QPCR原理
实时定量pcr原理
实时定量pcr原理实时定量PCR原理。
实时定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是一种用于定量检测DNA或RNA的技术，它结合了PCR技术和荧光探针技术，能够在PCR过程中实时监测靶标的扩增情况，从而实现对靶标的定量分析。
本文将介绍实时定量PCR的原理及其在科研和临床中的应用。
实时定量PCR的原理。
实时定量PCR是在传统PCR技术的基础上发展而来的，其核心原理是通过不断测量PCR反应体系中的荧光信号强度来实时监测靶标的扩增情况。
在实时定量PCR中，通常使用荧光探针（如TaqMan探针、SYBR Green等）来标记靶标的扩增产物。
当PCR反应进行时，靶标的扩增产物会不断积累，荧光信号强度也会随之增加。
通过测量荧光信号强度的变化，可以确定靶标的起始量，并进行定量分析。
在实时定量PCR中，荧光信号强度的测量通常是通过实时荧光定量PCR仪来实现的。
这些仪器能够在PCR反应进行的同时，实时监测PCR管中的荧光信号强度，并将其转化为荧光信号曲线。
通过分析荧光信号曲线的特征，可以确定靶标的起始量，并计算出靶标在样本中的相对或绝对含量。
实时定量PCR的应用。
实时定量PCR在科研和临床中有着广泛的应用。
在基础科研领域，实时定量PCR常常用于基因表达分析、病原微生物检测、基因型鉴定等方面。
通过实时定量PCR技术，研究人员可以快速、准确地获取靶标在样本中的含量信息，从而揭示基因表达调控、病原微生物的感染情况、基因型的分布规律等重要信息。
在临床诊断领域，实时定量PCR也被广泛应用于疾病诊断、药物疗效监测、遗传病筛查等方面。
实时定量PCR技术具有高灵敏度、高特异性和高准确性的特点，能够快速、准确地检测靶标在临床样本中的含量，为临床诊断和治疗提供重要依据。
总结。
实时定量PCR作为一种高效、准确的分子生物学技术，已经成为科研和临床领域中不可或缺的工具。
通过实时监测PCR反应体系中的荧光信号强度，实时定量PCR能够实现对靶标的快速、准确的定量分析，为科研和临床诊断提供了强大的技术支持。
荧光定量PCR服务
荧光定量PCR服务荧光定量PCR（qPCR）是一种基于荧光信号进行定量分析的PCR技术，被广泛应用于遗传学研究、药物研发、病原微生物检测等领域。
qPCR能够快速、准确、灵敏地检测和定量特定的DNA序列，使其成为分子生物学实验室中不可或缺的工具之一、以下是关于荧光定量PCR服务的详细介绍。
一、技术原理qPCR是PCR技术的一种改进和扩展，它通过引入特定的荧光染料来监测反应过程中生成的PCR产物。
在PCR扩增过程中，荧光探针与特定的靶序列以及引物结合，生成荧光信号。
通过检测荧光信号的强度，可以判断靶序列的起始模板数量。
与传统的PCR相比，qPCR能够提供更加准确和精确的定量结果。
二、服务内容1.标准曲线法定量这是最常用的qPCR定量方法之一，通过构建标准曲线来确定靶序列的起始模板数量。
我们提供标准曲线法定量服务，客户只需提供样品DNA或RNA，并告知需要定量的靶序列。
我们将根据靶序列设计引物和荧光探针，构建标准曲线，进行PCR扩增和荧光信号检测。
最终，我们将利用标准曲线来计算样品中靶序列的起始模板数量。
2.绝对定量绝对定量是通过与已知模板数量的标准品进行比较，来准确计算样本中靶序列的起始模板数量。
我们提供绝对定量服务，客户只需提供需要定量的靶序列样本和已知浓度的标准品。
我们将使用标准品和样本一同进行PCR扩增和荧光信号检测，并根据已知模板数量和荧光信号强度计算样本中靶序列的起始模板数量。
3.相对定量相对定量是通过与内参基因进行比较，来获得样本中靶序列的相对表达水平。
我们提供相对定量服务，客户只需提供需要定量的靶序列样本和内参基因样本。
