实用高效液相色谱法的建立破解版
高效液相实验室用计算机系统验证方案
食堂、宿舍A土方开挖实验室用计算机系统验证方案设备名称：LabSolutins工作站设备位置：精密仪器室设备用途：LC-2030岛津高效液相色谱仪操作系统验证编号：YZ-ZL-验证时间：目录页脚内容28食堂、宿舍A土方开挖立项申请表 (3)一、概述 (4)二、验证目的 (4)三、验证范围 (4)四、验证所需具备的条件 (4)五、验证内容 (4)1、系统安装条件验证 (4)2、计算机系统安全性验证 (5)3.工作站登录方式验证 (9)4.工作站用户权限验证 (12)5.工作站中方法权限验证 (17)6.工作站审计功能验证 (19)7.工作站数据安全性验证 (21)8.偏差 (25)六、验证实施 (26)七、验证数据汇总 (26)八、验证小组组成及职责 (26)九、验证计划进度 (26)十、参考文献 (26)十一、验证报告与验证证书 (27)立项申请表页脚内容28食堂、宿舍A土方开挖一、概述为保证检验数据完整性和产品质量，应对检验过程中使用的计算机及工作站进行安全性验证，本方案是针对我公司安装的计算机以及LabSolutins工作站进行验证。
页脚内容28食堂、宿舍A土方开挖二、验证目的通过对计算机及工作站进行验证，规范检验用计算机系统，保证工作站的正常运行，确保计算机系统的准确性、真实性、可靠性及检验数据的完整性。
三、验证范围本方案适用于岛津高效液相色谱仪LabSolutins工作站计算机系统。
四、验证所需具备的条件1、LC2030岛津高效液相色谱仪2、LabSolutins工作站3、联想品牌电脑（高液专用）4、五、验证内容1、系统安装条件验证检查计算机安装的环境，位置，是否能满足计算机及工作站的正常运行需要。
验证结果：验证结论：□合格□不合格、验证人：日期：.页脚内容28食堂、宿舍A土方开挖2、计算机系统安全性验证1.计算机登录方式验证接通计算机电源，启动计算机后，计算机是否是直接进入操作系统界面还是出现选择用界面；选定用户后，是否直接登录还是需输入密码后才能登录。
高效液相色谱设计方案
药物分析设计性实验设计方案维生素C及其制剂的含量测定药学2011级（2）班李智（1103501275）李集毅（1103501276）指导教师：***2014 年 4 月高效液相色谱测定维生素C片剂含量一、实验目的1. 掌握一般药物含量测定实验的设计方法2. 掌握维生素C高效液相色谱法含量测定的原理和方法3. 掌握标准曲线法在药品含量测定检验中的运用二、实验器材仪器：岛津高效液相色谱仪,色谱柱C18;电子天平;烧杯,棕色容量瓶（50ml*7）0.145μm滤膜，棕色容量瓶（20ml*2）试剂：维生素C片（0.1g/片）（市售），维生素C标准对照品（0.1mg/ml）;二次蒸馏水，甲醇（0.1mg/ml色谱纯），草酸（分析纯），磷酸二氢钾（分析纯），磷酸氢二钾（分析纯）三、实验原理1. 标准曲线法：采用梯度浓度稀释法，将对照品溶液稀释至不同浓度的待测溶液，制备成标准溶液，用高效液相色谱法按标准进样得样品吸收峰（峰面积），绘制成标准曲线。
2. 将供试品制剂制成规定含量的待测品，进行高效液相色谱测定，对比对照品溶液标准曲线，查看供试品是否符合含量测定要求四、实验内容1色谱条件色谱柱C18，流动相:磷酸盐缓冲溶液(pH=5.18):甲醇=95：5,流速0.18ml/min,紫外检测器,检测波长254 nm,进样10ul。
2供试品溶液与对照品溶液的制备（1）取本品20片(规格0.1g),精密称定,研细,取本品1片(约相当于维生素C100mg)，将待测样品用0.1%的草酸溶解至20ml容量瓶，定容；取上述样品1ml 于50ml的容量瓶中，用0.1%的草酸精确定容，制成每1ml含0.1mg的溶液，分析前用0.145μm滤膜过滤。
（2）维生素C对照品溶液的制备:精密称取维生素C对照品适量,加0.1%的草酸使溶解制成0.1mg/ml的标准溶液。
3 标准工作曲线的绘制精密称取对照品50.80mg置50ml量瓶中,用0.1%草酸溶液稀释至刻度,精密量取0.5ml,2.5ml,5ml,12.5ml,25ml 分别置50ml量瓶中,用0.1%草酸溶液稀释至刻度,制成维生素C标准溶液,用0.45um滤膜过滤,用微量进样器进样10ul,依次测出峰面积,然后以维生素C标准溶液质量浓度(mg/ml)作自变量,相对应的峰面积作因变量,绘制标准工作曲线,标准曲线的相关系数R=0.9999,说明曲线的线性关系良好。
安捷伦高效液相色谱仪软件重装
