高效液相色谱分析方法的建立
高效液相色谱检测葡萄及葡萄酒中7种有机酸方法的建立
高效液相色谱检测葡萄及葡萄酒中7种有机酸方法的建立沈 燕1，张正文1，刘兴凯1，王福成2，邵学东1*（1.君顶酒庄有限公司，山东烟台 265607；2.烟台市蓬莱区葡萄与葡萄酒产业发展服务中心，山东烟台 265699）摘 要：目的：建立了利用高效液相色谱测定葡萄及葡萄酒中7种有机酸的检测方法。
方法：色谱条件为Hi-Plex H色谱柱（300 mm×7.7 mm，8 μm），PL Hi-Plex H保护柱（50 mm×7.7 mm，8 μm）；紫外检测波长210 nm；流动相为0.006 mol·L-1的硫酸；流速0.6 mL·min-1；柱温55 ℃；进样量10 μL。
结果：草酸、柠檬酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、乳酸和乙酸出峰时间均在20 min以内；标准曲线线性关系良好，相关系数（R2）在0.999 9～1.000 0；检出限在0.031 4～0.722 3 mg·L-1；加标回收率在95.24%～102.04%，其相对标准偏差在0.16%～1.87%。
结论：该方法操作简单，检测时间短，具有较高的准确性和精确性。
关键词：有机酸；葡萄；葡萄酒；高效液相色谱；检测方法Establishment the Method of Seven Kinds of OrganicAcids in Grape and Wine by High Performance LiquidChromatographySHEN Yan1, ZHANG Zhengwen1, LIU Xingkai1, WANG Fucheng2, SHAO Xuedong1*(1.Junding Castle Co., Ltd., Yantai 265607, China; 2.Yantai Penglai District Grape and Wine Industry DevelopmentService Center, Yantai 265699, China)Abstract: Objective: To establish a HPLC method for the determination of 7 organic acids in grape and wine. Method: The chromatographic conditions were Hi-Plex H column (300 mm×7.7 mm, 8 μm) and PL Hi-Plex H protective column (50 mm×7.7 mm, 8 μm). UV detection wavelength 210 nm; sulfuric acid with 0.006 mol·L-1 mobile phase; flow rate 0.6 mL·min-1; column temperature 55 ℃. The sample size was 10 μL. Result: The peak time of oxalic acid, citric acid, tartaric acid, malic acid, succinic acid, lactic acid and acetic acid were all within 20 min. The standard curve has a good linear relationship with the correlation coefficient（R2） ranging from 0.999 9 to 1.000 0. The detection limit was 0.031 4～0.722 3 mg·L-1. The recoveries ranged from 95.24% to 102.04%, and the relative standard deviations ranged from 0.16% to 1.87%. Conclusion: The method is simple to operate, short detection time, and has high accuracy and accuracy.Keywords: organic acid; grape; wine; high performance liquid chromatography; detection method有机酸是葡萄果实及葡萄酒中体现风味的主要物质之一，其含量是衡量葡萄果实成熟度和品质的重要参数，在葡萄酒的酿造中发挥着关键作用，对酒的感官质量有一定的影响，与酒的物理化学以及微生物稳定性有着紧密联系[1-4]。
