安捷伦液相色谱柱的选择与保养ppt课件
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安捷伦液相色谱仪讲座 ppt课件
安捷伦科技液相色谱基本维护故障诊断交 流讲座
1100 HPLC Maintenance & Troubleshooting
Agilent 1100系列HPLC 工作原理 日常维护 故障诊断 技术支持＆服务流程
安捷伦科技有限公司 生命科学与化学分析仪器部
2
1100 HPLC Maintenance & Troubleshooting
13
Agilent 1100 四元泵 (G1311A)
14
Agilent 1100 四元泵工作原理
15
Agilent 1100 泵
Agilent 1100 泵头(Pump Head)结构图
16
Agilent 1100 泵头(Pump Head)结构图
Pump head screws
17
Agilent 1100 泵头(Pump Head)结构图
Agilent 1100系列密封垫冲洗－Seal Wash ( 可选)
Washer
Seal
Support seal assembly
当流动相中盐浓度>0.01M时，可以 减小密封垫的磨损。 对于Agilent 1100系列泵为可选件 。 用10%异丙醇水溶液冲洗
20
带有Seal Wash的泵头结构图
脱气机的操作：操作泵之前，用至少两个体积（标准脱气
机30ml，对微脱气机10ml）冲洗 真空脱气机，特别是当 泵关闭了一段时间后（例如，过夜），以及在通道中使用 挥发性混合溶剂 时。
标准脱气机（G1322A).
标准脱气机每个通道体积为12ml 建议排液操作：5ml/min 排液6min以上。
微脱气机（G1379A).
1100 HPLC Maintenance & Troubleshooting
Agilent 1100系列HPLC 工作原理 日常维护 故障诊断 技术支持＆服务流程
安捷伦科技有限公司 生命科学与化学分析仪器部
2
1100 HPLC Maintenance & Troubleshooting
13
Agilent 1100 四元泵 (G1311A)
14
Agilent 1100 四元泵工作原理
15
Agilent 1100 泵
Agilent 1100 泵头(Pump Head)结构图
16
Agilent 1100 泵头(Pump Head)结构图
Pump head screws
17
Agilent 1100 泵头(Pump Head)结构图
Agilent 1100系列密封垫冲洗－Seal Wash ( 可选)
Washer
Seal
Support seal assembly
当流动相中盐浓度>0.01M时，可以 减小密封垫的磨损。 对于Agilent 1100系列泵为可选件 。 用10%异丙醇水溶液冲洗
20
带有Seal Wash的泵头结构图
脱气机的操作：操作泵之前，用至少两个体积（标准脱气
机30ml，对微脱气机10ml）冲洗 真空脱气机，特别是当 泵关闭了一段时间后（例如，过夜），以及在通道中使用 挥发性混合溶剂 时。
标准脱气机（G1322A).
标准脱气机每个通道体积为12ml 建议排液操作：5ml/min 排液6min以上。
微脱气机（G1379A).
