，与正常细胞不同，DNA 拓扑异构酶在肿瘤细胞中表现出不受其他因素影响的高水平表达，而许多抗肿瘤药物的作用机制也与DNA拓扑异构酶密切相关，因此它作为抗肿瘤药物的重要靶点引起了研究者的广泛关注。
此外，科学家们还发现拓扑异构酶在神经发育调节上也起着一定的作用，虽然机制还需要进一步研究，但这一发现就有着重要意义。
本文对DNA拓扑异构酶的反应、结构、分类及生物功能进行了简要的归纳，介绍了DNA拓扑异构酶抑制剂的研究及分类，并对拓扑异构酶在其他方面上的进展进行了简单的介绍。
关键词：DNA拓扑异构酶拓扑异构酶抑制剂抗肿瘤药物生物功能DNA拓扑异构酶（topoisomerase）调控DNA超螺旋状态，它是存在于细胞核内的一类酶，参与DNA复制、重组、转录、修复等核内关键作用，它们能够催化DNA链的断裂和结合，从而影响DNA的拓扑状态。
真核细胞的拓扑结构由两种关键拓扑异构酶拓扑异构酶I和拓扑异构酶II调节，拓扑异构酶I通过形成短暂的单链裂解-结合循环，催化DNA复制的拓扑异构状态的变化；相反，拓扑异构酶II通过引起瞬间双链酶桥的断裂，然后打通和再封闭，以改变DNA的拓扑状态。
哺乳动物中，拓扑异构酶II又可以分为αII型和βII型。
拓扑异构酶的应用也很广泛，如现已知这些酶是很多抗肿瘤药物的细胞内靶酶，在肿瘤细胞中，拓扑异构酶的含量高于正常细胞，所以以其为靶点的抑制具有一定特异性，因此对它的研究也越来越重视。
1、DNA拓扑异构酶 I拓扑异构酶I催化DNA链的断裂和重新连接，每次只作用于一条链，即催化瞬时的单链的断裂和连接，它们不需要能量辅因子如ATP或NAD。
E.coliDNA拓扑异构酶I又称ω蛋白，大白鼠肝DNA拓扑异构酶I又称切刻-封闭酶(nicking-closing enzyme )。
第三章 DNA复制
D-环型
滚环型
单林娜 制作
27
第三节 DNA复制的酶学
(Enzymology of DNA Replication)
一、复制中解链与DNA分子的拓扑学变化
与DNA几何学性质相关的酶
1.拓扑异构酶 (topoisomerase)
DNA复制时松弛超螺旋，以利复制叉
的行进及DNA合成，合成后再使其恢 复成超螺旋。
2、复制方向（复制过程的顺序性） 复制叉（Replication fork）：染色体中参与复制的活 性区域，即复制正在发生的位点 复制眼（replication eye）：电子显微镜下观察正在复制的DNA， 复制的区域形如一只眼睛
复制眼：在一个长的未复制区域内DNA已经复制的区域
真核生物的多复制子 多个复制眼
底物－－dNTP
Poly(核苷酸)n－3’-OH ＋ dNTP OH
→ Poly(核苷酸)n+1－3’＋ 2Pi
大肠杆菌DNA聚合酶（3种）
三种DNA聚合酶的结构和功能
DNA pol
5´3´的聚合作用，合成20个核苷酸即离
开模板
3´5´外切酶活性
5´3´外切酶活性
去除RNA引物，校正错误，修复损伤
条链并不同时进行复 制，轻链先开始复制，
稍后重链再开始复制， 当复制沿轻链开始时， 重链上产生了D环，随 环形轻链复制的进行， D环增大，重链后亦开 始复制，最后两条链 完成复制形成两条新 的DNA双螺旋。 线粒 体和叶绿体 DNA的 复制方式
（3）共价延伸方式(covalence
elongation）或滚环式复制
DNA pol Ⅲ 功能
5´3´的聚合作用（α亚基） 3´5´外切酶活性（ε亚基） 在DNA复制中主要作用
dna复制
为什么需要有RNA引物来引发DNA复制呢?这可能尽量减少DNA复制起始处的突变有关。DNA复制开始处的几个核苷酸最容易出现差错，因此，用RNA引物即使出现差错最后也要被DNA聚合酶Ⅰ切除，提高了DNA复制的准确性。RNA引物形成后，由DNA聚合酶Ⅲ催化将第一个脱氧核苷酸按碱基互补原则加在RNA引物3'-OH端而进入DNA链的延伸阶段。