高效液相色谱仪软件重装*注：此方法适用于Agilent HPLC 1260的软件重装；重装前先与领导、工程师确定重装条件与方法；不到重装的地步万万不能重装。
1.原因：SJYQ-201仪器调用方法要等上半天，工程师检查，判断是C盘文件过多，导致系统过慢，建议重装系统，重装软件。
并且以前的软件和数据都是储存在C盘，即使已经将数据拷到其他盘，仍然会有卡机现象。
重装前准备2.重装系统之前，先将C盘和桌面（也是属于C盘）的重要文件拷到其他的磁盘；同时备份C盘。
同时建议也先将已经上机的序列图谱，需要打图的先将图谱打印出来（因为在重装期间不方便打印）。
3.应对不同配置的电脑安装XP或者win 7。
过高或过低的系统版本会导致运行系统过慢。
系统重装不一一讲述。
软件重装4.重装软件前，先确认我们是否有安装证书（一般第一次工程师安装结束后会放在D盘里，文件类型为LIC），用于安装结束后进行安装认证。
（未进行安装认证试用期有30天，认证后可永久试用），以记事本的方式打开安装证书后，可看到该电脑的名字，然后在我的电脑上修改名字，需要改为与证书上一致（否则无法认证），确认已经关闭防火墙。
5.放入光盘时按照光盘顺序逐一放入即可（光盘有写着dish 1，dish 2，dish 3和dish 6）这4张；装入第一张（dish1）的时候第一个文件只能保存在C盘（否则当你装入第二张光盘是会显示安装失败），第二个文件（即软件）不要保存在C盘，保存在其他盘里。
按照光盘顺序要求放入即可，安转结束后可能需要重新启动电脑。
6.安装结束后，将IP地址改为192.168.254.10（我们平时配置仪器的时候IP地址是192.168.254.11）。
然后打开控制面板，创建仪器，验证许可证（存放的位置D盘里，文件类型为LIC），同时将新创建的仪器创建快捷方式，即可打开。
7.安装Agilent Lab advisor LC（仪器维修维护软件）。
检验站液相室2017.01.12。
高效液相法进行含量测定的实施计划
高效液相法进行含量测定的实施计划
目标：建立并验证高效液相色谱法（HPLC）用于测定样品中特定成分含量的分析方法。
步骤：
1. 方法开发
选择合适的流动相、色谱柱和检测波长。
优化色谱分离条件，包括流速、梯度洗脱和柱温。
2. 方法验证
线性度：绘制已知浓度样品的峰面积与浓度的关系图，评估方法的线性范围。
精密度：重复分析相同样品，计算峰面积的相对标准偏差（RSD）。
准确度：分析已知浓度的样品，计算测定值与真实值的偏差。
选择性：评估方法是否能区分目标成分和样品中的其他成分。
稳定性：在不同的时间点分析同一批样品，评估方法的稳定性。
3. 样品制备
根据样品基质，选择合适的样品前处理方法，如萃取、过滤或衍生化。
优化样品制备条件，以最大程度地提取目标成分并减少基质干扰。
4. 仪器校准
使用已知浓度的标准溶液校准HPLC系统。
定期验证校准曲线，以确保方法的准确性。
5. 样品分析
根据验证后的方法，分析样品并计算目标成分的含量。
使用适当的定量方法，如峰面积法或外标法。
6. 数据分析
处理HPLC数据，包括峰积分、定量计算和统计分析。
根据验证结果，评估分析结果的可靠性和有效性。
7. 报告
生成分析报告，包括样品信息、分析条件、结果和任何相关的观察结果。
报告应符合相关法规和指南。
持续改进
定期审查和更新方法，以提高性能和适应新的发现。
接受持续的培训，以保持对HPLC技术的最新了解。
岛津高效液相色谱仪Labsolutions DB计算机系统确认报告
岛津高效液相色谱仪Labsolutions DB 计算机系统确认报告(文件编码：xxxx-xx-xx)xxxx有限公司二O一六年目录1 概述2 确认目的3 确认范围4 确认涉及的方案5 确认小组及职责6 风险评估7 确认内容7.1计算机确认7.2 软件确认7.3 对仪器控制的确认8 偏差处理9 确认结论及评价10 再确认周期11 附件岛津高效液相色谱仪Labsolutions DB计算机系统确认报告1 概述本公司岛津高效液相色谱仪Labsolutions DB计算机系统，应用于检验室岛津高效液相色谱仪，满足最新的数据完整性要求，为LC solution色谱工作站的升级版本。
2.确认目的对计算机中与仪器联用的Labsolutions DB计算机系统进行确认，规范计算机系统，保证工作站的正常运行，确保计算机系统的准确性、真实性、可靠性。
3. 适用范围本方案适用于本公司岛津高效液相色谱仪Labsolutions DB计算机系统的确认。
