高效液相色谱法的应用
高效液相色谱在药物分析中的应用
高效液相色谱在药物分析中的应用高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是分析化学中一种非常重要的手段。
在药物分析中，HPLC广泛应用于药物含量测定、杂质分析、药代动力学、药物失效机理分析、药物交互作用等方面。
因为其高灵敏度、高分离度、高准确性、高重现性等优点，被誉为现代化学分析的“铁路”。
HPLC分析原理简介HPLC的分离原理是根据样品分子在固定相和流动相之间的互相作用力不同，利用固定相呈现出的分子选择性吸附作用来实现分离。
在HPLC分析过程中，固定配合物和悬浮在流动相中溶质之间通过相互作用，使流动相中的溶质与固定相结合并阻止经过的过程成分的运动而实现分离。
高效液相色谱在药物分析中的应用1.药物含量及其杂质检测药物含量及其杂质是药物分析的重要内容。
通过HPLC可以对药物及其杂质进行可靠、灵敏、准确的检测。
例如，HPLC可以用于测定药物的纯度、杂质、活性成分、含量等。
例如，按照中国药典2015年版的规定，通过HPLC分析测定头孢曲松钠药品中的含量，结果表明该药品中含有98.4%的头孢曲松钠。
2.药物代谢动力学分析药代动力学研究是药物研发过程中必要的环节，可以分析药物在体内代谢和排泄的情况。
药物代谢动力学研究是药物治疗效果和合理用药的依据。
因此，HPLC 非常适合进行药物代谢动力学研究。
例如，使用HPLC测定维生素B2代谢动力学的过程中，首先通过内标法选取L-色氨酸等内标物，然后用HPLC分离并测定维生素B2及其代谢产物蒽醌，结果表明HPLC是非常适合于测定维生素B2代谢动力学的方法。
3.药物失效机理分析药物的失效机理是因为药物有可能产生不希望的肝毒性或其他副作用，使得药物失效。
HPLC分析可以用于药物失效机理的分析。
例如，HPLC可以用于分析站立喹啉失效的原因，结果表明站立喹啉受热环境下会分解，并产生过氧化物，导致药物失效。
4.药物交互作用分析药物与药物之间的相互作用可能会使药物的疗效大为降低或增强。
高效液相色谱法原理及其应用
※梯度洗脱的优点： 1.缩短分析周期； 2.提高分离能力； 3.峰型得到改善，减少拖尾； 4.增加灵敏度。但有时引起基
线漂移。
※（三）进样装置
一、手动注射进样器 二、六通阀进样装置 三、自动进样器
进样阀的基本要求： 1. 耐高压 2. 进样量准确 3. 进样重复性好 4. 无流量和压力波动影响
2．恒压泵：恒压泵又称气动放 大泵，是输出恒定压力的泵。
注意
避免使用对不锈钢有腐蚀性的溶剂。 例：硝酸、硫酸、盐酸、卤化物， 四氯化碳与异丙醇或四氢呋喃的混 合物等。
流动相 过滤——用滤
使用前 膜过滤或垂熔
漏斗过滤
脱气——采
用超声或过滤 的方法
冲洗
使用含酸、碱、缓冲液的流动相后， 必须用不含盐的有机溶剂-水冲洗！
第二节 高效液相色谱仪
1．贮液瓶（滤芯，可滤 去颗粒状物质）
2．高压泵（输液泵、梯 洗脱度）
3．进样装置 4．色谱柱——分离 5．检测器——分析 6．废液出口或组分收集器 7．记录装置
※（一）输液系统
一、储液装置：过滤器 二、脱气装置：脱气机 流动相脱气： （1）吹氦脱气法 （2）加热回流法 （3）抽真空脱气法
※（二）高压输液泵及梯度洗脱装置 一、高压输液泵的种类 高压输液泵可以分为以下两类： 1．恒流泵：可输出恒定体积流量的
流动相。 （1）注射式泵（又称螺杆注射泵）
（2）往复型泵 （又称往复柱塞泵）
二、高压输液泵的原理 往复柱塞泵，柱塞向前运动，液 体输出，流向色谱柱；向后运动， 将贮液瓶中液体吸入缸体。如此 往复运动，保证将流动相以稳定 的速度流过色谱柱的部件。
吸附色谱 分配色谱 离子色谱 空间排阻 亲和色谱 色谱
固定相
全多孔固 固定液载 体吸附剂 带在固相
高效液相色谱仪的原理及应用
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二、液相色谱中常用术语和参数
只针对HPLC特有的，其余术语与第三章同 。 粒间体积（V0）：色谱柱填充剂颗粒间隙中 流动相所占有的体积。
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四、正相高效液相色谱