在研究痘病毒复制时，发现了线性DNA分子完成末端复制的第二种方式。痘病毒DNA在两端都形成发夹环状结构。DNA复制时，在线性分子中间的一个复制起点开始，双向进行，将发夹环状结构变成双链环状DNA。然后，在发夹的中央将不同DNA链切开，使DNA分子变性，双链分开。这样，在每个分子两端形成一个单链尾端要以自我互补，形成完整的发夹结构，与亲代DNA分子一样。在真核生物染色体线性DNA分子复制时，尚不清楚末端的复制过程是怎样进行的。也可能像痘病毒那样形成发夹结构而进行复制。但最近的实验表明，真核生物染色体末端DNA复制是由一种特殊的酶将一个新的末端DNA序列加在刚刚完成复制的DNA末端。这种机制首先在四膜虫中发现。该生物细胞的线性DNA分子末端有30-70拷贝的5'TTGGGG3'序列，该细胞中存在一种酶可以将TTGGGG序列加在事先已存在的单键DNA末端的TTGGGG序列上。这样有较长的末端单链DNA，可以被引物酶重新引发或其他的酶蛋白引发而合成RNA引物，并由DNA聚合酶将其变成双链DNA。这样就可以避免其DNA随着复制的不断进行而逐渐变短。
按上述DNA复制的机制，在复制叉附近，形成了以两套DNA聚合酶Ⅲ全酶分子、引发体和螺旋构成的类似核糖体大小的复合体，称为DNA复制体(replisome)。复制体在DNA前导链模板和滞后链模板上移动时便合成了连续的DNA前导链和由许多冈崎片段组成的滞后链。在DNA合成延伸过程中主要是DNA聚合酶Ⅲ的作用。当冈崎片段形成后，DNA聚合酶Ⅰ通过其5'→3'外切酶活性切除冈崎片段上的RNA引物，同时，利用后一个冈崎片段作为引物由5'→3'合成DNA。最后两个冈崎片段由DNA连接酶将其接起来，形成完整的DNA滞后链。
DNA的复制和逆转录
C
G
C
G
A
T
C
G
T
A
G
C
G
C
复制过程中形成的复制叉
AT
GC
GC
TA
AT
CG
TA
GC
CG
CG
+
AT
CG
TA
GC
GC
AT GC GC TA AT CG TA GC CG CG AT CG TA GC GC
子代DNA
子链继承母链遗传信息的几种可能方式:
全保留式
半保留式
混合式
密度梯度实验:
通用名
DnaA (dnaA) DnaB (dnaB) DnaC (dnaC)
解螺旋酶
DnaG (dnaG)
引物酶
SSB
单链DNA
结合蛋白
拓扑异构酶 (gyrA, B)
功能 辨认起始点 解开DNA双链 运送和协同DnaB 催化RNA引物生成 稳定已解开的单链
理顺DNA链
➢ 解螺旋酶(helicase) ——利用ATP供能，作用于氢键，使DNA双链解开成为两条单链。 ➢ 引物酶(primase) ——复制起始时催化生成RNA引物的酶。 ➢ 单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) ——在复制中维持模板处于单链状
➢ DNA-pol Ⅱ（120kD）
• DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。 • DNA-pol Ⅱ对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因
此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复。
DNA聚合酶Ⅲ全酶结构 多聚体不对称多亚基二聚体
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
引物(primer): 提供3 -OH末端使dNTP可以依次聚合
其他的酶和蛋白质因子
(dNMP)n + dNTP → (dNMP)n+1 + PPi
一、DNA聚合酶催化脱氧核苷酸间的聚合
全称：依赖DNA的DNA聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase)
简称：DNA-pol 活性：
功能：
对复制中的错误进行校读， 对复制和修复中出现的空 隙进行填补
N端
DNA-pol Ⅰ 木瓜蛋白酶C端Fra bibliotek小片段
323个氨基酸 5 核酸外切酶活性
大片段/Klenow 片段
604个氨基酸 DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性 • Klenow片段是实验室合成DNA，进行 分子生物学研究中常用的工具酶
起始引发，有引物酶活性