实用高效液相色谱法的建立破解版
液相色谱方法开发（实例讲解）2010© 未经许可，不得复制。
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色谱分离与在线检测技术已经成为当今分析化学的一门重要学科，而因其衍生出的相关产品也日益丰富。
对色谱工作者来说，在面对具体方法开发中如何获得适当的分离度则成为关注的焦点。
本文仅从网络上的资源收集简要介绍反相液相色谱法的建立思路。
一、 基本术语基本术语读者可跳过本部分内容，直接阅读实例讲解部分在评价色谱分离的品质时，通常用以下相关术语来反映色谱特征（如图1.）：图1. 典型色谱图1. 保留因子(k)：t t t k R −=(1) 用于反映化合物的色谱保留性质，跟化合物性质有密切关系。
如图1，设t R1 =3.65min, t 0 =1.20min, 则峰1的保留因子为：(3.65-1.20)/1.20=2.042. 拖尾因子(T f )液相色谱方法开发（实例讲解）2010© 未经许可，不得复制。
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aba f W W W T 2+=(2)图2. 典型拖尾峰在理想情况下，色谱峰为高斯型对称峰，其拖尾因子为1.0，但在实际情况中，由于化合物的二次保留等其他因素，色谱峰大多会呈现一定程度的拖尾。
如图2中，该色谱峰的拖尾因子可计算得：{(41.5-37.0)+(37.0-35.0)}/{2*(37.0-35.0)}=1.63.3. 理论塔板数（N ）液相色谱方法开发（实例讲解）2010© 未经许可，不得复制。
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图3. 峰高与峰宽的关系2(16Wt N R= (3) 或2(54.55.0W t N R= (4) 注意：在上式中W 为图3中的W b ，为基线峰宽(4σ)，W 0.5 为峰高一半处的峰宽W h (2.335σ), 并非峰宽的一半(2σ)。
设图1中峰1的基线峰宽为0.25min, 则塔板数为：16*(3.65/0.25)^2=34104. 分离因子(α)10212t t t t k k R R −−==α (5) 又称两个色谱峰的相对保留值。
HPLC分析方法的建立与开发
食品检测中的应用
食品添加剂检测
利用HPLC方法，可以检测食品中的防腐剂、色素、甜味剂等添加剂的含量，确保食品的 安全性。
食品营养成分分析
通过HPLC技术，可以对食品中的蛋白质、脂肪、糖类等营养成分进行分离和定量，评估 食品的营养价值。
食品中有害物质检测
利用HPLC方法，可以检测食品中的农药残留、重金属、生物毒素等有害物质，保障人们 的饮食安全。
流动相选择
根据目标化合物的极性和色谱柱的性质选择合适 的流动相，如甲醇、乙腈、水等，以及合适的流 动相比例和梯度洗脱程序。
色谱条件优化
通过调整流动相比例、流速、柱温等参数，优化 色谱分离效果，提高目标化合物的分辨率和峰形 。
检测方法确定
检测器选择
根据目标化合物的性质选择合适的检测器， 如紫外检测器、荧光检测器、蒸发光散射检 测器等。
合物充分溶解。
样品净化
02
通过固相萃取、液液萃取等方法去除干扰物质，提高目标化合
物的分离效果。
样品浓缩
03
采用蒸发、旋转蒸发等方法将提取液浓缩至合适体积，便于后
续进样分析。
色谱条件选择
1 2 3
色谱柱选择
根据目标化合物的性质选择合适的色谱柱，如 C18、C8、硅胶等，确保目标化合物在色谱柱上 有良好的保留和分离效果。
06
HPLC分析方法的挑战 与展望
复杂样品分析挑战
样品前处理
对于复杂样品，如生物样品或环境样品，需要进行繁琐的 样品前处理步骤，如提取、净化、浓缩等，以消除干扰物 质并提高目标化合物的检测灵敏度。
分离效果
复杂样品中往往存在多种化合物，其理化性质相近，难以 在HPLC分析中实现有效分离，导致分析结果不准确。
高效液相色谱实验报告
高效液相色谱实验报告一、实验目的。
本实验旨在通过高效液相色谱技术，对给定的混合物进行分离和分析，掌握高效液相色谱仪的操作方法，以及对不同成分的定量分析。
二、实验原理。
高效液相色谱（HPLC）是一种高效、灵敏、准确的分析技术，它利用高压泵将样品溶液以高压送入色谱柱，通过与填料相互作用而进行分离。
在色谱柱中，不同成分将因其在填料中的亲和力不同而被分离开来。
通过检测器检测各个组分的峰面积或峰高，从而进行定量分析。
三、实验步骤。
1. 样品制备，将待分析的混合物溶解于适当的溶剂中，并进行过滤处理。
2. 色谱柱准备，连接色谱柱，并进行平衡处理。
3. 仪器调试，将色谱仪的流动相、检测器等参数进行调试。
4. 样品进样，将处理好的样品通过自动进样器送入色谱柱。