是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动 相所组成的HPLC体系。其代表性的固定相是 改性硅胶、氰基柱等，代表性的流动相是正 己烷。吸附色谱也属正相HPLC。 溶剂洗脱强度近似地随溶剂的介电常数增加 而增大，洗脱能力越弱，溶质在柱上保留时 间越长。
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主要部件之一，压力：150～350×105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液 体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高 速是高效液相色谱的特点之一。μL/min~几千mL/min 应具有压力平稳、流量稳定可调、耐腐蚀等特性
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(4) 梯度淋洗装置
高效液相色谱仪的原理 及应用
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第一节 高效液相色谱法原理
一、高效液相色谱法的定义和分类
流动相是液体的色谱称为液相色谱（ LC）。 在液相色谱中，采用颗粒十分细的高效 固定相，并采用高压泵输送流动相，全 部工作通过仪器完成，这种色谱称为高
效液相色谱（HPLC） 。
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一、高效液相色谱法的定义和分类
孔体积（Vp） ：色谱柱中多孔填充剂的所
有孔洞中流动相所占有的体积。
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高效液相色谱方法及应用
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专属型检测器
它对不同组成的物质响应差别极大，因此只能选 择性的检测某些物质，如紫外检测器、荧光检测 器和电导检测器。
通用型检测器
它对大多数物质的响应相差不大几乎适用于所有 物质，如示差折光化学检测器 。但它的灵敏度低， 受温度影响波动大、使用时有一定局限性。
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紫外吸收检测器
简称紫外检测器（ ultraviolet absorption detector ， UV），是基于溶质分子吸收紫外光的原理设计的检测 器。 因为大部分常见有机物质和部分无机物质都具有紫外吸 收性质，所以该检测器是液相色谱中应用最广泛的检测 器，几乎所有液相色谱仪都配置了这种检测器。 它不仅有较好的选择性和较高的灵敏度，而且对环境温 度、流动相组成变化和流速波动不太敏感，因此既可用 于等度洗脱，也可用于梯度洗脱。
1、适用于分离几乎所有类型的化合物。一方面通过控制化学键合反应， 可以把不同的有机基团键合到硅胶表面上，从而大大提高了分离的选 择性；另一方面可以通过改变流动相的组成合乎种类来有效地分离非 极性、极性和离子型化合物。 2、由于键合到载体上的基团不易被剪切而流失，这不仅解决了由于固定 液流失所带来的困扰，还特别适合于梯度洗脱，为复杂体系的分离创 造了条件。 3、键合固定相对不太强的酸及各种极性的溶剂都有很好的化学稳定性和 热稳定性。 4、固定相柱效高，使用寿命长，分析重现性好。
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HPLC与GC差别
相同：兼具分离和分析功能 均可以在线检测 不同：
1．分析对象的区别 2．流动相的区别 3．操作条件区别
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HPLC与GC差别
1．分析对象的区别 GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；但 对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样 品，尤其对大多数生化样品不可检测，占有机物的20% HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶 液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、 难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均 可检测，用途广泛，占有机物的80%
