高效液相色谱法定性定量分析课件
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【精品课件】高效液相色谱定性定量分析方法
• 标样的可靠性及其配制的准确度 • 色谱方法的可靠性 • 色谱泵的精确度（GPC的影响更大） • 进样器的准确度，进样技术
定量分析基本要求
• 要有纯物质做标准 • 被定量组分峰要与其他组分达到基线分离 • 符合定性参数要求 • 选择合适定量方法
定量分析基本公式
• 在某些限定条件下，被测组分的浓度与检测器的 响应值成正比的关系。（蒸发光散射检测器浓度 与峰面积不成线性，分别取对数后呈线性。）
两谱联用技术
1 如果标准物质缺乏或难以获得；或由于结构、理 化性质相似，很多物质具有十分接近，甚至相同 的保留值，则保留值定性准确度存在疑问。
2 可以运用红外光谱、紫外光谱、核磁共振光谱和 质谱对化合物进行定性，目前两用技术有： HPLC-紫外光谱，HPLC-红外光谱，HPLC-MS, HPLC-NMR等。
高效液相色谱定性定量分析方法
色谱分析的目的：
对未知组分进行定性分析 对已知组分进行定量分析
根据色谱图上某个色谱峰的保留时间和该色谱峰 在检测器上的响应信号强度，对该谱峰进行初步定性 定量分析。
液相色谱定性分析 液相色谱定量分析 影响定量分析的因素
色谱峰的定性鉴别：
通过保留值（通常指保留时间）进行定性 需要制定保留时间误差范围
• 相关系数—用来表示线性关系的好坏程度；
• 相关系数越接近1，说明线性关系越好；
• 绘制标准工作曲线时一般选取3-6个不同浓度 的标准样品，相关系数起码应在0.95以上。
如达不到要求，可பைடு நூலகம்存在以下原因：
1 所选浓度范围使检测器的响应值超出了该检测器
2
响应值的线性范围；
2 实验数据的精密度太差，过于分散。
3 无论何种原因，都应重新绘制标准工作曲线 。
定量分析基本要求
• 要有纯物质做标准 • 被定量组分峰要与其他组分达到基线分离 • 符合定性参数要求 • 选择合适定量方法
定量分析基本公式
• 在某些限定条件下，被测组分的浓度与检测器的 响应值成正比的关系。（蒸发光散射检测器浓度 与峰面积不成线性，分别取对数后呈线性。）
两谱联用技术
1 如果标准物质缺乏或难以获得；或由于结构、理 化性质相似，很多物质具有十分接近，甚至相同 的保留值，则保留值定性准确度存在疑问。
2 可以运用红外光谱、紫外光谱、核磁共振光谱和 质谱对化合物进行定性，目前两用技术有： HPLC-紫外光谱，HPLC-红外光谱，HPLC-MS, HPLC-NMR等。
高效液相色谱定性定量分析方法
色谱分析的目的：
对未知组分进行定性分析 对已知组分进行定量分析
根据色谱图上某个色谱峰的保留时间和该色谱峰 在检测器上的响应信号强度，对该谱峰进行初步定性 定量分析。
液相色谱定性分析 液相色谱定量分析 影响定量分析的因素
色谱峰的定性鉴别：
通过保留值（通常指保留时间）进行定性 需要制定保留时间误差范围
• 相关系数—用来表示线性关系的好坏程度；
• 相关系数越接近1，说明线性关系越好；
• 绘制标准工作曲线时一般选取3-6个不同浓度 的标准样品，相关系数起码应在0.95以上。
如达不到要求，可பைடு நூலகம்存在以下原因：
1 所选浓度范围使检测器的响应值超出了该检测器
2
响应值的线性范围；
2 实验数据的精密度太差，过于分散。
3 无论何种原因，都应重新绘制标准工作曲线 。
高效液相色谱仪的定性、定量分析(未知样品中苯甲酸含量的测定)
高效液相色谱测定饮料中的苯甲酸
一. 实验目的：
1. 学习高效液相色谱法的测定原理； 2.掌握高效液相色谱仪（HP1100）的定性、定量 分析方法。
二。实验原理： 高效液相色谱法是重要的色谱方法，是在经典液相色谱法 和气相色谱的基础上发展起来的，（经典液相色谱法使用粗粒 多孔固定相，装填在大口径、长玻璃管柱内，流动相仅靠重力 流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度极其缓慢，柱入 口压力低，仅有低的柱效，分析时间长；气相色谱原理类似， 流动相为气体，只能分离小分子量、低沸点的有机化合物，配 合程序升温可分析高沸点的有机化合物。）弥补了经典液相色 谱法和气相色谱的缺点。它使用了多孔微粒固定相，装填在小 口径短的不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高压的色谱 柱，溶质在其中的传质、扩散速度大大加快，从而在短时间内 获得高的分离能力。可分析低分子量、低沸点的有机化合物， 更多适用于分析中、高分子量、高沸点及热稳定性差的有机化 合物。