我们将同步进行靶序列和内参基因的PCR扩增和荧光信号检测，并根据两者之间的荧光信号强度比值计算靶序列的相对表达水平。
三、优势和保障1.高精度和准确度：我们的荧光定量PCR设备和试剂具有高灵敏度和特异性，能够提供高质量的数据结果。
2.严格的实验设计和操作：我们的技术团队拥有丰富的经验和专业知识，在实验设计和操作过程中严格按照相关标准和流程进行，确保结果的准确性和可靠性。
荧光定量pcr实验原理与应用
荧光定量pcr实验原理与应用荧光定量PCR（qPCR）是一种高灵敏度、高特异性的DNA扩增技术，通过检测PCR反应体系中的荧光信号实时监测DNA的合成量。
这种技术结合了传统PCR的高效性和荧光探针的高度特异性，广泛应用于基因表达分析、病原体检测、基因定量、基因型鉴定等领域。
一、原理荧光定量PCR利用荧光信号与PCR产物数量呈正比的原理，通过实时监测PCR反应过程中荧光信号的强度变化来确定反应体系中模板DNA的初始量。
在PCR反应中，荧光探针与特定的DNA序列结合，并发出荧光信号。
随着PCR反应的进行，产物数量逐渐增加，荧光信号也随之增加。
通过检测荧光信号的增长曲线，可以确定初始模板DNA的数量。
二、应用1.基因表达分析：荧光定量PCR可用于实时监测基因的表达水平，通过检测靶基因的mRNA量来研究基因在不同条件下的表达情况。
2.病原体检测：荧光定量PCR可用于快速准确地检测病原体的存在，如病毒、细菌等，对临床诊断和疾病监测具有重要意义。
3.基因定量：荧光定量PCR可用于定量分析基因拷贝数、基因表达水平等，对基因功能研究和疾病诊断有重要作用。
4.基因型鉴定：荧光定量PCR可用于检测基因型多态性，如单核苷酸多态性（SNP）、插入缺失等，用于遗传学研究和个体鉴定。
三、优势与传统PCR技术相比，荧光定量PCR具有以下优势：1.高灵敏度：荧光信号与PCR产物数量呈正比，可实现低拷贝数DNA的检测。
2.高特异性：荧光探针设计精准，可准确识别靶基因序列，避免非特异性扩增。
3.实时监测：可实时监测PCR反应过程中的荧光信号，得到实时、准确的反应动态信息。
4.高准确性：荧光定量PCR结果稳定可靠，可用于定量分析和比较研究。
荧光定量PCR作为一种高效、高灵敏的DNA定量技术，在生命科学研究、临床诊断、食品安全监测等领域具有广泛应用前景。
随着技术的不断发展和完善，荧光定量PCR将在更多领域发挥重要作用，为科学研究和临床实践提供强有力的支持。
实时荧光定量pcr的原理
实时荧光定量pcr的原理实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）是一种用于检测DNA或RNA的数量的分子生物学技术。
它通过利用荧光探针实时监测PCR反应过程中的DNA合成情况，从而可以快速、准确地定量目标序列的数量。
实时荧光定量PCR的原理基于PCR技术和荧光探针技术的结合，具有高灵敏度、高特异性和高准确性的特点，因此被广泛应用于基础研究、临床诊断、环境监测等领域。
实时荧光定量PCR的原理主要包括PCR反应、荧光探针和检测系统三个方面。
首先，PCR反应是实时荧光定量PCR的核心步骤。
PCR反应通过不断循环的高温变性、低温退火和中温延伸，使目标DNA序列得以扩增。
在每一个PCR循环中，目标序列的数量呈指数增长，这种指数增长的特点为后续的定量提供了基础。
其次，荧光探针是实时荧光定量PCR的关键。
荧光探针是一种含有荧光染料和荧光淬灭剂的寡核苷酸探针，它与目标序列特异性结合，并在PCR反应中被3'→5'外切酶切割，释放出荧光信号。
荧光信号的强度与目标序列的数量成正比，因此可以通过监测荧光信号的变化来实现对目标序列数量的实时定量。
最后，检测系统是实时荧光定量PCR的重要组成部分。
