四氯化碳复合、梯段用药法制备大鼠门脉高压模型的研究

论著ＣＨＩＮＡＦＯ、ＲＥＩＧＮＭＥＤＩＣＡ。

揣ＴＭＥＮＴ匿固ＬＴＲＥＡ■—誓一：盘●■四氯化碳复合、梯段用药法制备大鼠门脉高压模型的研究徐义军１王超２（Ｉ．湖北省京山县人民医院普外１科湖北荆门４４８０００Ｉ２．华中科技大学伺济医学院附属同济医院胆胰外科湖北武汉４３００３０）【摘要ｌ目的探讨构建一种穗定．可靠的门脉高压大鼠模型的翻备方法，并研究该模型肝脏病理结构以及血流动力学，的改变。

方法雄性ｓＤ大鼠９５只，体重１５０～１７０９。

按鳊号法随机分为模型组和对照组。

模型组：按０．４ｍＬ／１００９剂量予以背部皮下注射５０％ＣＣＩ。

橄榄油溶液，每周２次，持续４周。

第５周开始改为以０．５ｍＬ／１００９标准注射，每周２次。

持续４周。

对照组：仅注射橄榄油，频度及剂量同模型组。

结果对照组ｌｏ只大鼠全部存活。

模型组８５只大置，死亡２４只。

死亡卒２８％。

存活６１只大鼠，肝脏均可观察到纤维组织不同程度地增生，肝小叶结构破坏，假小叶形成，模型成功率１００％。

模型组门静脉压力和门静脉内径比对照组明显增加（，ｌ＜ｏ．０ｓ）；血清ＴＢ，ＡＬＴ及ＡＳＴ较正常对照组均明显升高（Ｐ＜ｏ．０Ｓ）。

而ＡＬＢ到明显降低（Ｐ＜ｏ．０５）。

结论该方法所构建的动物模型其蛆织学改变与人类肝硬变相似，门静脉压力显著增高，是研究门脉高压症的理想模型。

【关键词】肝硬化门脉高压四氯化碳【中图分类号ｌＲ６５７．３Ｉ文献标识码ｌＡ【文章编号ｌ１６７４一０７４２（２０ｌｏ）０２（ｂ）一ｏｏｏｌ—０２ＲｅｓｅａｒｃｈｏｆＰｏｒｔａｌＨｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎＭｏｄｅｌｏｆＲａｔｓＢｕｉｌｔｂｙＳｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓＩｎｊｅｃｔｉｏｎｏｆＣａｒｂｏｎＴｅｔｒａｃｈｌｏｒｉｄｅ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈ＆ｓｔｅａｄｙ．ｃｒｅｄｉｂｌｅｒａｔｍｏｄｅｌｏｆｐｏｒｔａｌｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．Ｓｔｕｄｙｉｔｓｐａｔｈｏｌｏｇｉｅｅｌｃｈａｎｇｅｓｏｆｌｉｖｅｒａｎｄｔｈｅｃｈａｎｇｅｏｆｈｅｍｏｄｙｎａｍｉｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ９５ｍａｌｅＳＤｒａｔｓ，ｗｅｉｇｈｔ１５０～ｌ彳０９，ｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙｄｅｖｉｄｅｄｉｎｔｏｔｗｏｇｒｏｕｐｓ．Ｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｇｒｏｕ“ｎ－－８５Ⅻａｓｉｎｊｃｏｔｅｄ５０％ｃｃｉ４ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓａｔａｄｏｓｅｏｆ０．４ｍＬ／１００９ｏｎｔｈｅｂａｃｋｏｆｒａｔｓｔｗｉｃｅｅｗｅｅｋ，ｗｈｉｃｈｌａｓｔｅｄｆｏｒ４ｗｅｅｋｓ．Ｆｒｏｍｔｈｅｆｉｆｔｈｗｅｅｋ，ｔｈｅｒａｔｓｗｅｒｅｉｎｉｅｅｔｅｄｃｃｌ４ｂｙｄｏｓａｇｅｏｆ０．５ｍＬ／１００９，ｔｗｉｃｅａｗｅｅｋａｎｄｌａｓｔｅｄｆｏｒ４ｗｅｅｋｓ．Ｅｑｕａｌｖｏｌｕｍｅｏｆｏｌｉｖｅｏｉｌｗａｓｇｉｖｅｎｔｏｔｈｅｒａｔｓｉｎｅｏｎｔｒａｌｇｒｏｕｐ．ＲｅｓｕｌｔｓＴｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｒａｔｓａｌｌｓｒｕｖｉｖｅｄ．’ｎ地ｍｏｒｔａｌｉｔｙｏｆｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｇｒｏｕｐＷａＳ２８％。