三．仪器和试剂： 1． 高效液相色谱仪，VWD（254nm）检测仪。 2．色谱柱：C18 3．超声波发生器或水泵(用于过滤或排气) 4．注射器：50微升 5．容量瓶：100ml若干 6．移液管：2ml、4ml、8ml 7．流动相：甲醇：乙酸+乙酸氨（PH=3.5）=60：40， 制备前，先调节水(用酸或缓冲盐)的PH=3.5，进入系统 色谱前，用超声波发生器或水泵脱气。
四．实验步骤：（ESTD法） 1． 标准储备液的配置：准确量取0.144克苯甲酸钠试剂 ， 用 纯 水 或 去 离 子 水 溶 解 ， 定 容 到 100 毫 升 ， 浓 度 为 1.44mg/ml. 分别取此标准液5 ml，2.5 ml，1 ml, 0.5 ml稀 释为10 ml，则浓度分别为0.72 mg/ml，0.36 mg/ml，0.144 mg/ml，0.072 mg/ml。 2． 打开计算机，开仪器，稳定后，打开桌面的ONLINE 工作站。 设定方法：设置泵的流速为1ml/min，柱温为室温（ 40度左右），停止时间为4min，流动相比例（甲醇：水 =60；40），当流动相通过色谱柱约5-10min，记录仪上基 线稳定后，开始进样。 3． 进样：进样阀放在装载的位置上，用注射器取25微升 浓度最低的标准样（比进样阀上的定量环多5-10微升以上 ），注入进样阀中。
一. 实验目的：
1. 学习高效液相色谱法的测定原理； 2.掌握高效液相色谱仪（HP1100）的定性、定量 分析方法。
二。实验原理： 高效液相色谱法是重要的色谱方法，是在经典液相色谱法 和气相色谱的基础上发展起来的，（经典液相色谱法使用粗粒 多孔固定相，装填在大口径、长玻璃管柱内，流动相仅靠重力 流经色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度极其缓慢，柱入 口压力低，仅有低的柱效，分析时间长；气相色谱原理类似， 流动相为气体，只能分离小分子量、低沸点的有机化合物，配 合程序升温可分析高沸点的有机化合物。）弥补了经典液相色 谱法和气相色谱的缺点。它使用了多孔微粒固定相，装填在小 口径短的不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高压的色谱 柱，溶质在其中的传质、扩散速度大大加快，从而在短时间内 获得高的分离能力。可分析低分子量、低沸点的有机化合物， 更多适用于分析中、高分子量、高沸点及热稳定性差的有机化 合物。
三．仪器和试剂： 1． 高效液相色谱仪，VWD（254nm）检测仪。 2．色谱柱：C18 3．超声波发生器或水泵(用于过滤或排气) 4．注射器：50微升 5．容量瓶：100ml若干 6．移液管：2ml、4ml、8ml 7．流动相：甲醇：乙酸+乙酸氨（PH=3.5）=60：40， 制备前，先调节水(用酸或缓冲盐)的PH=3.5，进入系统 色谱前，用超声波发生器或水泵脱气。
四．实验步骤：（ESTD法） 1． 标准储备液的配置：准确量取0.144克苯甲酸钠试剂 ， 用 纯 水 或 去 离 子 水 溶 解 ， 定 容 到 100 毫 升 ， 浓 度 为 1.44mg/ml. 分别取此标准液5 ml，2.5 ml，1 ml, 0.5 ml稀 释为10 ml，则浓度分别为0.72 mg/ml，0.36 mg/ml，0.144 mg/ml，0.072 mg/ml。 2． 打开计算机，开仪器，稳定后，打开桌面的ONLINE 工作站。 设定方法：设置泵的流速为1ml/min，柱温为室温（ 40度左右），停止时间为4min，流动相比例（甲醇：水 =60；40），当流动相通过色谱柱约5-10min，记录仪上基 线稳定后，开始进样。 3． 进样：进样阀放在装载的位置上，用注射器取25微升 浓度最低的标准样（比进样阀上的定量环多5-10微升以上 ），注入进样阀中。
高效液相色谱-HPLCppt课件.ppt
色谱法的分类
按固定相的形态分:
平面色谱 o 纸色谱
o 薄层色谱
柱色谱
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法的分类示意图
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪ 高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个 泵。）
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪安捷伦泵：小视频 ▪色谱学堂：泵
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法原理及分类
什么是色谱法 色谱法溯源 Tswett（茨维特)的实验 色谱法原理 色谱法的分类
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
什么是色谱法