高效液相色谱法的应用
在药品分析鉴定的作用
3 在西药鉴别中的应用 在HPLC法中,保留时间与组分的结构和性质有关,是定性的参数,可用于药物的鉴别.如中 国药典收载的药物头孢羟氨苄的鉴别项下规定:在含量测定项下记录的色谱图中,供试品 主峰的保留时间应与对照品主峰的保留时间一致.头抱拉定,头孢噻酚钠等头孢类药物以 及地西泮注射液,曲安奈德注射液等多种药物均采用HPLC法进行鉴别. 4.在体内药物分析中的应用 HPLC由于测定迅速准确，流动相选择范围广，灵敏度高(10-12 g／mL以上)，填充柱种 类多，且可供选择的检测器也多。所以是实验室研究中一种很好的体内分析方法。在 国内外都很受重视．大多数药物都有紫外吸收，所以最常用的检测器是紫外检测器。 多数药物及内源性物质极性均较大，利用其极性差，可以采用RP-HPLC色谱柱，可获 得良好分离效果。
在药品分析鉴定的作用
1.天然药物分析 天然药物的来源有动物、植物和矿物之分，其中以植物类为主。由于天然药物的化学成 分复杂，其有效成分，可能有一个，也可以有多个，这对于控制药品质量，建立质量标 准来说比较困难，HPLC可通过对天然药物的有效成分进行式，可以判定药材的质量高低。 2..天然药物及复方成药分析 复方制剂、杂质或辅料干扰因素多的品种多采用高效液相色谱法。增免扶正片系由当 归、党参、黄芪（图3）等十几味天然药物精制而成，具有益气生津、活血养血、滋 补肝肾、健脾开胃之功效，主要用于抗缺氧、抗疲劳、抗衰老，长期服用可扶正祛邪 ，提高机体免疫功能，健身强体，益寿延年。该药对心、肝、脾、肾虚、纳差、心脑 血管疾病、神经衰弱、慢性肝炎、脂肪肝等都有较好的防治作用。 由于化学药品的开发费用昂贵，而且毒副作用大，近年来人们已把目光转向自然、民 族传统医药、草药、植物药等天然药物，据世界卫生组织统计，当前全世界60多亿人 口中80％的人使用过天然医药。在全世界药品市场中，天然物质制成的药品已占30％ ，国际上植物药市场份额已达300亿美元，且每年以20％ 以上的速度增长。HPLC分析 必定能为我国传统中医药实现现代化，走向世界提供强有力的技术支持。
高效液相色谱方法及应用
高压输液泵及梯度洗脱装置
一、高压输液泵 高压输液泵可以分为以下两类： 1．恒流泵：可输出恒定体积流量的流
动相。 （1）注射式泵（又称注射式螺杆泵） （2）往复型泵 2．恒压泵：恒压泵又称气动放大泵，
一类是选择性检测器，如紫外一可 见分光光度检测器；
另一类是通用型检测器，如示差折 光检测器。
(1)紫外一可见分光光度检测器。
如今此技术已在分析咖啡中的黄嘌泠、调料中的核苷酸及核苷、果汁中的有机酸、米中的维生素、牛奶中的维生素D等都对食品营养价 值提供有效数据。 热不稳定物、离子型化合物及高聚物的分离及测量有困难，致使其应用受到了很大的限制。 又如止痛药或退烧药也可用此法分离并测得各组分的含量。 染料厂排出废水中的苯胺等。 用液相色谱分析简便迅速。 分析食品中的有毒成分，如苹果中农药萘乙酸、稻米中的黄曲霉素、鱼体中的有机汞等。是输出恒定压来自的泵。二、梯度洗脱装置
1．梯度洗脱（gradient elution）又称 停流进样是在高压泵停止供液、体系压力下降的情况下，将样品直接加到柱头。
一、与经典液相色谱法比较
为梯度淋洗或程序洗脱。在同一个分析 用离子交换柱和缓冲游泳梯度淋洗。
多种不同性能的配位体键联在固相基体上 分析食品中的有毒成分，如苹果中农药萘乙酸、稻米中的黄曲霉素、鱼体中的有机汞等。
高效液相色谱法的特点
一、与经典液相色谱法比较 经典液相（柱）色谱法使用粗粒多孔固定相，装
填在大口径、长玻璃柱管内，流动相仅靠重力流经 色谱柱，溶质在固定相的传质、扩散速度缓慢，柱 入口压力低，仅有低柱效，分析时间冗长。
高效液相色谱法使用了全多孔微粒固定相，装填 在小口径、短不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵 进入高柱压的色谱柱，溶质在固定相的传质，扩散 速度大大加快，从而在短的分析时间内获得高柱效 和高分离能力。
高效液相色谱法在药物分析中的应用
高效液相色谱法在药物分析中的应用高效液相色谱法作为一种分离、纯化、分析化合物的非常有效的工具，广泛应用于药物分析领域。