4 确认涉及的方案岛津高效液相色谱仪Labsolutions DB计算机系统确认方案(文件编码：BQY-FA-1302-00-2016)5 确认小组及职责6 风险评估主要针对本公司岛津高效液相色谱仪Labsolutions DB计算机系统进行风险评估。
风险等级定性（量）表风险等级表检验仪器工作站风险评估表7 确认内容7.1 仪器校验情况的确认检验所需仪器应经过有资质的单位进行校验，校验合格后方能使用。
7.2文件资料的确认7 确认内容7.1 计算机确认7.2软件确认7.2.2账号、密码管理7.2.3数据保存与备份7.2.4审计跟踪7.3 对仪器控制的确认确认软件设定值与设备实际测定值是否一致，包括对通过软件可设定的所有设备参数的一致性确认。
8 偏差处理确认过程应严格按照确认方案进行，□出现、□未出现偏差。
9 确认结论及评价_____________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ _____________________________________________________________________________________ 10 再确认周期10.1设当有重大变更时如重新安装软件、更换主板、内存等应及时进行再确认；10.2更换主要部件或对仪器性能有怀疑时，应进行再确认。
rational_Rose破解版安装详细步骤图解(2003版的)
学习计算机专业的朋友们都会学习《系统分析与设计》这门课程，因此都会用到rational_rose 软件画用例图！下面给各位分享一下安装方法，找不到下载地址的可以给我留言！！
下载一个破解版的rational rose
首先解压rational rose
然后打开找到setup.exe可执行文件
双击
双击
然后点击下一步会出现：
记住一定要选择enterprises edition，然后点击下一步会出现：
这要默认选择然后下一步：
然后点击
然后点击
选择同意后点击next
可以点击change更改安装目录，本人是装在也可以不改，但是良好的习惯就不要装太多的东西在C盘
这些要默认点击next就可以了
再点
如果出现这
请选择YES
重启之后会出现
直接点击下一步就是了然后在这选择MODIFY
再根据提示操作就是了到了这一步要注意：
要选择第二个import a rational lience file
点击下一步这个文件就是你解压的rational安装包里面的：C:\Users\Administrator\Desktop\IBM.Rational.Rose.Enterprise.Edition.2003.for.Windows破解版\Rational Rose 2003破解版\crack\alllic.upd(这我是解压到桌面的)
然后点击import就是了最后就完成了
你会看到你的开始菜单------程序已经有了：
（下面的是下载地址）。
实用高效液相色谱法的建立
液相色谱方法开发（实例讲解）2010© 未经许可，不得复制。
转载请注明出处。
色谱分离与在线检测技术已经成为当今分析化学的一门重要学科，而因其衍生出的相关产品也日益丰富。
对色谱工作者来说，在面对具体方法开发中如何获得适当的分离度则成为关注的焦点。
本文仅从网络上的资源收集简要介绍反相液相色谱法的建立思路。
一、 基本术语基本术语读者可跳过本部分内容，直接阅读实例讲解部分在评价色谱分离的品质时，通常用以下相关术语来反映色谱特征（如图1.）：图1. 典型色谱图1. 保留因子(k)：t t t k R −=(1) 用于反映化合物的色谱保留性质，跟化合物性质有密切关系。
如图1，设t R1 =3.65min, t 0 =1.20min, 则峰1的保留因子为：(3.65-1.20)/1.20=2.042. 拖尾因子(T f )液相色谱方法开发（实例讲解）2010© 未经许可，不得复制。
转载请注明出处。
aba f W W W T 2+=(2)图2. 典型拖尾峰在理想情况下，色谱峰为高斯型对称峰，其拖尾因子为1.0，但在实际情况中，由于化合物的二次保留等其他因素，色谱峰大多会呈现一定程度的拖尾。
如图2中，该色谱峰的拖尾因子可计算得：{(41.5-37.0)+(37.0-35.0)}/{2*(37.0-35.0)}=1.63.3. 理论塔板数（N ）液相色谱方法开发（实例讲解）2010© 未经许可，不得复制。
转载请注明出处。
图3. 峰高与峰宽的关系2(16Wt N R= (3) 或2(54.55.0W t N R= (4) 注意：在上式中W 为图3中的W b ，为基线峰宽(4σ)，W 0.5 为峰高一半处的峰宽W h (2.335σ), 并非峰宽的一半(2σ)。