液相色谱柱的应用-PPT
—H2O”，由于乙腈的毒性大，价格贵，通常优先考虑
“甲醇—H2O”流动相。
2. 正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序是：
正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜异丙醇
最常用的是正已烷，
不同混合溶剂的粘度比较
柱填料基质
高pH下, 硅胶会溶解
低pH下, 键合相会断裂
化学修饰困难
孔结构复杂, 孔径不均匀，
导致柱效不够高, 有机溶剂
衡状态, 对于梯度淋洗尤为重要
孔径 --- 对色谱分离的影响
大孔的填料颗粒可以延长溶质大分子在填
料表面滞留的时间, 达到充分分离, 改善
峰形
样品 MW 2, 000, 选择 100Å 的孔径
样品 MW > 2, 000, 选择 300Å 的孔径
比表面积的比较
比表面积与孔径的影响
大孔径填料适用于大分子分析
移动速率不一样，从而产生色谱分离。
(必要条件)
分配过程
分配系数 - K
K=
CS
Cm
K= 常数
（T恒定）
Cm =组分在流动相中的浓度
Cs = 组分在固定相中的浓度
容量因子k
是指在一定条件下，组分在两相间达到分配平衡时的质量比。
在实际工作中，常应用另一表征色谱分配平衡过程的重要参数——
容量因子(capacity factor)，也称分配比(partition ratio)，以 k 表示。
色谱柱的构造
柱填料：
液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之
间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。常用
颗粒粒径在3—10 µm的范围内。
正相柱：多以硅胶为柱填料。另一类正相填料是
硅胶表面键合—CN，-NH2等官能团即所谓的键合
“甲醇—H2O”流动相。
2. 正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序是：
正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜异丙醇
最常用的是正已烷，
不同混合溶剂的粘度比较
柱填料基质
高pH下, 硅胶会溶解
低pH下, 键合相会断裂
化学修饰困难
孔结构复杂, 孔径不均匀，
导致柱效不够高, 有机溶剂
衡状态, 对于梯度淋洗尤为重要
孔径 --- 对色谱分离的影响
大孔的填料颗粒可以延长溶质大分子在填
料表面滞留的时间, 达到充分分离, 改善
峰形
样品 MW 2, 000, 选择 100Å 的孔径
样品 MW > 2, 000, 选择 300Å 的孔径
比表面积的比较
比表面积与孔径的影响
大孔径填料适用于大分子分析
移动速率不一样，从而产生色谱分离。
(必要条件)
分配过程
分配系数 - K
K=
CS
Cm
K= 常数
（T恒定）
Cm =组分在流动相中的浓度
Cs = 组分在固定相中的浓度
容量因子k
是指在一定条件下，组分在两相间达到分配平衡时的质量比。
在实际工作中，常应用另一表征色谱分配平衡过程的重要参数——
容量因子(capacity factor)，也称分配比(partition ratio)，以 k 表示。
色谱柱的构造
柱填料：
液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之
间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。常用
颗粒粒径在3—10 µm的范围内。
正相柱：多以硅胶为柱填料。另一类正相填料是
硅胶表面键合—CN，-NH2等官能团即所谓的键合
HPLC安捷伦高效液相使用维护常见问题PPT课件
启动液相色谱仪器的流程
流动相冲洗系统
水相走A、D泵，有机 相走B、C泵，可防止
缓冲盐析出
流动相配制后，先使用过滤装置过滤，然后超声15min，排除气泡干扰。流速 1ml/min，使用流动相冲洗系统至少30min，待基线平稳即可进行下一步操作。
进样测定 具体操作如下：点击“序列”-“序列表”-输入相关信息确定（样品瓶、样品 名称、方法名称-TEST、进样次数、进样量）-“开始序列”。待进样结束后， 进行下一步操作。 注意：在进样前，最好用100%甲醇进行洗针，以防进样针中残留的其它样品 影响实验结果。
稳定性考察： 取同一份供试品溶液，分别于不同时间进样测定（如0、2、4、6、8、10、12、 24h）。
HPLC色谱柱
数据处理系统
自动进样器 色谱泵
检测器
废液
第5页/共42页
一些商品化仪器
流动相
脱气装置
四元泵
样品盘 柱温箱 检测器
第6页/共42页
溶剂
棕色玻璃瓶会避免藻类的生长。 经常过滤溶剂以免其中微粒永久性阻塞毛细管。
第7页/共42页
启动液相色谱仪器的流程
开启HPLC系统各个设备的电源
打开泵、自动进样器、检测器电源，打开计算机启动 “1260联机工作站”，待
标准加样回收---已知浓度样品中加入药品
数据要求： 在规定范围内，至少用9个测定结果
进行评价。例如，设计3个不同浓度，每个 浓度各分别制备3份供试品溶液，进行测定。
第27页/共42页
分析方法的建立及验证
绝对回收率=提取回收率/（1－基质效应），HPLC中基质效应为0 1.绝对回收率=提取回收率=萃取回收率，是用药品加血浆经萃取处理后的进 样峰面积除以该药品溶液直接进样峰面积的比值，一般来说，该比值不可能 超过100%，能做到80%就不错了。以前国家对绝对提取率还有些要求，现在 随着lc-ms的应用，最低定量限已经能做到很低，也就不需要再对绝对回收率 提具体要求，只要相对回收率满意就可以。--生物样品：用于筛选提取溶剂， 可以低但要稳定 2.相对回收率=方法学回收率，是血浆处理后的进样峰面积代入血浆标准曲 线，计算所得浓度除以真实血样浓度.该比值在100%左右.一般要求高、中浓 度点在15%以内，低浓度点可适当放宽。--内标的相对回收率值与绝对回收 率要求类似 (1)举例：10ng A药加入1ml空白血浆（10ng/ml），经萃取处理后用0.5ml流动 相复溶，进样所得峰面积8000;配制对照溶液（浓度10ng/0.5ml=20ng/ml）， 进样所得峰面积假设为10000.那么萃取回收率为8000/10000=80%.