检测系统包括荧光定量PCR仪和数据分析软件，它能够实时监测PCR反应过程中荧光信号的强度，并将荧光信号转化为目标序列的数量。
通过合理设置PCR反应条件和分析荧光信号的曲线，可以实现对目标序列的快速、准确定量。
总的来说，实时荧光定量PCR的原理是基于PCR技术和荧光探针技术的结合，通过PCR反应、荧光探针和检测系统三个方面的协同作用，实现对目标序列数量的实时定量。
这种原理使实时荧光定量PCR成为一种高效、快速、准确的分子生物学技术，为科研和临床诊断提供了重要的技术支持。
实时荧光定量pcr的原理
实时荧光定量pcr的原理实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）是一种用于测定DNA或RNA在样本中的数量的技术。
它可以实时监测PCR反应过程中的荧光信号，从而实现对目标序列的定量分析。
实时荧光定量PCR在生物医学研究、临床诊断、环境监测等领域具有广泛的应用价值。
实时荧光定量PCR的原理基于PCR技术，但在PCR反应过程中引入了荧光探针，使得PCR过程中的荧光信号与目标序列的数量成正比。
下面将详细介绍实时荧光定量PCR的原理。
首先，实时荧光定量PCR需要使用一种荧光探针，通常有两种类型，双标记探针和DNA间接染料。
双标记探针是一种含有荧光素和荧光淬灭剂的探针，当它与目标序列结合时，荧光素和淬灭剂之间的距离被拉大，从而导致荧光信号的增加。
DNA间接染料则是一种无需特定探针的染料，它可以与PCR产物结合并发出荧光信号。
其次，实时荧光定量PCR需要使用一种特殊的PCR仪器，称为实时荧光定量PCR仪。
这种仪器可以在PCR反应过程中实时监测荧光信号的强度，并将其转化为目标序列的数量。
实时荧光定量PCR仪器通常配备了特定的软件，可以自动分析荧光信号的强度，并计算出目标序列的起始数量。
最后，实时荧光定量PCR的原理是基于荧光信号与目标序列数量成正比的关系。
在PCR反应过程中，荧光信号的强度随着PCR产物的增加而增加，从而可以通过监测荧光信号的动态变化来实现对目标序列的定量分析。
实时荧光定量PCR可以实现高灵敏度、高特异性和高准确性的目标序列定量分析，因此在科学研究和临床诊断中得到了广泛的应用。
总之，实时荧光定量PCR是一种基于PCR技术的定量分析方法，它利用荧光探针和实时监测荧光信号的PCR仪器，可以实现对DNA或RNA目标序列的高灵敏度、高特异性和高准确性的定量分析。
实时荧光定量PCR在基础科学研究、临床诊断和环境监测等领域具有广泛的应用前景。
qpcr数据处理原理
qpcr数据处理原理qPCR数据处理原理引言：实时定量聚合酶链反应（qPCR）是一种广泛应用于生物学研究和临床诊断的技术。
它可以对RNA和DNA进行定量分析，具有高灵敏度、高特异性和高通量的特点。
qPCR数据处理是实现定量分析的关键步骤，本文将介绍qPCR数据处理的原理和方法。
一、qPCR数据采集在进行qPCR实验时，首先需要选取合适的引物和探针，设计合适的扩增方案。
然后，在实验仪器中加入待测样品和试剂，进行PCR反应。
在PCR反应过程中，荧光信号随着扩增产物的累积而增加，实时监测荧光信号可以得到扩增曲线。
二、数据分析1. 扩增曲线分析扩增曲线是qPCR实验中最基本的数据，通常是荧光信号与PCR循环数的关系图。
通过观察扩增曲线的形状可以初步判断扩增反应的质量和特异性。
正常的扩增曲线应该呈指数增长的趋势，并且不出现偏移或异常的情况。
2. CT值计算CT值（Cycle Threshold）是qPCR实验中用来表示扩增反应起始点的参数，通常定义为荧光信号超过背景噪声阈值的循环数。
CT值越小，说明起始模板量越多。
CT值的计算可以使用一些常见的方法，如固定阈值法、移动窗口法、二次导数法等。