在药物开发过程中，试验和分析是必不可少的环节。
高效液相色谱法是现代药物分析领域中最常用的分析方法之一。
本文将介绍高效液相色谱法在药物分析中的应用。
一、简介高效液相色谱法是一种通过将样品与流动相混合以分离分析样品的技术。
在该方法中，样品是以液体形式注入到含有一定浓度的溶剂混合物（流动相）的色谱柱中。
高效液相色谱发展至今已经非常成熟，其技术已经广泛应用于药物分析、环境检测、化学品分析、生物学等领域。
相较于传统的色谱技术，高效液相色谱法具有分离效果好、分离速度快、灵敏度高、装置操作方便等优点。
二、高效液相色谱在药物分析中的应用高效液相色谱法在药物分析领域的应用非常广泛，包括药物结构鉴定，药物纯度分析，药物代谢产物分析等。
1. 药物结构鉴定高效液相色谱法可以用于药物分子的结构鉴定。
该方法可以通过准确地测量药物相关化合物的分子质量、极性、分子结构等参数来鉴定药物分子的结构。
通过对不同药物分子的分离和分析，研究人员可以更好地了解药物分子的化学特征，为药物的研发提供有价值的信息。
2. 药物纯度分析药物的纯度对于药物的疗效、药物的耐受性等有重要影响。
高效液相色谱法可以通过分离、检测药物中的杂质物质，准确地测量药物的纯度。
该方法可以对药物站仪硅树脂进行验证，从而保证药物的质量符合标准、安全的规定。
3. 药物代谢产物分析药物代谢产物是药物分子在体内代谢过程中形成的化合物。
该过程一般由体内酶所调节，可以为药物的生物利用提供关键信息。
通过高效液相法有助于了解药物的代谢产物，从而帮助科研人员评估药物在体内转化代谢的能力，分析药物的代谢途径，为药物研发提供更加细致的信息。
4. 药物残留分析药物残留分析是指通过系统地分析和检测药物在环境、食品、农产品、水等中存在的残留量，以评估药物是否安全使用的一种分析方法。
仪器分析-高效液相色谱法
流动相的选择与制备
选择合适的流动相
根据被分析化合物的性质， 选择适当的流动相，如有 机溶剂、缓冲液等。
流动相的配制
按照实验要求，准确称量 流动相组分，混合均匀， 并进行过滤和脱气处理。
流动相的梯度洗脱
对于多组分分离，可以采 用梯度洗脱技术，以提高 分离效果。
仪器的开机与平衡
开机
按照仪器说明书，打开仪器电源， 启动仪器操作系统。
药物制剂质量控制
高效液相色谱法可以用于药物制剂的质量控制， 检测制剂中药物的含量、纯度和稳定性等指标。
环境样品分析中的应用
污染物检测
高效液相色谱法可以用 于检测环境中的有机污 染物，如农药、多环芳 烃等，为环境污染控制 和治理提供依据。
饮用水质量检测
通过高效液相色谱法可 以检测饮用水中的有害 物质，如消毒副产物、 微量有机物等，保障公 众的饮用水安全。
粒径
色谱柱的粒径影响分离效 果和分离时间。粒径越小， 分离效果越好，但分离时 间越长。
长度
色谱柱的长度影响分离效 果和载样量。长度越长， 分离效果越好，但载样量 越小。
检测器
类型
常用的检测器有紫外-可见光检测器、荧 光检测器、电导检测器等，根据被测物质 的性质和检测需求选择合适的检测器。
响应速度
线性范围
质。
测定水体、土壤、空气 中的污染物和有害物质。
用于蛋白质、核酸、细 胞等生物大分子的分离
和检测。
高效液相色谱法的优势与局限性
优势
高分离效能、高灵敏度、高选择 性、应用范围广。
局限性
需要专业操作人员、仪器昂贵、 样品前处理复杂、耗时长。
02 高效液相色谱法的仪器构成
CHAPTER
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高效液相色谱法在药物分析中的应用与进展
摘要：主要介绍了高效液相色谱法在药物鉴别、药物杂质检查、药物含量测定等方面具体应用以及展望了高效液相色谱法在药物分析中的应用前景。
关键词：高效液相色谱法；HPLC；药物分析；联用技术
Abstract:Mainly introduced the high performance liquid chromatography in drug discrimination, drug impurity test, determination of the content and concrete application and the prospect of the high performance liquid chromatography in pharmaceutical analysis application prospect.