ｔｈｅｒｅｗｅｒｅ２４ｄｉｅｄａｍｏｎｇｔｈｅ８５ｒａｔｓ．Ｗｅｃｏｕｌｄｓｅｅｆｉｂｒｏｕｓｔｉｓｓｕｅｈｙｐｅｒｐｌｎｓｉａｏｆｌｉｖｅｒ，ｄｉｓｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎｏｆｈｅｐａｔｉｃｌｏｂｌＩｌｅａｎｄｐｓｅｕｄｏｌｏｂｕｌｅ．Ｔｈｅｐｏｒｔａｌｖｅｎｏｕｓｐｒｅ鹤ｕｒｅａｎｄｉｎｔｅｒｎａｌｄｉａｍｅｔｅｒｏｆｐｏｒｔａｌｖｅｉｎｒａｉｓｅｄｏｂｖｉｏｕｓｌｙｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｇｒｏｕｐａｎｄｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（Ｐ＜Ｏ．０５）．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈａｔｉｎｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｌｉｖｅｒｆｕｎｃｔｉｏｎｐｒｏｆｉｌｅｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｉｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｇｒｏｕｐ（Ｐ＜Ｏ．０ｓ）．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＴｈｅｐｒｏｃｅｄｕｒｅｏｆｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇａｎａｎｉｍａｌｍｏｄｅｌｉｓｆａｉｒｌｙｓｔａｂｌｅａｎｄｒｅｌｉａｂｌｅ，ｔｈｅｈｉｓｔｏｌｅ・ｇｉｃａ］ｃｈａｎｇｅｓｓｉｍｉｌａｒｔｏｈｕｍａｎｃｉｒｒｈｏｓｉｓ，ｐｏｒｔａｌｖｅｉｎｐｒｅｓｓｕｒｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ，ｔｈｅｍｏｄｅｌｉｓｕｓｅｆｕｌｆｏｒｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｌｉｖｅｒｅｉｒｒｈｅａｌｓｗｉ恤ｐｏｒｔａｌｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．［ＫｅｙＷｏｒｄｓ］ＬｉｖｅｒｅｉｒｒｈｏｓｉｓｌＰｏｒｔａｌｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎｌＣａｒｈａｎｔｅｔｒａｅｈｌｏｒｉｄｅ大鼠门脉高压实验模型对研究该病的发生、发展、转归以及治疗具有着重要价值。

自１９３６年Ｃａｍｅｒｏｎ和Ｋａｒｕｎａｒａｔｎ－ｅ首次报道应用四氯化碳（ＣＣｌ．）制作肝硬变门脉高压动物模型至今，人们对该法不断探索、改进和完善。

基于此目的，我们对传统的制作方法进行改良，即采用复合法，分段用药，以求建立一种更加成熟，稳定可靠的模型制作方法，为进一步实验打下坚实基础。

１材料与方法１．１材料１．Ｉ．１实验动物与分组普通雄性ＳＤ大鼠（华中科技大学同济医学院实验动物中心提供）１５０９～１７０９／只，共９５只。

按编号法随机分为模型对照组（ｎ－ｌＯ）以及模型组（ｎ＝８５）。

１．１．２主要试剂ＣＣＩ。

（分析纯，浓度为９９．５％），橄榄油，新鲜配置的２．５％磷酸缓冲戊二醛固定液（由华中科技大学同济医学院超微病理教研室提供），苯巴比妥钠，速眠新Ⅱ（军事医学科学院军事兽医研究所）。