常用液相色谱柱原理及使用与维护保养PPT
优化方法
2
流动相浓可最大化柱的分离效率。
3
其他因素
流动相配比、pH、缓冲剂的选择和添加 等因素对柱的影响合理控制以保证柱的 寿命和效能。
液相色谱柱的使用注意事项
避光
溶剂、样品和固定相种类不同、pH值不同时，柱的影响因素也不同。
柱后系统
在固定相的保护下避免混杂污染，需要定期清洗、维护流动相使其稳定。
常见的液相色谱柱材料
C1 8固定相
极佳的耐水性和极性选择性， 强了解对齐作用，能保留并分 离大部分非极性化合物。
C8固定相
与C18固定相类似，但对一些极 性化合物有更强的亲和力。
C4固定相
针对较为极性的化合物进行的 分离，一般用于富集和预分离。
液相色谱柱的选择与优化
1
选柱原则
分析物性质、柱材选用、固定相浓度、
样品处理
避免样品中有颗粒物、化合物堵塞缓冲期、流量计、检测器等器件。
液相色谱柱的维护保养方法
1
固定相的重新平衡
柱使用一段时间之后，固定相会逐渐老
流动相的定期更换
2
化，出现问题时，需要进行反相和正相 清洗。
某些流动相在特定条件下会出现化学变
化，影响柱的使用寿命。
3
柱的收纳和储存注意事项
需要在避光、低湿度、适温、无异味的 环境下进行柱的存储。
常见的色谱柱问题和解决方案
柱子变脏
提示柱子可能有混杂物污染，可 以考虑使用反相柱或者…
柱子漏液
可能是管接口关系不太紧密或者 管道盲板故障，可以检查密封情 况。
柱子分离效率低
建议从固定相性质、流动相配比、 检测器选择等多方面考虑优化。
离子交换柱
离子柱是选择性分离离子混合 物的有用工具。
安捷伦HPLC色谱柱选择与色谱柱维护保养ppt文档
机溶剂可能导致聚合物基质溶涨而受损
C-18柱---性能影响因素
物理性质
•硅胶纯度 •色谱柱尺寸 •颗粒形状 •粒径 •表面积 •孔径
•键合类型 化学性质 •碳覆盖率
•封端
C-18柱---性能影响因素
色谱柱物理性质
硅胶纯度
• 填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度
色谱柱尺寸
• 填料床的长度和内径
颗粒形状
检测器: UV 282 nm
H3C
HO
O O CH2
H3C O
OCH3 OCH3
CH2 O
CH2
HOH3C N CH3
O O
OH
O CH3
O
SB-C3
CH3
Tylosin(泰乐菌素)
孔径
80A & 300A
ZORBAX Rx 多孔硅胶微球
粒径
1.8 µm 3.5 µm 5.0 µm 7.0 µm
安捷伦拥有此项溶胶-凝胶填料专利技术
C-18柱---性能影响因素
色谱柱尺寸 --- 对色谱分离的影响
• 短柱 (15-100mm) - 运行时间短, 柱压低 • 长柱 (150-250mm) - 分辨率高, 运行时间长
ZORBAX Rx-Sil (1987) 由于金属含量低, 硅羟基pKa高, 碱性化合物不发生拖尾
二氧化硅 Zorbax Rx-SIL Zorbax SIL Nucleosil Hypersil nd = 未检出
金属浓度（ppm) Na K Mg Al Ca Ti Fe Zr Cu Cr Zn 10 < 3 4 1.5 2 nd 3 nd nd nd 1 17 nd nd 57 9 32 21 88 < 1 nd 88 56 N/ A N/ A nd 130 57 76 nd N/ A N/ A nd 2900 N/ A 40 300 38 65 230 N/ A N/ A N/ A N/ A
C-18柱---性能影响因素
物理性质
•硅胶纯度 •色谱柱尺寸 •颗粒形状 •粒径 •表面积 •孔径
•键合类型 化学性质 •碳覆盖率
•封端
C-18柱---性能影响因素
色谱柱物理性质
硅胶纯度
• 填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度
色谱柱尺寸
• 填料床的长度和内径
颗粒形状