3. 标准曲线法标准曲线法是qPCR数据处理中常用的定量方法之一。
该方法通过制备一系列已知浓度的标准品，构建标准曲线。
然后，利用待测样品的CT值与标准曲线进行比较，可以计算出待测样品的相对或绝对浓度。
标准曲线法的优点是简单易行，但需要准备一系列标准品。
4. ΔΔCT法ΔΔCT法是另一种常用的定量方法，它可以在无需标准曲线的情况下进行定量分析。
该方法通过比较待测样品与对照样品的CT值差异，计算相对表达量的变化。
ΔΔCT法的优点是简便快速，适用于大规模样品的高通量分析。
5. 数据归一化在qPCR实验中，为了消除不同样品之间的差异，通常需要进行数据归一化。
归一化可以通过选择合适的内参基因或参考基因进行，使得不同样品之间的CT值差异可以被消除。
qpcr扩增原理
qpcr扩增原理qPCR扩增原理解析1. 什么是qPCR？qPCR全称为定量聚合酶链式反应（quantitative polymerase chain reaction），是一种利用特定的酶和荧光探针来测量DNA或RNA 的数量的技术。
它可以在非常短的时间内测定起始样本中特定序列的拷贝数。
2. PCR扩增的基本原理qPCR是PCR技术的一种变种，因此我们首先来了解一下PCR的基本原理。
1.Denaturation（变性）：将待扩增DNA双链变性，将其分离成两条单链。
这一步通常在94-98°C的高温下进行，以破坏DNA的双氢键。
2.Annealing（退火）：将引物与已变性DNA单链相结合。
引物是已知序列的DNA片段，它们与目标DNA序列的两端互补配对。
退火温度一般选择在50-65°C之间。
3.Extension（延伸）：通过加入DNA聚合酶酶（例如Taq酶），引物在目标DNA上进行扩增。
聚合酶可以按照DNA的模板合成新的DNA链。
延伸温度通常在72°C左右。
重新循环以上三个步骤，每个循环都会使目标DNA的数量翻倍。
PCR扩增可以通过进行多次循环来构建指数级增长。
3. qPCR与PCR的不同之处qPCR相比于传统PCR，可以对扩增产物进行实时定量测定，而传统PCR只能获得是否成功扩增的信息。
qPCR采用荧光探针来监测扩增过程中的产物，而PCR只是通过检测末端标记的引物或染色剂来判断是否有扩增产物。
荧光探针中包含一个探针序列、一个荧光染料和一个辅助染料。
荧光探针能够与扩增产物的特定序列互补，同时荧光染料与辅助染料的相互作用导致荧光信号的释放。
4. qPCR扩增原理使用qPCR测量DNA或RNA数量的过程分为两个主要步骤：第一步：引物和荧光探针设计在qPCR实验之前，需要设计引物和荧光探针。
引物是一对针对目标序列的短DNA片段，其中一对引物分别位于目标序列的两侧。
荧光探针包含一个专门针对目标序列的探针序列和荧光染料。
荧光定量pcr原理和步骤
荧光定量pcr原理和步骤荧光定量PCR（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）是一种常用的分子生物学技术，能够快速、准确地定量检测DNA或RNA的含量。
下面将介绍荧光定量PCR的原理和步骤。
荧光定量PCR的原理主要基于传统PCR技术和荧光探针技术的结合。
传统PCR通过不断复制DNA模板，使其数量呈指数增加，但并不能定量测定模板初始含量。
为了解决这一问题，qPCR引入了特定的荧光标记探针，该探针可与扩增产物特异性结合，通过荧光信号的增加来反映模板的初始数量。
荧光定量PCR的步骤如下：1. DNA模板制备：从待检测样本中提取DNA，并进行纯化处理，确保所得到的DNA质量较高。
2. 反应体系配置：根据实验需要，准备PCR反应液，包括DNA模板、引物（forward primer和reverse primer）、DNA聚合酶、核苷酸和缓冲液等。