色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用 高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
1. 紫外—可见光度检测器：
①固定波长：254nm ， 低压汞 灯。
② 可 调 波 长 ： 190 ～ 800mm ， 钨灯，氘灯。
UV
③光电二极管矩阵检测器： 190～700nm。
接色谱柱 石英窗 光电倍增管
废液
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
超高效液相色谱法PPT课件
• 3、 高温分析
•
柱温最高达150℃；高温促使新技术的应用，比如绿色色谱法
（Green LC）。
4、 高速LCMS分析
•
与超快速LCMS、LCMS-2020相结合。
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头发中烟碱和可替宁的超高效液相色谱测 定
• 烟碱( nicotine)是烟草中的主要生物碱, 是导致
吸烟成瘾的物质动因, 也是评价人体摄入烟草烟
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• 此技术可保证可靠、重现的进样；在自动进样器内，可安置96 位或384位样品盘。每个位置可放置2或4mL样品瓶。新型的样 品组织器可接受21个样品盘的编程。
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• 与传统的HPLC相比，UPLC的速度、灵敏度及 分离度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍。
• 因此其在蛋白质、肽、代谢组学分析及其它一 些生化领域里将会得到广泛应用。另外，在天 然产物的分析方面，使用UPLC与质谱检测器连 接，会对天然产物分析，特别是中药研究领域 的发展是一个极的促进。
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• 在提到“蛋白组学”或“代谢组学”时，与 没有“组”的差别从分析的角度说就是样品量 极大，需要在短时间分析成千上万的样品。 UPLC不损失分离度的高速度优点在里就能充分 体现。多生化样品及天然产物都十分复杂，
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Waters UPLC 超高效液相色谱
• 3 μm是15 cm长普通色谱柱颗粒大小的极限。这是在色谱柱达 到最佳流速而又不超出市售仪器（使用任何配比的甲醇－水混 合溶剂）的压力限制范围的条件下，运行系统所能使用的最小 颗粒大小。（注意：迄今为止，用于HPLC的最小颗粒是0.67 μm
高效液相色谱法3
2.内标法 内标法分为 工作曲线法 内标一点法 内标二点法 内标对比法 校正因子法 在HPLC中最常用内标对比法。 选择内标物的三个条件(纯、样品中不含有、保留时 间接近)，在HPLC中的要求与GC完全一致。一般可选择 一个化学结构与待测物质相似、物理性质相近的纯物质作 为内标物，加到待测样品溶液中，经过样品前处理后进样。 使用内标法可抵消因仪器稳定性差、进样量不够准确等原 因带来的实验误差。
(一) 多环芳烃的分析 一 多环芳烃的分析(图21－18) 多环芳烃的分析，可用反相或吸附色谱法分析。反 相色谱法用ODS柱，用乙腈−水或甲醇−水为流动相。但用 甲醇−水时，保留时间较长，因此多采用梯度洗脱。多环 芳烃也可用硅胶(YWG等)柱，以不含水的正己烷为流动相， 也能获得较好的分离效果，但需注意溶解样品的溶剂应与 流动相的性质相近。许多多环芳烃是致癌物质，其含量监 测在食品分析与环境保护监测中都有实用意义。
(1)内标对比法： 这种方法不需知校正因子又具有内标法的定量准确 度与进样量无关的特点，方法简便实用。在药物分析中分 析结果(含量)常用标示量％表示:
( Ai / As )样品 (ms )样品 W 标示量% = × × ×100% ( Ai / As )对照 (ms )对照 m
(21.13)
式中(ms)样品与(ms)对照分别是内标物在试样溶液及对照溶液 中的量，W为平均片重(或丸重等)，m是取样量，其它符 号的含义同GC章。若试样溶液与对照溶液中加人内标物 的量相等，所称取的样品重与平均片重相同，则上式的后 二项均等于1。
A的标示量％=(178024／202694)÷(154856／171222)×100％=97.l％ P的标示量％=(820968／202694) ÷(692272／171222)×100％=100.l％ C的标示量％=(407792／202694) ÷(372221／171222)×100％=92.5％
waters-e高效液相色谱ppt课件