设图1中峰1的基线峰宽为0.25min, 则塔板数为：16*(3.65/0.25)^2=34104. 分离因子(α)10212t t t t k k R R −−==α (5) 又称两个色谱峰的相对保留值。
高效液相色谱原理和操作详解
高效液相色谱我国药典收载高效液相色谱法项目和数量比较表：鉴于HPLC应用在药品分析中越来越多，因此每一个药品分析人员应该掌握并应用HPLC。
I．概论 (3)一、液相色谱理论发展简况 (3)二、HPLC的特点和优点 (4)三、色谱法分类 (5)四、色谱分离原理 (5)II．基本概念和理论 (10)一、基本概念和术语 (10)二、塔板理论 (17)三、速率理论（又称随机模型理论） (19)III．HPLC系统 (22)一、输液泵 (23)二、进样器 (27)三、色谱柱 (29)四、检测器 (35)五、数据处理和计算机控制系统 (41)六、恒温装置 (42)IV．固定相和流动相 (43)一、基质（担体） (43)二、化学键合固定相 (46)三、流动相 (49)1．流动相的性质要求 (49)2．流动相的选择 (50)3．流动相的pH值 (51)4．流动相的脱气 (52)5．流动相的滤过 (53)6．流动相的贮存 (54)7．卤代有机溶剂应特别注意的问题 (54)8．HPLC用水 (55)V．HPLC应用 (56)一、样品测定 (56)二、方法研究 (58)附件：高效液相色谱法（HPLC）复核细则 (58)一、对起草单位的要求： (58)二、对复核单位的要求： (59)I．概论一、液相色谱理论发展简况色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。
又称为色层法、层析法。
色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。
后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。
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液相色谱方法开发（实例讲解）2010© 未经许可，不得复制。
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色谱分离与在线检测技术已经成为当今分析化学的一门重要学科，而因其衍生出的相关产品也日益丰富。
对色谱工作者来说，在面对具体方法开发中如何获得适当的分离度则成为关注的焦点。
本文仅从网络上的资源收集简要介绍反相液相色谱法的建立思路。
一、 基本术语基本术语读者可跳过本部分内容，直接阅读实例讲解部分在评价色谱分离的品质时，通常用以下相关术语来反映色谱特征（如图1.）：图1. 典型色谱图1. 保留因子(k)：t t t k R −=(1) 用于反映化合物的色谱保留性质，跟化合物性质有密切关系。
如图1，设t R1 =3.65min, t 0 =1.20min, 则峰1的保留因子为：(3.65-1.20)/1.20=2.042. 拖尾因子(T f )液相色谱方法开发（实例讲解）2010© 未经许可，不得复制。
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aba f W W W T 2+=(2)图2. 典型拖尾峰在理想情况下，色谱峰为高斯型对称峰，其拖尾因子为1.0，但在实际情况中，由于化合物的二次保留等其他因素，色谱峰大多会呈现一定程度的拖尾。
如图2中，该色谱峰的拖尾因子可计算得：{(41.5-37.0)+(37.0-35.0)}/{2*(37.0-35.0)}=1.63.3. 理论塔板数（N ）液相色谱方法开发（实例讲解）2010© 未经许可，不得复制。
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图3. 峰高与峰宽的关系2(16Wt N R= (3) 或2(54.55.0W t N R= (4) 注意：在上式中W 为图3中的W b ，为基线峰宽(4σ)，W 0.5 为峰高一半处的峰宽W h (2.335σ), 并非峰宽的一半(2σ)。
设图1中峰1的基线峰宽为0.25min, 则塔板数为：16*(3.65/0.25)^2=34104. 分离因子(α)10212t t t t k k R R −−==α (5) 又称两个色谱峰的相对保留值。