检测器: UV 282 nm
H3C
HO
O O CH2
H3C O
OCH3 OCH3
CH2 O
CH2
HOH3C N CH3
O O
OH
O CH3
O
SB-C3
CH3
Tylosin(泰乐菌素)
孔径
80A & 300A
ZORBAX Rx 多孔硅胶微球
粒径
1.8 µm 3.5 µm 5.0 µm 7.0 µm
安捷伦拥有此项溶胶-凝胶填料专利技术
C-18柱---性能影响因素
色谱柱尺寸 --- 对色谱分离的影响
• 短柱 (15-100mm) - 运行时间短, 柱压低 • 长柱 (150-250mm) - 分辨率高, 运行时间长
ZORBAX Rx-Sil (1987) 由于金属含量低, 硅羟基pKa高, 碱性化合物不发生拖尾
二氧化硅 Zorbax Rx-SIL Zorbax SIL Nucleosil Hypersil nd = 未检出
金属浓度（ppm) Na K Mg Al Ca Ti Fe Zr Cu Cr Zn 10 < 3 4 1.5 2 nd 3 nd nd nd 1 17 nd nd 57 9 32 21 88 < 1 nd 88 56 N/ A N/ A nd 130 57 76 nd N/ A N/ A nd 2900 N/ A 40 300 38 65 230 N/ A N/ A N/ A N/ A
安捷伦液相色谱仪PPT优秀课件
3
仪器参数设定
•开始编辑完整方法 •泵参数设定自动进样器设定 •柱温箱、检测器设定
2021/6/3
4
素据分析 •双击仪器一脱机 •选择调用数据 •积分 •打印报告
2021/6/3
5
关机
•关机前，先关灯 •退出工作站，依次关其它模块 电源 •关闭计算机
2021/6/3
6
关于高效液相操作的相关知识
出现无规律色谱峰可能是一些残留在柱中的物质 被洗脱出来。
保留时间不重复原因可能是柱内条件变化，流动 相洗脱不完全，柱温变化等。
2021/6/3
12
谢集整 理而来，供大家参考，
感谢您的关注！
流动相
1、 流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水，酸碱液 及缓冲液需经过滤后使用，过滤时注意区分水系膜和油 系膜的使用范围；
2、 水相流动相需经常更换（一般不超过2天），防止长 菌变质；
3、 使用双泵时，A、B、C、D四相中，若所用流动相中 有含盐流动相，则A、D（进液口位于混合器下方）放置 含盐流动相，B、C（进液口位于混合器上方）放置不含 盐流动相； A、B、C、D四个储液器中其中一个为棕色 瓶，用于存放水相流动相。
太原市医达维科医药科技开发有限公 司
高效液相使用方 法
2021/6/3
1
使用方法
进样前准备
开机
仪器参数设定 数据分析告 打印数据报告 关机
HPLC使用方法
2021/6/3
2
开机
• 打开电脑 • 打开液相各模板电源（等待仪器
自检） • 双击仪器一联机 • 脱气（旋开冲气阀----设计流速）
2021/6/3
2021/6/3
10
关于高效液相操作可能出现情况分析
安捷伦HPLC色谱柱选择与色谱柱维护保养67页PPT
谢谢你的阅读
❖ 知识就是财富 ❖ 丰富你的人生
71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——
31、别人笑我太疯癫，我笑他人看不 穿。(名 言网) 32、我不想听失意者的哭泣，抱怨者 的牢骚 ，这是 羊群中 的瘟疫 ，我不 能被它 传染。 我要尽 量避免 绝望， 辛勤耕 耘，忍 受苦楚 。我一 试再试 ，争取 每天的 成功， 避免以 失败收 常在别 人停滞 不前时 ，我继 续拼搏 。
33、如果惧怕前面跌宕的山岩，生命 就永远 只能是 死水一 潭。 34、当你眼泪忍不住要流出来的时候 ，睁大 眼睛， 千万别 眨眼!你会看到 世界由 清晰变 模糊的 全过程 ，心会 在你泪 水落下 的那一 刻变得 清澈明 晰。盐 。注定 要融化 的，也 许是用 眼泪的 方式。