4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用甲醇水溶液冲洗。 5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水冲洗及
保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水极性太强且易长霉。 。 6.开机时，流速和柱压要逐渐增加。 7.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。
流动相流出检测器可被送至废液瓶，或按需被收集。 当流动相含有一个分开的化合物谱带，高效液相色谱可以收集含有纯
化的化合物的该洗脱组分，用于进一步分析。
注意高压管路和附件用来连接泵、进样器、色谱柱和检测器单元，形 成流动相、样品和化合物分离谱带的通路。
高 检将效测电器信液连号相接转计换色算为谱机色数谱如据图站 ，何在，工显高示效作屏液上相展色现谱出系来统。单元先记录电信号，再
液相色谱的基本流程图
流动相
进样阀 泵
色谱柱
泵输液 进样
分离
检测器
检测
AB C
DE
G
F
记录
液 液相相流色色动谱谱相实：的验种所类各需及的部配基比分本，参示等数度-意-或亦梯图称度色谱条件
固定相：色谱柱类型及内径、长短 流动相输送系统参数：流速 检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等 温度控制 进样量
四元梯度洗脱的溶剂输送动进样系统 柱温箱 液晶显示器 内置的柱塞杆密封垫清洗系统 溶剂瓶托盘 键盘用户界面及软盘驱动器
打开电源至on位置，开机依次接通 2695 分离单元、检测
2器开、机计算机和打印机的电源。接通后，约 20s 仪器开始自
检，约 1min 后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化。
溶 流【剂动M管相en理脱u/气系St确a统tu认s的所】有，准溶进备剂入管“路St都at充us满（溶1 剂），”按屏幕
保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水极性太强且易长霉。 。 6.开机时，流速和柱压要逐渐增加。 7.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。
流动相流出检测器可被送至废液瓶，或按需被收集。 当流动相含有一个分开的化合物谱带，高效液相色谱可以收集含有纯
化的化合物的该洗脱组分，用于进一步分析。
注意高压管路和附件用来连接泵、进样器、色谱柱和检测器单元，形 成流动相、样品和化合物分离谱带的通路。
高 检将效测电器信液连号相接转计换色算为谱机色数谱如据图站 ，何在，工显高示效作屏液上相展色现谱出系来统。单元先记录电信号，再
液相色谱的基本流程图
流动相
进样阀 泵
色谱柱
泵输液 进样
分离
检测器
检测
AB C
DE
G
F
记录
液 液相相流色色动谱谱相实：的验种所类各需及的部配基比分本，参示等数度-意-或亦梯图称度色谱条件
固定相：色谱柱类型及内径、长短 流动相输送系统参数：流速 检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等 温度控制 进样量
四元梯度洗脱的溶剂输送动进样系统 柱温箱 液晶显示器 内置的柱塞杆密封垫清洗系统 溶剂瓶托盘 键盘用户界面及软盘驱动器
打开电源至on位置，开机依次接通 2695 分离单元、检测
2器开、机计算机和打印机的电源。接通后，约 20s 仪器开始自
检，约 1min 后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化。
溶 流【剂动M管相en理脱u/气系St确a统tu认s的所】有，准溶进备剂入管“路St都at充us满（溶1 剂），”按屏幕
药物分析课件 第四章 药物定量分析与分析方法验证_OK
样品能在足够的氧气中燃烧分解完全样品能在足够的氧气中燃烧分解完全有利于将燃烧分解产物较快地吸收到吸有利于将燃烧分解产物较快地吸收到吸防止爆炸的可能性防止爆炸的可能性26燃烧瓶要洁净不能残留有机溶剂不能用有机润滑剂涂抹瓶塞要有防爆措施氧气要充足确保燃烧完全产物不能有黑色炭化物燃烧产生的烟雾要被完全吸收充分振摇和放置都是为了保证吸收完全例
③要有防爆措施 ④氧气要充足，确保燃烧完全，产物不能有黑色
炭化物 ⑤燃烧产生的烟雾要被完全吸收
充分振摇和放置都是为了保证吸收完全 例：碘产生紫色烟雾；氯、氟产生白色烟雾，烟
雾颜色完全消失后，即表示吸收完全 ⑥测定含氟有机化合物时要用石英燃烧瓶
26
4、应用
含卤素、硫、磷、氟及硒等有机药物的鉴别、杂 质的检查及含量测定
100%
注射剂：标示量％＝
V0
V T 标示量
100%
V VO
T F 标示量
100%
VO : 量取注射剂的体积， ml