只有当α>1时，两个色谱峰才有分离的可能性。
设在图1中峰2的保留时间为6.50min, 则分离因子为: (6.50-1.20)/(3.65-1.20)=2.16液相色谱方法开发（实例讲解）2010© 未经许可，不得复制。
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5. 分离度 (R s )12122W W t t R R R s +−= (6)分离度用于评价色谱分离的品质，通常当R s >1.5时，则认为两峰达到基线分离（完全分离）。
设在图1中峰2的基线峰宽为0.45min ，则峰1与2的分离度为：2*(6.50-3.65)/(0.25+0.45)=8.1上式为分离度的定义公式，用于精确计算两个色谱峰的分离度，而由此可推出如下为色谱工作者的经验公式：1*)1(*4/+−≈k kN R s α (7)该式为经验公式，其目的在于描述分离度与理论塔板数、分离因子和保留值三者之间的关系，多用于指导色谱分离方法的建立，而不用于具体计算。
二、分析方法的建立分析方法的建立（（实例讲解实例讲解））简要介绍了色谱的基本术语，下面用实例来介绍分析方法的建立过程。
1. 准备工作准备工作在进行方法开发的时候，应记住良好的方法要具有以下三个要素：能提供适当的分离度（通常要求R s >1.5）方法运行时间要适中，以利于日常分析方法应具有稳定性，可以在不同实验室之间移植在进行方法开发之前，应该对所分析样品和仪器设备进行信息剖析：样品的来源（单一化合物，生物样品，提取物等）及是否前处理； 样品的溶解度；所分析化合物的结构（是否有官能团，发色基团等）及酸碱性；化合物的分子量（常规小分子，M<1000；生物大分子及聚合物，1000<M<10,000）；仪器配置（柱类型，监测器类型，可否梯度洗脱）； 方法要求（定性，定量，制备，指纹图谱）2. 建立步骤建立步骤在了解了上述信息后，即可进行方法开发了：本例是对含有5个苯取代化合物的样品进行分离。
通过对样品的结构解析，得到如下信息：5个化合物为中性分子，分子量都低于200，在甲醇等有机溶剂中溶解，不溶于水。
含有苯环，在254nm 处有明显的紫外吸收。
在了解以上信息后，并综合文献，选择了Eclipse(Agilent) C18色谱柱, 规格4.6×150mm, 填料粒径5µm 。
液相色谱仪为Agilent 1200 型，配置Chemstation 工作站，VWD 检测器，液相色谱方法开发（实例讲解）2010© 未经许可，不得复制。
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四元低压梯度泵，柱温箱和自动进样器。
流动相选用乙腈-水系统。
样品直接用甲醇稀释定容。
通常在方法开发之前建议先运行一个全范围的线性梯度洗脱（如0-100%乙腈），它会给后续是否采用等度洗脱还是梯度洗脱提供非常重要的信息。
在本例中，首先运行一个梯度持续时间25min ，乙腈浓度范围为5-100%，流速为1.0ml/min ，检测波长为254nm ，柱温为30o C 。
色谱图如下：图4. 初始梯度运行结果在上述的条件下，所有色谱峰的平均保留因子(k’___)约在4~5之间。
在对上述图谱解析时，会运用到Snyder-Dolan 提出的“1/4规则”：当所有色谱峰的保留范围小于全梯度时间范围的1/4（即25%）时，则建议采用等度洗脱，若大于1/4时，则建议采用梯度洗脱。
在图4中，第一个化合物峰1的保留时间为17.046min, 最末一个化合物峰5的保留时间为19.008min, 整个梯度时间为25min ，计算可得：∆t R /t G (19.008-17.046)/25=0.08<0.25, 则可以运用等度洗脱进行分离。
再仔细分析图谱，发现整个保留范围约在乙腈的高浓度范围内(约70%~75%), 但实际上由于系统的梯度滞后及柱死体积的因素，实际浓度约在60%~65%之间，为使保留因子在1~20范围内，先选择60%乙腈进行等度洗脱，其他条件不变。
色谱图如图5所示：液相色谱方法开发（实例讲解）2010© 未经许可，不得复制。
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图5. 60%乙腈在60%乙腈洗脱条件下，所有峰的保留值范围在2.43~3.86之间，符合保留因子在1~20的条件，但峰1与2完全重叠，4与5也未完全分离。
分离结果不理想，分离条件需要优化。