35、不要以为自己成功一次就可以了 ，也不 要以为 过去的 光荣可 以被永 远肯定 。
Agilent液相色谱柱的选择与日常维护
•ODS柱都是一样的吗？
•硅胶类型： 不定形硅胶，球形硅胶 柱容量，充填均匀度
•硅胶纯度： 金属含量，填料酸性
峰形
•填料颗粒尺寸：粒径大小分布，均匀度 充填均匀度，流速相关性
•填料孔径： 7～12nm，30nm
适用的化合物分子量范围
•键合密度： 含碳量
容量因子，保留时间
•键合方式： 键合相修饰
选择性，水性流动相的耐受性
Ø最高的分离效率 Ø更加可靠的长期性能可以广 泛应用于QA/QC
New!
•致密键合 •双封端 •不同粒径 – 1.8, 3.5, 5um
•坚固的硅胶基质 •快速及超快速分离
•对于所有样品都有较好的
峰形
•专利技术 •完整的质控过程 –
•方法开发的首要选择
Eclipse XDB
ØC18, C8, 苯基, CN Ø对于快速方法开发有很广泛 的应用谱图库 Ø多种色谱柱规格，从毛细柱 到制备柱 Ø 使用1.8um 颗粒实现快速有 效的方法转化
•柱填料量： 柱床实密性
柱容量
•封端技术： 屏蔽硅醇基，二次化学平衡 峰形，选择性
•pH适用范围
2006-11-30
22
Page 22
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ZORBAX 不同色谱柱的选择性
Zorbax SB C18( 150*4.6mm, 5um) USP Tailing: 1.157 Plates:8463
青果丸
色谱柱：Zorbax SB C18, 4.6×250mm, 5µm 流动相：甲醇-0.36%磷酸溶液（43:57）
16.171
mAU 50
40
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Agilent Technologies
13页
大孔径填料适用于大分子分析
* 大孔径300Å 全多孔色谱柱
可用于分离蛋白质和多肽 分子量虽小但hydrodynamic volume(水动力学体积)较大的分子
* Poroshell 色谱柱
高流速下, 高柱效分析大分子的蛋白质和多肽
色谱柱填料孔径必须适合 待测物分子自由进出填料 孔, 与孔内表面的键合相 进行分离分配
• 窄径柱 ( 2.1mm) - 检测器灵敏度高 • 宽径柱 (3-21.2mm) - 载样量高
Agilent Technologies
11页
C-18柱---性能影响因素
颗粒形状 --- 对色谱分离的影响
当使用黏度较大的流动相50:50=MeOH:H2O时, 球型颗粒可以降低柱压, 延长色谱柱寿命
Agilent Technologies
7页
C-18柱---性能影响因素
色谱柱化学性质
键合类型
• 单体键合 - 键合相分子与基体单点相连 • 聚合体键合 - 键合相分子与基体多点相连
碳覆盖率
• 与基体物质相连的键合相的量
封端
• 键合步骤之后, 用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起 来
Agilent Technologies
甲醛CH2O
D 250oC O2
孔径
80A & 300A
ZORBAX Rx 多孔硅胶微球
粒径
1.8 µm 3.5 µm 5.0 µm 7.0 µm
安捷伦拥有此项溶胶-凝胶填料专利技术
Agilent Technologies
C-18柱---性能影响因素 10页
色谱柱尺寸 --- 对色谱分离的影响
• 短柱 (15-100mm) - 运行时间短, 柱压低 • 长柱 (150-250mm) - 分辨率高, 运行时间长
反相分配色谱
极性:固定相 < 流动相
固定相 - 非极性 流动相(甲, 乙醇, 乙腈, THF, 二氯乙烷)- 极性 非极性物质后出峰
Agilent Technologies