36
(2)间接滴定法 1）生成物滴定法
供试品＋试剂 A 化合物 B
化合物 B＋滴定液 C 化合物 D
计量滴定液消耗的量，计算供试品的含量 计算同直接滴定法
37
2）回滴定法（剩余滴定法） 原理：先在待测样品溶液中加定量、过量的滴定
10
（一）湿法破坏
（1） 硝酸-高氯酸法 适用于血、尿、组织等生物样品的破坏，有
机金属药物经破坏后，得到的无机金属离子一 般呈高价态。
本法不能用于含氮杂环药物的破坏
干法灼烧法 11
（2） 硝酸-硫酸法 适用于大多数有机物质的破坏，破坏得到的
无机金属离子均为高价态。 不能用于含碱土金属有机药物的破坏
27
氧瓶燃烧
③要有防爆措施 ④氧气要充足，确保燃烧完全，产物不能有黑色
炭化物 ⑤燃烧产生的烟雾要被完全吸收
充分振摇和放置都是为了保证吸收完全 例：碘产生紫色烟雾；氯、氟产生白色烟雾，烟
雾颜色完全消失后，即表示吸收完全 ⑥测定含氟有机化合物时要用石英燃烧瓶
26
4、应用
含卤素、硫、磷、氟及硒等有机药物的鉴别、杂 质的检查及含量测定
100%
注射剂：标示量％＝
V0
V T 标示量
100%
V VO
T F 标示量
100%
VO : 量取注射剂的体积， ml
36
(2)间接滴定法 1）生成物滴定法
供试品＋试剂 A 化合物 B
化合物 B＋滴定液 C 化合物 D
计量滴定液消耗的量，计算供试品的含量 计算同直接滴定法
37
2）回滴定法（剩余滴定法） 原理：先在待测样品溶液中加定量、过量的滴定
10
（一）湿法破坏
（1） 硝酸-高氯酸法 适用于血、尿、组织等生物样品的破坏，有
机金属药物经破坏后，得到的无机金属离子一 般呈高价态。
本法不能用于含氮杂环药物的破坏
干法灼烧法 11
（2） 硝酸-硫酸法 适用于大多数有机物质的破坏，破坏得到的
无机金属离子均为高价态。 不能用于含碱土金属有机药物的破坏
27
氧瓶燃烧
高效液相色谱法对两种氨基甲酸酯类农药的定性定量分析
实验五高效液相色谱法对两种氨基甲酸酯类农药的定性和定量分析1 实验目的掌握高效液相色谱法的基本原理方法；熟悉液相色谱仪基本结构及使用方法；掌握对两种氨基甲酸酯类农药的定性和定量分析的实验步骤及注意事项。
2 实验原理2.1方法原理色谱分离的基本原理是在外力作用的条件下，含有样品的流动相通过一固定于柱或平板上、与流动相互不相溶的固定相表面。
样品中各组分在两相之中进行不同程度的作用。
与固定相作用强的组分随流动相流出的速度慢，反之与固定相作用弱的组分随流动相流出的速度快。
高校液相色谱是以溶剂为流动相的色谱方法，具有高效、高速、高灵敏度的优点。
由于流出速度存在差异即各组分保留时间不同，使得混合组分最终形成各个单组分的“带”或“区”，对依次流出的各个单组分物质可分别进行定性、定量分析。
样品中各组分在固定相的分离机理有许多种，包括不同组分在固定相的吸附作用不同；不同组分在固定相上的溶解能力不同；不同组分在固定相（离子交换剂）上的亲和力不同；不同尺寸分子在固定相上的渗透作用不同。
定性：通过保留时间对目标物进行定性分析；定量：运用公式：C / A=C' / A'；其中C为待测样目标物的浓度；A为待测样目标物的峰面积；C'为目标物混标的浓度；A'为目标物混标的峰面积。
2.2仪器原理高效液相色谱仪包含五部分结构：高压输液装置、进样系统、分离系统、检测系统和工作站软件，还配有梯度淋洗、自动进样和数据处理装置[1]。
高压输液装置：包含贮液器、脱气、高压输液泵三方面。
通过超声波脱气或真空加热脱气。
溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去。
高压输液泵是高效液相色谱仪的关键部件之一，其功能是将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。
由于液相色谱仪所用色谱柱径较细，所填固定相粒度很小，因此，对流动相的阻力较大，为了使流动相能较快地流过色谱柱，就需要高压泵注入流动相。
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同一种检测器对不同种类的化合物的响应 值是不同的，而不同的检测器对同一种化合物 的响应也是不同的。所以当某一被测化合物同 时被两种或两种以上检测器检测时，两个或几 个检测器对被测化合物的检测灵敏度比值是与 被测化合物的性质密切相关的，可以用来对被 测化合物进行定性分析，这就是双检测器定件 体系的基本原理。
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3．利用紫外检测器全波长扫描功能定性
紫外检测器是液相色谱中使用最广泛的一种检测器。 全波长扫描紫外检测器可以根据被检测化合物的紫外光谱 图提供一些有价值的定性信息。