5. 数据采集，通过色谱仪软件进行数据采集和记录。
6. 数据分析，根据色谱图进行各组分的峰识别和定量分析。
四、实验结果。
通过本次实验，我们成功地对给定的混合物进行了分离和定量分析。
得到了混合物中各组分的峰面积和峰高，并通过标准曲线进行了定量分析。
实验结果表明，本实验的色谱分离效果良好，各组分分离度高，定量分析结果准确可靠。
五、实验总结。
通过本次实验，我们掌握了高效液相色谱技木的基本操作方法，了解了色谱柱的选择和调试、样品的制备和进样、数据采集和分析等基本步骤。
同时，我们也认识到了高效液相色谱技术在化学分析中的重要性和广泛应用性。
希望通过今后的实验操作，能够进一步提高我们的操作技术和分析能力。
六、参考文献。
1. Skoog, D. A., Holler, F. J., & Crouch, S. R. (2017). Principles of instrumental analysis. Cengage Learning.2. Snyder, L. R., Kirkland, J. J., & Glajch, J. L. (2011). Practical HPLC method development. John Wiley & Sons.以上就是本次高效液相色谱实验的全部内容，希望对大家有所帮助。
液相色谱分析方法建立-系列一基本理论及色谱介绍
硅 胶 的 溶 解 曲 线
1 2 3 4 5 6 7 8 9 p H
硅胶表面键合相的水解（PH<2）
O
OH
Si
O
+
O
“Column Bleed”
H3C
C
C
C
C
Si
C
C
C
CH3
Cl
CH3
O
+ H3C
C
C
C
C
Si
C
C
C
CH
O 硅胶表面未被键合的酸性硅羟基将会与被分析物相互作用，特别是在 中性条件下会对强碱性化合物产生严重的峰形拖尾。
O 封尾工艺使得表面残余的硅羟基被进一步的消除，为小分子所取代。 O 封尾工艺能促使色谱柱对极性和碱性化合物的分离具有良好的峰形。
50
色谱柱的pH值
O 填料的pH稳定性 O 硅胶填料 pH：2-8 O 聚合物填料 pH：2-12 O 杂化硅胶填料 pH：2-12
O
Low pH (hydrolysis of ligand)
O Si
O
O
OH
+
H3C
C
C
C
C
Si
C
C
C
CH3
HO
CH3
硅胶的溶解（PH>8）
Nucleophilic attack
• Complete dissolution of Silica
• Catastrophic column failure
蒸发光散射
任何挥发性低于流动相的样 品均能被 检测
可检测所有物质。
赛默飞高效液相色谱使用方法
赛默飞高效液相色谱使用方法
赛默飞高效液相色谱（HPLC）是一种用于分离和分析样品的精密仪器。
具体的使用方法如下：
1.准备工作：
○确保仪器电源已开启。
○安装∗∗谱柱和其他相关配件。
○准备样品和流动相。
2.建立方法：
○进入液相色谱仪的操作界面，选择适宜的色谱柱。
○设置流动相的种类、比例和流速。
○设置样品进样体积和积分时间。
3.进样：
○将样品溶液注入进样器。
○按下开始按钮，液相色谱仪会自动进行分离和检测。
4.数据处理：
○分析结束后，仪器会自动生成色谱图。
○通过数据分析软件对色谱图进行处理，获取目标物质的保留时间、峰面积等数据。
5.清洗和维护：
○实验结束后，关闭仪器电源。
○清洗色谱柱和其他配件。
○定期检查仪器状态，确保正常运行。
需要注意的是，具体操作步骤可能因仪器型号和实验需求而有所不同。
在使用液相色谱仪时，请务必参考相应的说明书并进行培训。
。
高效液相色谱法标准操作规程
高效液相色谱法标准操作规程1. 目的建立高效液相色谱法标准操作规程，规范高效液相色谱法检验操作，保证检验操作规范化。
2. 范围适用于高效液相色谱法检验操作。
3. 术语或定义N/A4. 职责质量控制部对本规程的实施负责。
5. 程序5.1依据《中国药典》2020年四部及2019年版《中国药品检验标准操作规范》。
5.2 简述高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品，由流动相带入柱内，各组分在柱内被分离，并依次进入检测器，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
5.3 对仪器的一般要求所用的仪器为高效液相色谱仪，由输液泵、进样器、色谱柱、检测器和色谱数据处理系统组成，仪器应按现行国家技术监督局“液相色谱仪检定规程”定期检定并符合有关规定。
5.3.1色谱柱最常用的色谱柱填充剂为化学键合硅胶。
反相色谱系统使用非极性填充剂，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶（如氰基键合硅烷和氨基键合硅烷等) 也有使用。