柱填料基质
4页
高或低pH下, 硅胶会溶解 • 硅胶基质- pH 3~8 化学修饰困难 • Al2O3 . nH2O - pH1~14
高表面积对于多组份样品的分离具有较强的保 留能力, 柱容量和分离度. 表面积低的填料通 常能迅速达到平衡状态, 对于梯度淋洗尤为 重要
孔径 --- 对色谱分离的影响
大孔的填料颗粒可以延长溶质大分子在填料表面滞 留的时间, 达到充分分离, 改善峰形
样品 MW 4, 000, 选择 80Å 的孔径 样品 MW > 4, 000, 选择 300Å 的孔径
孔结构复杂, 孔径不均匀导致柱效不够高, 有• 聚合物基质 - pH1~14
机溶剂可能导致聚合物基质溶涨而受损
Agilent Technologies
C-18柱---性能影响因素 5页
物理性质
•硅胶纯度 •色谱柱尺寸 •颗粒形状 •粒径 •表面积 •孔径
•键合类型 化学性质 •碳覆盖率
•封端
Agilent Technologies
6页
C-18柱---性能影响因素
色谱柱物理性质
硅胶纯度
• 填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度
色谱柱尺寸
• 填料床的长度和内径
颗粒形状
• 球型或不规则型
粒径
• 平均颗粒直径, 通常3-10µm
表面积
• 颗粒外表面和内部孔表面的总和, 以m2/gram表示
孔径
• 颗粒的孔或腔的平均尺寸, 范围80-300Å
球形
粒径 --- 对色谱分离的影响
较小的颗粒柱效较高, 但会引起柱压过高. 3.5µm粒径的常用于分离复杂的多组份样品, 而组份单一的样品多采用5µm的粒径
不规则形
1.8µm 3.5µm
5µm
Agilent Technologies
7µm
10µm
12页
C-18柱---性能影响因素
表面积 --- 对色谱分离的影响
8页
C-18柱---性能影响因素
A类硅胶
Original ZORBAX SIL (1970s) 由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表 面上金属含量高 (硅羟基的pKa低), 导致碱性化合物发生拖尾
B类硅胶 (高纯)
ZORBAX Rx-Sil (1987) 由于金属含量低, 硅羟基pKa高, 碱性化合物不发生拖尾
Agilent Technologies
14页
300Å 孔径可改善蛋白质和多肽峰形
选择合适的 填料孔径分析 大分子可获得
最佳峰形
PW 1/2
孔径, 分子量对峰宽的影响(梯度分离)
Zorbax Rx-SIL: 11种金属< 35 ppm (未检出其他杂质, <1ppm); 99.995% 纯度的二氧化硅
Agilent Technologies
ZORBAX®生产工艺
9页
• StableBond • Eclipse XDB • Bonus-RP • Extend
硅胶 +
脲 (pH=2) +
抑制电离反相键合相色谱
样品
分子量>2, 000
溶于有机溶剂 溶于水
离子化
Agilent Technologies
离子对键合相的反相模式
用硅胶的正相模式 离子交换模式 凝胶渗透色谱 凝胶过滤色谱
大孔填料的离子交换模式 用大孔填料的反相模式
正相 &反相色谱
3页
正相吸附色谱
极性:固定相 > 流动相
固定相 - 极性 流动相(己烷, 庚烷)- 非极性 极性物质后出峰
二氧化硅 Zorbax Rx-SIL Zorbax SIL Nucleosil Hypersil nd = 未检出
金属浓度（ppm) Na K Mg Al Ca Ti Fe Zr Cu Cr Zn 10 < 3 4 1.5 2 nd 3 nd nd nd 1 17 nd nd 57 9 32 21 88 < 1 nd 88 56 N/ A N/ A nd 130 57 76 nd N/ A N/ A nd 2900 N/ A 40 300 38 65 230 N/ A N/ A N/ A N/ A