传统的方法是在色谱图上某组分的色谱出现极大值即 最高浓度时，通过停泵等手段，使组分在检测池中滞留， 然后对检测池中的组分进行全波长扫描，得到该组分的紫 外—可见光谱图；再取可能的标准样品按同样方法处理。 对比两者光谱图即能鉴别出该组分与标准样品是否相同。 对于某些有特殊紫外谱图的化合物，也可以通过对照标准 谱图的方法来识别化合物。
高效液相色谱法（HPLC） 及定性定量分析
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1
提纲
• 一﹑HPLC系统简介 • 二﹑HPLC中的固定相和流动相 • 三﹑应用范围 • 四﹑定量定性分析
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2
一、HPLC系统
HPLC系统
输进
色
检
数据
液样
谱
测
记录 及处
泵器
柱
器
理
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3
HPLC示意图
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4
输液泵
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定性分析
常用的液相色谱定性方法有： 1. 1. 利用已知标准样品定性
利用标淮样品对未知化合物定性是最常用 的液相色谱定性方法。由于每一种化合物在 特定的色谱条件下（流动相组成、色谱柱、 桂温等相同），其保留值具有特征性，因此 可以利用保留值进行定性。
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2．利用检测器的选择性定性PPT学习交流 Nhomakorabea8
检测器
检测器是HPLC系统的三大关键部件 之一，作用是把洗脱液中的组分的量转 化为电信号。HPLC的检测器要求是灵敏 度高，噪音低，线性范围宽，重复性好， 适用范围广等特点。
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数据记录及处理
目前对于数据记录及处理所采用的是计算 机，计算机的广泛应用使得HPLC操作更加 迅速，简便，准确，精密和自动化，现在已 经可以在互联网上远程处理数据，目前计算 机在HPLC上的用途主要由： 1. 采集处理和分析数据； 2. 控制仪器； 3. 色谱系统优化和专家系统。
隔膜进样、停流进样、阀进
样、自动进样。目前应用做多的
是阀进样和自动进样。
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色谱柱的要求：
色谱柱
柱效高、选择性好，分析速 度快等。市售的用于HPLC的各种 微粒填料好多孔硅胶以及以硅胶 为基质的键合相、氧化铝、有机 聚合物微球(包括离子交换树脂)、 多孔碳等，其粒度一般为3，5， 7，10μm等，柱效理论值可达5～ 16万/米。对于一般的分析只需 5000塔板数的柱效;对于同系物分 析，只要500即可;对于较难的分 离物质对则可采用高达2万的柱 子，因此一般10～30CM左右的 柱长就能满足复杂混合物分析的 需要。
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HPLC的固定相和流动相
固定相：即所说的基质或者单体，可以是 陶瓷的无机物基质，也可以是有机聚合物基质。 无机物基质主要是硅胶和氧化铝，在溶剂中不 容易膨胀，有机聚合物基质主要是交联苯乙烯 -二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯。有机聚合物刚 性小、易被压缩，溶剂或溶质容易渗入有机基 质中，导致填料颗粒膨胀，结果减少传质，最 终使柱效降低。
2.纯度；
3.必须与检测其匹配；
4.粘度要低；
5.对样品的溶解度要适宜；
6.样品易于回收。
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应用范围
高效液相色谱法适于分析高沸点不易挥发 的、受热不稳定易分解的、分子量大、不同极 性的有机化合物；生物活性物质和多种天然产 物；合成的和天然的高分子化合物等。它们涉 及石油化工产品、食品、合成药物、生物化工 产品及环境污染物等，约占全部有机化合物的 80％。其余20％的有机化合物，包括永久性 气体，易挥发低沸点及中等分子量的化合物， 只能用气相色谱法进行分析。
输液泵：
输液泵是HPLC系统中的重要部件之一， 泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和
分析结果的可靠性。
泵应具有的性质： 1. 流量稳定； 2. 流量范围宽； 3. 输出压力高； 4. 液缸容积小； 5. 密封性能好，耐腐蚀。