3. 反应条件设定：根据引物序列的特性和所需扩增产物的长度，确定PCR反应的温度周期条件，包括退火温度、延伸时间和循环次数等。
4. 荧光探针设计：根据待检测序列的特点，设计合适的荧光探针，通常这些探针包括一个荧光染料和一个猪尾巴。
5. 温度循环程序：将配置好的PCR反应液放入热循环仪中，根据反应条件进行温度循环，使DNA发生退火、延伸和复性，并产生大量的扩增产物。
6. 荧光检测：热循环仪会不断读取PCR反应体系中荧光信号的变化，通过荧光强度来定量检测DNA的含量。
荧光信号的强度与模板DNA的初始含量成正比。
7. 数据分析：通过计算荧光信号和模板DNA的标准曲线，可以得到待检测样本中目标序列的初始含量。
8. 结果解读：根据数据分析的结果，可确定待检测样本中目标DNA的绝对或相对含量。
荧光定量PCR凭借其高度敏感和快速准确的特点，已广泛应用于基因表达分析、病原体检测、遗传病筛查等领域。
随着技术的不断发展，荧光定量PCR将在医学诊断和疾病预测中发挥更加重要的作用。
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当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收， 仪器检测不到信号。随着PCR的进行， Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针， 其5′→3′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团， 其能量不能被吸收，即产生荧光信号
多探针的反应体系
Two or more Probes and Dyes in one Tube
Real-Time QPCR常用染料
TET HEXTAM Alx350 FAM
TxRd Cy5
JOE Cy3 ROX
TaqMan 探针原理
Байду номын сангаас
R
T T T
R
Q
T A G C C T G A C G A G T A C G A C C T T A G C C T G A C G AG A T C G G A C T G C T C A T G C T G G A A T C G G A C T G C T C A T G C T G G A A T C G G A C T G C T C
94°C
Pol
Elongation 72°C
Annealing of primer
Annealing 55°C
PCR后分析结果
3kb
500bp 300bp
PCR products in different sizes
为什么终点法定量不准确?
Endpoints
Ct
同一样品尽管平台期DNA拷贝数波动很大，CT值却是相对固定的。
为什么CT值起始DNA浓度?
Rn = RB + X0 (1+ e)n Rs 当循环次数n=CT值时： RCT = RB + X0 (1+ e)CT Rs
lg (RCT - RB) = lg X0 + CT lg (1+ e) + lg Rs
CT lg (1+ e) = - lg X0 + lg (RCT - RB) – lg Rs
高通量 SNP 筛查
SNP Amplifluor™ Primer (UniPrimer™)
PCR
Quencher
Real Time PCR 技术的诞生
• 1992年，Higuchi R等第一个报导了实时定量PCR技术
Higuchi R, Fockler C, etal. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology, 1993, 11(9): 1026-1030.