正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。
离子交换色谱系统使用离子交换填充剂; 分子排阻色谱系统使用凝胶或高分子多孔微球等填充剂；对映异构体的分离通常使用手性填充剂。
填充剂的性能（如载体的形状、粒径、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等）以及色谱柱的填充，直接影响供试品的保留行为和分离效果。
孔径在15nm(lnm=10A)以下的填料适于分析分子量小于2000的化合物，分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填料。
除另有规定外，分析柱的填充剂粒径一般在3～10μm之间。
粒径更小(约2μm)的填充剂常用于填装微径柱（内径约2mm) 。
使用微径柱时，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配；如有必要，色谱条件也需作适当的调整。
当对其测定结果产生争议时，应以品种正文规定的色谱条件的测定结果为准。
液相色谱常见问题及处理方法(LCMS)资料
常用弱酸的pKa
pK1
醋酸
4.87
柠檬酸
3.13
磷酸
2.16
pK2
4.76 7.2 1
pK3
6.40
12.32
22
6. 不使用时，两头要盖上盖子，避免固定相干枯。
7. 使用预柱。
8. 避免流动相组成及极性的剧烈变化（梯度洗脱）
9、避免压力脉冲的剧烈变化
14
肩峰或分叉峰产生的原因：
1. 柱子劣化 （柱头处产生不均匀的空隙）
2. 样品变化 （生成氧化物、分解物等）
判断标准：
所有的峰都产生有肩峰或分叉时则为柱子劣化。
1. 在使用新柱之前，最好用强洗脱溶剂在低流量下 (0.2-
0.3 ml/min)冲洗 30 min，长时间未用的分析柱也要同
样处理。
2. 定期使用强洗脱溶剂冲洗柱子。
3. 使用缓冲盐作为流动相后，要先用水（含有少量甲醇
5~10%）冲洗，再用有机溶剂（甲醇）冲洗。
4. 净化样品。
5. 分离条件优化（防止鬼峰出现）。
使宝石球与垫片分开 2）拆下单向阀，放入异丙醇或水中，
用超声波清洗
故障2：宝石球或塑料垫片受污导致密封不好。 表现：系统压力波动大 措施：拆下单向阀，放入异丙醇或水中，用超声波清
洗。
7
2. 柱塞密封圈
密封圈
柱塞杆 泵头清洗管路 流动相
故障：密封圈磨损而导致 密封不良
现象：系统压力波动大或 漏夜
措施：更换密封圈 注意点：更换密封圈拆卸
19
2. 脱气： 除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡。
气泡对测定的影响：
1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积； 2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形； 3）气泡过多可使泵压力不稳甚至停止工作； 4）检测器中的气泡产生基线波动，
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样品情况的了解:
测定成分的数量以及性质相似程度: 单一成分的测定,最简单，随着测定成分的增
加，分析的难度增加； 组分性质的相似程度越高，分析的难度越高。
问题:组分性质的相差越大,分析的难度越低，是否越 有利于多组分分析？
查阅有关的文献资料
文献资料——有: 在文献的基础上,调整、改善。
不排除在文献基础上全面创新。
除去杂质，纯化样品，防止色谱柱的堵塞。如生物样 品中的蛋白质、叶绿素、固体微粒等。
富集浓缩样品或进行衍生化，以达到色谱分析的检测 限。
进行样品预处理的必要性
样品只有成为液体状态才能直接进行HPLC分析。 虽然色谱分析具有很强的处理复杂样品的能力,但样
反相高效液相色谱（RP-HPLC） 分析方法的建立
什么是色谱？
色谱是一种建立在一定的科学理论基础上的分离 方法（工具、手段）。
除色谱之外,经典（常见）的分离方法: 蒸馏、离心、电泳、过滤、沉淀、萃取等等
色谱
是一种高效能 的分离方法
色谱分析
以一定的科学理论为基础,在高效能的分离基础 上，结合先进的检测方法而建立的现代分析方 法。
分析方法选择的大致程序（以药典分析方法为例）: 滴定分析（原料药、制剂定量分析） 紫外可见光度分析（原料药、制剂定量分析） 薄层色谱（鉴别、有关物质检查等；半定量分析） HPLC（中药饮片、中药制剂的鉴别或有关物质的
检查；复杂样品定量分析等）
什么情况下使用HPLC？