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操作时的注意事项：
1. 防止任何固体微粒进入泵；
2. 流动相不含有任何腐蚀性物质；
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固定相的种类： 1. 硅胶 2. 氧化铝 3. 聚合物 4. 固定相的选择：（+++表示好，++表示一般，+表示差）
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流动相：
一个理想的流动相溶剂应具有低粘度、与
检测其兼容性好、易于得到纯品和低毒性的特 征。
选择流动相要考虑的因素：
1.流动相应不改变填料的任何性质；
3. 工作时要注意溶剂瓶中的溶剂用完；
4. 泵的工作压力不能大于规定的最大压力；
5. 流动相要先进行脱气，防止产生气泡。
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6
进样器
进样器：
目前采用较多的是六通
进样阀和自动进样器。
对进样装置的要求：
密封性好，死体积小，
重复性好，保证中心进样，
进样时对色谱系统的压力、
流量影响小。
进样方式可分为：
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3.内标法
内标法是比较精确的一种定量方法。它是
将已知量的参比物（内标物）加到已知量的试 样中．那么试样中参比物的浓度为已知；在进 行色谱测定之后，待测组分峰面积和参比物峰 面积之比应该等于待测组分的质量与参比物质 量之比，求出待测组分的质量，进而求出待测 组分的含量。
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谢谢大家!!!
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定量分析
1.归一化法 归一化法要求所有组分都能分离并有响应。
由于液相色谱所用检测器为选择性检测器，对 很多组分没有响应，因此液相色谱法较少使则 归一化法。
2.外标法 外标法是以待测组分纯品配制标准试样和
待测试样同时作色谱分析来进行比较而定量的， 可分为标准曲线法和直接比较法。
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3．利用紫外检测器全波长扫描功能定性
紫外检测器是液相色谱中使用最广泛的一种检测器。 全波长扫描紫外检测器可以根据被检测化合物的紫外光谱 图提供一些有价值的定性信息。
传统的方法是在色谱图上某组分的色谱出现极大值即 最高浓度时，通过停泵等手段，使组分在检测池中滞留， 然后对检测池中的组分进行全波长扫描，得到该组分的紫 外—可见光谱图；再取可能的标准样品按同样方法处理。 对比两者光谱图即能鉴别出该组分与标准样品是否相同。 对于某些有特殊紫外谱图的化合物，也可以通过对照标准 谱图的方法来识别化合物。
高效液相色谱法（HPLC） 及定性定量分析
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提纲
• 一﹑HPLC系统简介 • 二﹑HPLC中的固定相和流动相 • 三﹑应用范围 • 四﹑定量定性分析
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一、HPLC系统
HPLC系统
输进
色
检
数据
液样
谱
测
记录 及处
泵器
柱
器
理
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3
HPLC示意图
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4
输液泵
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定性分析
常用的液相色谱定性方法有： 1. 1. 利用已知标准样品定性
利用标淮样品对未知化合物定性是最常用 的液相色谱定性方法。由于每一种化合物在 特定的色谱条件下（流动相组成、色谱柱、 桂温等相同），其保留值具有特征性，因此 可以利用保留值进行定性。
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2．利用检测器的选择性定性PPT学习交流 Nhomakorabea8
检测器
检测器是HPLC系统的三大关键部件 之一，作用是把洗脱液中的组分的量转 化为电信号。HPLC的检测器要求是灵敏 度高，噪音低，线性范围宽，重复性好， 适用范围广等特点。
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数据记录及处理