Sa
1页
安捷伦科技
HPLC色谱柱选择与维护保养
Agilent Technologies
分离模式的选择
溶于正己烷
2页 用硅机溶剂 分子量<2, 000
溶于水
溶于甲醇或甲醇/水 或乙腈或乙腈/水
溶于四氢呋喃
非离子化
用键合相的反相模式 用键合相的反相模式 低分子凝胶渗透色谱 用键合相的反相模式
13页
大孔径填料适用于大分子分析
* 大孔径300Å 全多孔色谱柱
可用于分离蛋白质和多肽 分子量虽小但hydrodynamic volume(水动力学体积)较大的分子
* Poroshell 色谱柱
高流速下, 高柱效分析大分子的蛋白质和多肽
色谱柱填料孔径必须适合 待测物分子自由进出填料 孔, 与孔内表面的键合相 进行分离分配
• 窄径柱 ( 2.1mm) - 检测器灵敏度高 • 宽径柱 (3-21.2mm) - 载样量高
Agilent Technologies
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C-18柱---性能影响因素
颗粒形状 --- 对色谱分离的影响
当使用黏度较大的流动相50:50=MeOH:H2O时, 球型颗粒可以降低柱压, 延长色谱柱寿命
Agilent Technologies
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C-18柱---性能影响因素
色谱柱化学性质
键合类型
• 单体键合 - 键合相分子与基体单点相连 • 聚合体键合 - 键合相分子与基体多点相连
碳覆盖率
• 与基体物质相连的键合相的量
封端
• 键合步骤之后, 用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起 来
Agilent Technologies
甲醛CH2O
D 250oC O2
孔径
80A & 300A
ZORBAX Rx 多孔硅胶微球
粒径
1.8 µm 3.5 µm 5.0 µm 7.0 µm
安捷伦拥有此项溶胶-凝胶填料专利技术
Agilent Technologies
C-18柱---性能影响因素 10页
色谱柱尺寸 --- 对色谱分离的影响
• 短柱 (15-100mm) - 运行时间短, 柱压低 • 长柱 (150-250mm) - 分辨率高, 运行时间长
反相分配色谱
极性:固定相 < 流动相
固定相 - 非极性 流动相(甲, 乙醇, 乙腈, THF, 二氯乙烷)- 极性 非极性物质后出峰
Agilent Technologies
柱填料基质
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高或低pH下, 硅胶会溶解 • 硅胶基质- pH 3~8 化学修饰困难 • Al2O3 . nH2O - pH1~14
高表面积对于多组份样品的分离具有较强的保 留能力, 柱容量和分离度. 表面积低的填料通 常能迅速达到平衡状态, 对于梯度淋洗尤为 重要
孔径 --- 对色谱分离的影响
大孔的填料颗粒可以延长溶质大分子在填料表面滞 留的时间, 达到充分分离, 改善峰形
样品 MW 4, 000, 选择 80Å 的孔径 样品 MW > 4, 000, 选择 300Å 的孔径
孔结构复杂, 孔径不均匀导致柱效不够高, 有• 聚合物基质 - pH1~14
机溶剂可能导致聚合物基质溶涨而受损
Agilent Technologies
C-18柱---性能影响因素 5页
物理性质
•硅胶纯度 •色谱柱尺寸 •颗粒形状 •粒径 •表面积 •孔径
•键合类型 化学性质 •碳覆盖率
•封端
Agilent Technologies
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C-18柱---性能影响因素
色谱柱物理性质
硅胶纯度