参与低保真度的复制 在线粒体DNA复制中起催化作用 合成后随链 合成前导链
真核生物和原核生物DNA聚合酶的比较
E.Coli
Ⅰ Ⅱ 真核细胞 功能 填补复制中的DNA空隙，DNA修复和重组 复制中的校对，DNA修复
Ⅲ
DNA修复
线粒体DNA合成 前导链合成
DnaG
引物酶
第二节
DNA复制的酶学和拓扑学
Enzymology and topology of DNA replication
参与DNA复制的物质:
底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP
聚合酶(polymerase): 依赖DNA的DNA聚合酶，简写为 DNA-pol 模板(template): 解开成单链的DNA母链
（二）聚合酶中的核酸外切酶活性在复制中 辨认切除错配碱基并加以校正
核酸外切酶(exonuclease)是指能从核酸链的末端把核苷酸依次水解出来的 酶，外切酶是有方向性的
DNA pol Ⅰ的校 读功能
A：DNA-pol的外切酶活性切除 错配碱基；并用其聚合活性掺 入正确配对的底物 B：碱基配对正确， DNA-pol不 表现活性
后随链合成
真核生物的DNA聚合酶
DNA-pol
分子量（kD） 5’3’聚合活性
3’5’核酸外切 酶活性
16.5 中
4.0 ？
14.0 高
12.5 高
25.5 高
-
-
+
+
+
功能
起始引发， 低保真度的复 引物酶活性 制
线粒体DNA 复制
合成后随链
合成前导链
二、DNA聚合酶的碱基选择和校对功能
-复合物由6种亚基组成：、、、、、
2 个 - 亚基分别和 1 个核心酶相互作用， 其柔性连接区可以确保在复制叉 1个全酶分子 的2个核心酶能够相对独立运动，分别负责合 成前导链和后随链 功能：有促进全酶组装至模板上及增强核心酶 活性的作用
DNA-pol Ⅰ（109kD）:
（一）原核生物有3种DNA聚合酶
DNA-pol Ⅰ
DNA-pol Ⅱ DNA-pol Ⅲ
原核生物的DNA聚合酶
DNA-pol Ⅰ 分子量（kD） 组成 109 单肽链 DNA-pol Ⅱ 120 ？ DNA-pol Ⅲ 250 多亚基不对称二聚体
分子数/细胞
5’3’核酸外切酶活性 基因突变后的致死性
1. 5’3’的聚合活性
2. 核酸外切酶活性
核酸外切酶活性:
5´
AG C T T C A G G A T A
3´
| | | | | | | | | | |
3´
?
5´
T C G AA G T C C T A G C G A C
3’5’外切酶活性: 能辨认错配的碱基对，并将其水解 5’3’外切酶活性: 能切除突变的 DNA片段
DNA-pol Ⅱ（120kD）: DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活 DNA-pol Ⅱ对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的DNA模
板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与DNA损伤的应
急状态修复
（一）常见的真核细胞DNA聚合酶有5种
DNA-pol
DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol
400
有 可能
？
无 不可能
20
无 可能
DNA聚合酶Ⅲ全酶结构:
全酶结构包括：
•２个核心酶 •1个-复合物（、、 、、、 6种亚 基） •1对-亚基（可滑动 的DNA夹子）
核心酶由、和亚基组成： 亚基（130 000）主要功能是合成DNA 亚基具有35外切酶活性（复制保真性 所必需）亚基可增强其活性 亚基可能起组装作用 两侧的β 亚基发挥夹稳DNA模板链，并使酶沿模 板滑动的作用
DNA复制的保真性至少要依赖三种机制:
遵守严格的碱基配对规律 聚合酶在复制延长时对碱基的选择功能
复制出错时有即时校对功能
（一）复制的保真性依赖正确的碱基选择
利用“错配”实验发现，DNA pol Ⅲ对核苷酸的参入 （incorporation）具有选择功能 DNA pol Ⅲ对不同构型糖苷键表现不同亲和力，因此实 现其选择功能