目前对于数据记录及处理所采用的是计算 机，计算机的广泛应用使得HPLC操作更加 迅速，简便，准确，精密和自动化，现在已 经可以在互联网上远程处理数据，目前计算 机在HPLC上的用途主要由： 1. 采集处理和分析数据； 2. 控制仪器； 3. 色谱系统优化和专家系统。
隔膜进样、停流进样、阀进
样、自动进样。目前应用做多的
是阀进样和自动进样。
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色谱柱的要求：
色谱柱
柱效高、选择性好，分析速 度快等。市售的用于HPLC的各种 微粒填料好多孔硅胶以及以硅胶 为基质的键合相、氧化铝、有机 聚合物微球(包括离子交换树脂)、 多孔碳等，其粒度一般为3，5， 7，10μm等，柱效理论值可达5～ 16万/米。对于一般的分析只需 5000塔板数的柱效;对于同系物分 析，只要500即可;对于较难的分 离物质对则可采用高达2万的柱 子，因此一般10～30CM左右的 柱长就能满足复杂混合物分析的 需要。
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HPLC的固定相和流动相
固定相：即所说的基质或者单体，可以是 陶瓷的无机物基质，也可以是有机聚合物基质。 无机物基质主要是硅胶和氧化铝，在溶剂中不 容易膨胀，有机聚合物基质主要是交联苯乙烯 -二乙烯苯、聚甲基丙烯酸酯。有机聚合物刚 性小、易被压缩，溶剂或溶质容易渗入有机基 质中，导致填料颗粒膨胀，结果减少传质，最 终使柱效降低。
2.纯度；
3.必须与检测其匹配；
4.粘度要低；
5.对样品的溶解度要适宜；
6.样品易于回收。
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应用范围
高效液相色谱法适于分析高沸点不易挥发 的、受热不稳定易分解的、分子量大、不同极 性的有机化合物；生物活性物质和多种天然产 物；合成的和天然的高分子化合物等。它们涉 及石油化工产品、食品、合成药物、生物化工 产品及环境污染物等，约占全部有机化合物的 80％。其余20％的有机化合物，包括永久性 气体，易挥发低沸点及中等分子量的化合物， 只能用气相色谱法进行分析。
输液泵：
输液泵是HPLC系统中的重要部件之一， 泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和
分析结果的可靠性。
泵应具有的性质： 1. 流量稳定； 2. 流量范围宽； 3. 输出压力高； 4. 液缸容积小； 5. 密封性能好，耐腐蚀。
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操作时的注意事项：
1. 防止任何固体微粒进入泵；
2. 流动相不含有任何腐蚀性物质；
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固定相的种类： 1. 硅胶 2. 氧化铝 3. 聚合物 4. 固定相的选择：（+++表示好，++表示一般，+表示差）
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流动相：
一个理想的流动相溶剂应具有低粘度、与
检测其兼容性好、易于得到纯品和低毒性的特 征。
选择流动相要考虑的因素：
1.流动相应不改变填料的任何性质；
3. 工作时要注意溶剂瓶中的溶剂用完；
4. 泵的工作压力不能大于规定的最大压力；
5. 流动相要先进行脱气，防止产生气泡。
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进样器
进样器：
目前采用较多的是六通
进样阀和自动进样器。
对进样装置的要求：
密封性好，死体积小，
重复性好，保证中心进样，
进样时对色谱系统的压力、
流量影响小。
进样方式可分为：
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3.内标法
内标法是比较精确的一种定量方法。它是
将已知量的参比物（内标物）加到已知量的试 样中．那么试样中参比物的浓度为已知；在进 行色谱测定之后，待测组分峰面积和参比物峰 面积之比应该等于待测组分的质量与参比物质 量之比，求出待测组分的质量，进而求出待测 组分的含量。
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定量分析
1.归一化法 归一化法要求所有组分都能分离并有响应。
由于液相色谱所用检测器为选择性检测器，对 很多组分没有响应，因此液相色谱法较少使则 归一化法。
2.外标法 外标法是以待测组分纯品配制标准试样和
待测试样同时作色谱分析来进行比较而定量的， 可分为标准曲线法和直接比较法。
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