在前面公式(7)中，提到分离度与柱效（塔板数），选择性（分离因子）和保留值有重要关系，其中柱效跟柱子本身有关，选择性与保留值则与溶剂强度，种类和柱类型有关，但通常在方法开发过程中，不建议频繁更换色谱柱，而是选定一根色谱柱后，依次通过改变溶剂强度，溶剂类型，柱温和流速来获得适当的分离度。
按照溶剂强度改变10%，则保留值改变2~3倍的规则（简称3倍原则，当然这只是一个粗略的经验值，不完全符合所有情况，但在方法开发中能起到不小的作用），接下来运行了50%和40%的乙腈浓度分离条件，色谱图如图6和7所示：液相色谱方法开发（实例讲解）2010© 未经许可，不得复制。
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图6. 50%乙腈在50%乙腈条件下，所有峰的保留值则变化为4.82~8.15，仍满足1<k<20的要求（但与三倍原则稍有出入，变化倍数位1.98~3.35），同时可观察到峰1与2基本达到基线分离，但4与5则重叠更加严重，仍无法满足分离要求。
图7. 40%乙腈在40%乙腈的条件下，所有峰的保留值变化为10.18~19.04，满足1<k<20的要求，同时也大致符合三倍原则（实际变化倍数为2.11~2.33），同时可发现峰1与2的间距更大，但4与5则完全重合，仍无法满足分离要求。
可能会有读者说：可以降液相色谱方法开发（实例讲解）2010© 未经许可，不得复制。
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低乙腈浓度使4与5分离，但此时降低乙腈浓度会使保留时间延长，不利于日常分离，而且随着保留时间增大，峰宽也会随之变大，仍不会获得满意的分离度。
而且通过上述三个等度试验后，基本上可以确定峰4与5无法在乙腈/水体系下达到基线分离。
另外，根据Snyder 提出的理论：在二元流动相（如甲醇/水，乙腈/水）等度洗脱时，化合物的保留值的对数值与流动相中有机相的浓度成线性关系（仅为经验规则），用数学公式表示既如下：ϕS k k w −=ln ln （8）式中k 为化合物在特定条件下的保留值， k w 为化合物在流动相为水的条件下的保留值（外推理论值），S 为化合物分子特性常数， φ为有机相在流动相中的含量。
通过上述三个试验后，可做出lnk 对φ的线性曲线，如下图所示：图8. lnk-φ曲线（乙腈-水体系）由曲线上可以看出峰4与5几乎近于重合，故此可以推断峰4与5在乙腈/水系统中为难分离峰对。
接下来，可以考虑用溶剂种类来改变分离效果。
液相色谱方法开发（实例讲解）2010© 未经许可，不得复制。
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图9. 溶剂强度换算表图10. 溶剂选择三角形在反相色谱法中，常用溶剂为甲醇、乙腈和四氢呋喃，这三种溶剂基于偶极矩作用力、氢键和供（吸）电子的作用提供不同的选择性，在相同溶剂强度下，可对色谱分离起到不同的分离效果，如图9和10所示。
但四氢呋喃的紫外吸收强、易形成过氧化物、平衡较慢，且不与PEEK 管兼容，所以大多不轻易使用。
在上述考虑下，选用甲醇作为有机相来试图改善分离效果。
通过图9中，可以看出70%甲醇与60%乙腈强度相当，故选择70%甲醇进行试验，结果如图11所示：液相色谱方法开发（实例讲解）2010© 未经许可，不得复制。
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图11. 70%甲醇可以发现，甲醇改变了出峰顺序，峰1比峰2后流出，峰3与4完全重叠，峰5与4达到基线分离。
所有峰的保留因子位于2.49~4.36（同60%乙腈相当）。
然后试想是否可以通过甲醇浓度来改变峰3与4的分离效果，接下来，又运行60%甲醇的洗脱试验，结果如图12图12. 60%甲醇液相色谱方法开发（实例讲解）2010© 未经许可，不得复制。
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可以观察到在60%甲醇条件下，峰1与2重叠，峰3与4分离度有所增加。
所有峰的保留值在 5.24~10.16范围内（大致相当50%乙腈），且大致符合三倍原则。
再根据公式（8）绘制lnk-φ线性图，如图13所示：图13. 甲醇-水体系中lnk-φ曲线从图13中可以看出峰3与4的曲线几近重合，所以在甲醇-水体系中峰3与4为难分离峰对。
接下来，又试验了四氢呋喃-水的分离效果，通过查阅图9，选择45%和35%四氢呋喃进行分离，结果如图14和15液相色谱方法开发（实例讲解）2010© 未经许可，不得复制。