∆ Ct
∆ Ct
∆ ∆ Ct
2- ∆ ∆
Ct =
Change in Expression Level
相对定量
D Ct = target - ref D Ct = 9.70
control
RPLP0 con
av =19.93
IL1-b con av =29.63
-2- D D Ct = - 2 [(Ctarget- Ccalibrator)] - [(Ctarget- Ccalibrator)]
Target 1
R1
Q
T A G C C T G A C G AG
Target 2
R2
Q
T A G C C T G A C G AG
微卫星系统
Mastercycler ep-新一代PCR仪的代表
超快的升/降温速度
脉冲 PCR 独立直观的控制面板
ESP 电子样品保护热盖
Mastercycler ep系列-多种模块选择
- dI / dT (%)
40 30 20 10 0 -10 -20 -30 -40 -50 -60 60 62 64 66 68 70 72 74 76 78 80 Temperature [°C] 82 84 86 88 90 92 94
UNG预防污染
UNG酶的作用原理是降解含有dU的双链或单链DNA。 它在50°C激活，95°C灭活.用于预防非特异性PCR扩增和污染。
兼顾速度与可靠性
Eppendorf PCR系统
20 Years of PCR
Kary Mullis
PCR只是一个概念，所发生的 奇迹是：PCR概念变成了可操 作的实验系统，变成了一项成 熟的技术，后者又上升成为新 的概念。 …
它最大的特点就是能不断推出新 形式。
—— 摘自[Making PCR: A Story of Biotechnology by Paul Rabinow]
• 其它类: BD QZyme
SYBR Green I 的检测原理 DNA specific Dyes
e.g. SYBR Green I
Excitation 494 nm
Emission 521 nm
熔解曲线分析引物二聚体
Product of Interest
Primer dimers
100 90 80 70 60 50
CT
log X O log(RT RB ) log RS log(1 E X ) log(1 E X )
即 CT = - k lg X0 + b
（线性方程）
定量PCR的实质
模板定量 找到PCR的指数增长期 定量数据归一化
real-time PCR应用范围
科研的主要工具 •mRNA与基因表达的研究 •DNA拷贝数的检测 •单核苷酸多态性（SNPs）的测定 •DNA 芯片结果认证
Absolute amount 50,000
copies
12,500
copies
6,250 copies
•
•
浓度增加1倍，CT值减小1个单位
浓度增加10倍，CT值减小3.3个单位
相对定量
Housekeeping Gene
Sample
∆ Ct
Gene of Interest
∆ Ct
Non treated sample
Time
TaqMan 探针原理
TaqMan探针法的核心: 利用Taq酶的5→3′外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号
FRET 荧光共振能量转移 Fluorescence Resonance Energy Transfer
Reporter
R
Q
Quencher
T A G C C T G A C G AG
实时定量PCR技术是PCR技术和荧光检测技术的结合 所谓 实时定量PCR技术 是指在PCR反应体系中 加入荧光基因,利用荧光信号累积实时监控整个PCR进 程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方 法.
Fluorescent Dyes 荧光分子或荧光染料
Exitation peak
Emission peak
Before Bisulfite Treatment: Wild-Type DNA 5’...GCGGACCGCG..
After Bisulfite Treatment: Unmethylated DNA 5’...GUGGAUUGUG.. Methylated DNA 5’...GCGGAUCGCG..
医学方面应用前景更是令人鼓舞 •极微量的基因表达定量 •病原体检测
绝对定量
通常用标准品作为外参照制作标准曲线. 注意保持与目的基因的同源性
Unknown
标准曲线的制作
什么是阈值
基线信号的标准偏差 x 10
基线
标 准 偏 差
阈 值
基线阈值CT值
基线
阈 值 CT 值
标准曲线方法
20 -
• •
典型的PCR四阶段
线性图谱
半对数图谱
典型的PCR四阶段
平台期 线性增长期 指数增长期
基线期
PCR理论方程
N = N0 x (1+e)n
N: N0: e： n:
PCR理论方程只在指数期成立
产物分子数 起始分子数 扩增效率 循环次数 平台期
线性期
lg [DNA] 指数期
y = x(1+e)n
循环数
仪器热启动
100
Block temperature [°C]
80
8°C/sec
脉冲 PCR
60
40
= 超快的升温速度 6°C/sec + 极大缩短初始升温所需时间
20
• Innovative technical feature for device-supported HotStart PCR • Perfect combination: Mastercycler ep S and HotMaster • Enhances the PCR to nearly the maximum
CT
19 18 17 -
•
C
••
B
• • •
A
•
16 Absolute amount. (copies) 15 -
I 3,125
I 6,250
I I 12,500 25,000
I I 50,000 100,000 EXACT scale
通过CT值测定起始DNA量
CT Sample A Sample B Sample C 16 18 19
Cycle #
ThresholdThe peak of background fluorescence, as defined by CT 值的定义是 PCR 扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长 the platform or the user. 阶段的拐点所对应的循环次数。
CT , 不同 CT值的模板起始浓度相差 Ct值与起始模板浓度成负相关关系 (Threshold Cycle)-The cycle number where the reaction 2n倍, n为CT间差值 fluorescence exceeds background fluorescence.