1、对分析结果、测定速度和效率的要求 准确度要求:准确定量（RSD<5％） 测定速度和效率：快速,单一或多组分测定。
影响分离度的因素:k、α及n
分离度方程:
Rk2k 2 11
n 4
k 是容量因子,表达了被分离组分与柱填料之
间作用的强弱
α是分离因子，描述两个被分离组份容量因子
的相对大小。 α ＝ k2/ k1
n是理论塔板数，描述组分被保留的程度以及
色谱峰谱带展宽的程度
分离度是色谱分离中主要考虑的因素
除分离度之外,在设计色谱方法时，以下几个因
在技术、理论及应用上已进入一个较高的水平， 并高速发展。
HPLC的基本配置及流程
HPLC色谱柱
数据处理系统
溶剂
手动/自动 进样器
色谱泵
检测器
废液
HPLC的仪器配置
数据处理系统
溶剂 泵系统 自动进样器 色谱柱及柱温箱 检测器
色谱的发明人——茨维特（M. S. Tswett）
俄国科学家茨维特1903年利用物质的吸附原理,
什么是高效液相色谱法？
High Performance Liquid Chromatography 高效液相色谱法,简称:HPLC
是一种区别于经典液相色谱，基于现代仪器方法 的高效能分析方法： 高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以 及高灵敏度、高选择性的检测器……
广泛应用于各个领域： 医药 / 环保 / 石化 / 生命科学 / 食品及农业……
理论塔板数计算公式:
n
16
tR
2
W
n
5.54
tR Wh/2
2
理论塔板数n :描述组分被保留的程度以及色谱 峰谱带展宽的程度。
塔板数越大,柱效越高。
tR = 5
W = .5
n
16
t R
2
W
W= 2
n 16 t R 2 W
n
16
5
2
.5
n 16 5 2 2
n 1600
2、样品情况 样品的复杂情况：HPLC适用于复杂样品的分析，
如中药分析、环境分析、体内药 物分析、临床药物分析等。
HPLC方法建立的前期工作
样品情况的了解:
样品的种类（来源）：植物（中草药）、合成中 间体、生物样品（血液、尿液、组织匀浆等） ……
样品的种类决定了样品的复杂程度（基质影响）, 从而可初步判定测定的难易程度并且为分析方法 的确立设计一个大致的方向。
开创了应用吸附原理分离植物色素 的新方法。
1906年正式命名
色谱法；Chromatography
30年代开始广泛研究和应用
主要是气相色谱及薄层色谱
高效液相色谱法的广泛应用始于70年代
色谱的发明人
俄国科学家 M. S. Tswett
正式命名“色谱”的文献中的一段话
什么情况下使用HPLC？
一般情况下HPLC不是分析方法的首选
n 100
tR与W 是一对矛盾,tR/W 可以很好地表达这 对矛盾的情况。
影响柱效的因素很多,可以从色谱理论 进行分析，如塔板理论、速率理论等，具 体内容参见有关教科书或专著。
评价液相色谱方法的标准 什么是色谱的分离度
tR1
tR2
分离度的公式:
R tR2 tR1
1 2
(W2
W1
)
R:分离程度的量度 简称分离度
文献查阅时应注意的基本内容
液相色谱实验所需的基本参数 样品预处理方案 对照品（标准品）的配制方法 流动相:种类及配比,等度或梯度？ 固定相：色谱柱类型、颗粒大小及内径、长短 流动相输送系统参数：流速 检测器及相应参数：如紫外检测波长，灵敏度等 温度控制 进样量
以上参数即构成一个具体的HPLC方法；亦称 色谱分析条件。
待测成分的性质:极性、水溶性、脂溶性、酸碱性 等
对方法的建立,有重要的指导意义。
样品情况的了解:
待测成分的结构特征: 对色谱柱的选择具有一定的指导意义（不是很明
显）； 对检测器的选择具有指导意义, 如：含有生色团（助色团），紫外有吸收，特别
是芳香族化合物，可考虑使用紫外检测器 待测成分的含量：
决定对柱效的要求（柱效高，可有较低的检测限） 决定对检测器灵敏度的要求
查阅有关的文献资料
文献资料——无:
结合样品的情况,首先应作一些试探性的工
作。 （见后面）
评价高效液相色谱方法的标准
只有更好,没有最好！
问题:什么样的分离结果是好的？ 答：用尽可能少的时间和消耗（人力、物力、财 力等）满足分析的要求（准确度、灵敏度、分析 速度等）。
评价液相色谱方法的标准
理论塔板数n :分离效率（柱效）的量度
素也都要考虑:
灵敏度
载样量
成本
分析速度
容易使用（简单）
溶剂损耗
色谱柱寿命
根据评价液相色谱方法的标准, 进行试探性工作
文献资料查询——无 根据评价液相色谱方法的标准,结合样品的情况
，作一些试探性的工作
一、根据了解的样品信息以及分析目的, 建立样品预处理方案
色谱分析样品预处理的主要目的
将待测物质有效地从样品基质中释放出来,制成便于分 析测定的稳定液体试样。如:中草药或中成药有效（指 标）成分分析；体液中药物或代谢物含量的测定等。