Keywords:high performance liquid chromatography，HPLC,pharmaceutical analysis，hyphenated techniques
引言：
高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。
高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。
该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。
HPLC在国内和国外的药物分析领域的应用范围很广，发展速度也很快，尤其在我国，近十几年来HPLC方法越来越受到重视。
HPLC 在药物的分析中的应用主要是鉴别、有关物质的检查、有效成分及含量的测定[1]；本文对高效液相色谱法（HPLC）技术在药物分析中的应用进行概述并展望其应用前景。
1 在药物分析中的应用
1.1 在药物鉴别中的应用
在HPLC 法中，药物组分的保留时间与其结构和性质有着直接的关系，不同
的药物由于结构和性质的差异在色谱图上的出峰顺序不同，是定性的重要参数，可用于药物的鉴别。
如在中国药典收载的药物利福平的鉴别项下规定：在含量测定项下记录的色谱图中，供试品溶液主峰的保留时间应与对照品溶液主峰的保留时间一致。
如中国药典收载的利福平的鉴别项下规定：在含量测定项下记录的色谱图中，供试品主峰的保留时间应与对照品主峰的保留时间一致[2]。
1.2 在杂质检查中的应用
高效液相色谱法（HPLC）分离效能高，灵敏，在药物的杂质检查中应用广泛。
主要用于药物中有关物质的检查。
“有关物质”是指药物中存在的合成原料、中间体、副产物、降解产物等物质，这些物质的结构和性质与药物相似，含量很低，只有采用色谱的方法才能将其分离并检测。
若杂质是已知的，又有杂质的对照品，可用杂质对照品做对照进行检查。
若杂质是未知的，可以采用主成分自身对照法或峰面积归一化法进行检查。
例如倪冲、廖玉山等利用高效液相色谱法（HPLC）测定曲尼司特滴眼液中曲尼司特及其有关物质的含量[3]。
李旭仁、李霞等采用高效液相色谱法（HPLC）测定甲磺酸培氟沙星片含量及有关物质[4]。
刘向红、冷晓燕等采用高效液相色谱法（HPLC）测定苄达赖氨酸滴眼液的有关物质。
金鸽、李雪等采用高效液相色谱法（HPLC）测定苄达赖氨酸滴眼液的含量和有关物质[5]。
1.3 在含量测定中的应用
用高效液相色谱法测定含量可以消除药物中的杂质，制剂中的附加剂及共存的药物对测定的干扰。
中药材及其制剂组成复杂，基中不少有效成分的含量测定也越来越多地采用了高效液相色谱法。
赵龙、王增寿利用高效液相色谱法（HPLC）测定贝特令中维生素A的含量 [6].赵蕾钟淮滨利用高效液相色谱法（HPLC）测定安降片中葛根素的含量。
此外，高效液相色谱法（HPLC）在农药检测、中药材指纹图谱[14]以及药物代谢动力学等方面的研究也发挥着重要的作用。
[7]
2 应用前景——HPLC 及其联用技术在药物分析中的应用
近年来, HPLC 仪的组成部件: 输液泵、色谱柱、检测器都有新的发展, 尤其是检测器方面的发展,如二极管阵列检测器已普遍应用, 蒸发光散射检测器对无近紫外吸收的药物, 提供了一种有效的高灵敏度的方法。
随着各个部件的改进,
也出现了多种联用技术。
譬如, 有人曾用HPLC2示差折光检测法(RID) 分析了麦芽糖等7 种糖类及软饮料中果糖、葡萄糖、柠檬酸等成分[8]。
而RID 灵敏度较低, 受温度影响较大。
GAMES 等[ 9]曾用HPLC2热喷雾(TS)2质谱(MS) , 同时分离和测定了前列腺素D2 , beclomethasone diproinate , ranitididine2N2oxide 三个药物的相对分子质量。
小角度激光散射检测器(LALLSPD) 是近代HPLC 领域中出现的一种新型检测技术。
HPLC2LALLSPD 可以快速检测多糖、蛋白质类高聚物的相对分子质量及相对分子质量分布参数, 可不需要标准品或外标要求[10]。
在药物杂质检测中, HPLC2MS 测定和HPLC2核磁共振(NMR) 测定都是简便、快速的方法,但HPLC2NMR 联用技术中NMR 测定不受HPLC 分离过程中使用的缓冲盐溶液的限制, 并可以提供大量的结构信息。
杨春等[10]用HPLC2NMR 联用技术中的连续流动和停止流动两种模式对萘哌地尔中杂质进行检测, 根据HNRM, H2HCOSY谱完成了主要杂质12萘环2丙三醇结构鉴定。
HPLC2NMR 是解决合成药物中杂质结构确证的简便、快速方法。
杨凤仙等[11]应用HPLC2电喷雾(ESI)2MS法, 分析了水和土壤中有机磷酸化合物异丙基磷酸和异丙基磷酸丙酯。
采用了选择离子监测(SIR)技术, 排除了基质干扰, 回收率分别为100 %和90 %, 灵敏度1 ng·μL - 1 。
HPLC2MS 联用在体内药物代谢研究、临床药物检测和生物大分子测定有着广泛的用途。
微柱液相色谱的研究也十分活跃, 由于分析所需的样品量及流动相的消耗大大下降, 检测的灵敏度又大大提高, 使HPLC 分析更加灵敏准确、简便快速。
特别是联用技术的发展, 使之在药物分析生命科学领域的应用更具重要意义。
小结
综上所述, HPLC 具有专属性强、灵敏度高等特点, 既可用于分离也可用于定量分析, 适用于各种各样的有机化合物。
因此在药物成分的分离与测定方面能够充分发挥其它分析方法无与伦比的优势。
而且随着计算机软件的开发、专家系统的应用、检测手段的进步、各种联用技术的出现以及其他一些相关问题的解决, HPLC 在医药研究中将会发挥越来越重要的作用。
参考文献
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