• 填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度
色谱柱尺寸
• 填料床的长度和内径
颗粒形状
• 球型或不规则型
粒径
• 平均颗粒直径, 通常3-10µm
表面积
• 颗粒外表面和内部孔表面的总和, 以m2/gram表示
孔径
• 颗粒的孔或腔的平均尺寸, 范围80-300Å
球形
粒径 --- 对色谱分离的影响
较小的颗粒柱效较高, 但会引起柱压过高. 3.5µm粒径的常用于分离复杂的多组份样品, 而组份单一的样品多采用5µm的粒径
不规则形
1.8µm 3.5µm
5µm
Agilent Technologies
7µm
10µm
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C-18柱---性能影响因素
表面积 --- 对色谱分离的影响
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C-18柱---性能影响因素
A类硅胶
Original ZORBAX SIL (1970s) 由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表 面上金属含量高 (硅羟基的pKa低), 导致碱性化合物发生拖尾
B类硅胶 (高纯)
ZORBAX Rx-Sil (1987) 由于金属含量低, 硅羟基pKa高, 碱性化合物不发生拖尾
Agilent Technologies
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300Å 孔径可改善蛋白质和多肽峰形
选择合适的 填料孔径分析 大分子可获得
最佳峰形
PW 1/2
孔径, 分子量对峰宽的影响(梯度分离)
Zorbax Rx-SIL: 11种金属< 35 ppm (未检出其他杂质, <1ppm); 99.995% 纯度的二氧化硅
Agilent Technologies
ZORBAX®生产工艺
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• StableBond • Eclipse XDB • Bonus-RP • Extend
硅胶 +
脲 (pH=2) +
抑制电离反相键合相色谱
样品
分子量>2, 000
溶于有机溶剂 溶于水
离子化
Agilent Technologies
离子对键合相的反相模式
用硅胶的正相模式 离子交换模式 凝胶渗透色谱 凝胶过滤色谱
大孔填料的离子交换模式 用大孔填料的反相模式
正相 &反相色谱
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正相吸附色谱
极性:固定相 > 流动相
固定相 - 极性 流动相(己烷, 庚烷)- 非极性 极性物质后出峰
二氧化硅 Zorbax Rx-SIL Zorbax SIL Nucleosil Hypersil nd = 未检出
金属浓度（ppm) Na K Mg Al Ca Ti Fe Zr Cu Cr Zn 10 < 3 4 1.5 2 nd 3 nd nd nd 1 17 nd nd 57 9 32 21 88 < 1 nd 88 56 N/ A N/ A nd 130 57 76 nd N/ A N/ A nd 2900 N/ A 40 300 38 65 230 N/ A N/ A N/ A N/ A
Sa
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安捷伦科技
HPLC色谱柱选择与维护保养
Agilent Technologies
分离模式的选择
溶于正己烷
2页 用硅机溶剂 分子量<2, 000
溶于水
溶于甲醇或甲醇/水 或乙腈或乙腈/水
溶于四氢呋喃
非离子化
用键合相的反相模式 用键合相的反相模式 低分子凝胶渗透色谱 用键合相的反相模式