１．１．３实验准备将ＣＣｌ。

与橄榄油溶液混合配制成４０％、５０％的溶液，大鼠适应性饲养，食水供应充足。

温度控制在２２＂Ｃ（士）。

１．２方法１．２．１模型制备分为两期：诱导期和成模期…。

（１）诱导期：实验动物在诱导前以每升蒸馏水中含０．３５９苯巴比妥钠的溶液作为大鼠的惟一饮用水，时间为ｌ周。

饲料使用普通大鼠饲料。

（２）成模期：模型组：按０．４ｍＬ／１００９剂量予以背部皮下注射５０％ＣＣｌ。

橄榄油溶液（即５份ＣＣｌ。

＋５份橄榄油溶液，混匀），每周２次，持续４周。

第５周开始改为５０％ＣＣｌ。

微榄油溶液，以０．５ｍＬ／ｌＯＯｇ标，准背部皮下注射，每周２次，持续４周。

对照组：按０．４ｍＬ／１００９体重予以背部皮下注射橄榄油，每周２次，对照组给予普通饮水和饲料，频度及剂量同实验组。

停药２周后即可成模，即制备门脉高压大鼠模型时间共计ｌＯ周。

１．２．２影像学检查抽样部分模型大鼠采用速眠新Ⅱ麻醉后进行影像学（ＭＲ．ＣＴ）检查。

ＣＨＩＮＡＦＯＲＥＩＯＮＭＥＤＩＣＡＬＴＲＥＡＴＭＥＮＴ中外医疗１万方数据匿眶猛名㈣俐唧眦Ｔ一唰Ｔ１．２．３血流动力学指标测定所有动物均在严格的无菌条件下进行手术。

以１．０ｍＬ／ｋｇ体重肌肉注射速眠新Ⅱ麻醉大鼠【２】，麻醉成功后，手术助手将大鼠以仰卧位固定于手术台上，剃除胸腹部毛发，常规消毒铺巾，术者穿手术衣，作剑突下正中切口约３ｃｍ，推开肝叶暴露门静脉主干，使用游标卡尺量取门静脉主干外径（Ｄ），注意手法轻揉，勿牵拉门静脉，以减少误差，结果以ｍｍ表示。

暴露脾脏，将２１Ｇ针头用肝素盐水冲洗后，刺入脾脏髓质，连接压力换能器和生理记录仪，以脊柱前缘为零点，间接测量门静脉压力（ＰＶＰ），结果以ｍｍＨｇ表示。

１．２．４肝脏病理学检查取新鲜肝脏组织以２．５％磷酸缓冲戊二醛固定后送超微病理检查，以福尔马林溶液固定送ＨＥ、Ｍａｓｓｏｎ染色检查。

１．３统计学处理所得实验数据用均数土标准差佤士曲表示。

应用ＳＰＳＳ统计软件包（１２．０版）行Ｏｎｅ～ＷａｙＡＮＯＮＡ组间方差分析，Ｐ＜０．０５表示差异有显著性。

２结果２．１模型检验及存活情况大部分实验动物在诱导过程中活动减少，精神萎靡，食欲不振，每日引水约２５ｍＬ，对外界刺激反应迟钝，动物皮肤无光泽，腹水明显，体重下降；同期正常对照组大鼠饮食、精神和活动状态良好，，模型组大鼠ＣＴ、ＭＲ检查及肉眼观见大鼠体形消瘦，肝脏体积缩小，表面凹凸不平，脾脏略有增大，伴有肝周少量腹水・模型结束后存活６１只大鼠，死亡率（２８％，２４／８５）。

２．２肝脏病理学改变模型对照组ＨＥ染色见肝小叶结构完整，肝素排列整齐，肝细胞形态正常，Ｍａｓｓｏｎ染色见汇管区无纤维组织增生，肝中央静脉周和肝血窦周偶见少量的网状纤维。

模型组大鼠的肝组织发生了一系列病理学改变，可见炎性细胞浸润，纤维组织广泛增生，并破坏了肝小叶正常结构，并将其分割成大小不一，圆形或类圆形的肝细胞团，形成假小叶和小结节性肝硬变，但肝细胞再生不明显ｌ电镜观察见肝细胞肿胀变性、坏死，粗面内质网短，小，肝窦间隙内充满大量胶原纤维，巨嗜细胞活化。

２．３门静脉血流动力学指标变化门脉高压模型组大鼠门静脉压力（ＰＶＰ）、门静脉内径（Ｄ）较对照组明显增加（ｐ＜０．０５），见表Ｉ。

３讨论肝硬化门脉高压动物模型在研究该病的发生，发展、转归以及治疗等方面的重要性是不言而喻的。

ＣＣｌ。

诱发肝硬化门脉高压动表１门静脉血流动力学指标注：＋Ｐ＜０．０５，ＶＳ对照组２中岁ｈ医疗ｃＨＩＮＡＦｏＲＥｌＧＮＭＥＤｌｃＡＬＴＲＥＡＴＭＥＮＴ论著物模型是一个较为经典的方法，染毒方法有经消化道，皮下注射或腹腔内注射等途径卜引。

以使用小动物如大鼠为多，物模型较为稳定、可靠。

为加快成模速度，可配合应用酶诱导剂，如乙醇、苯巴比妥等。

１９８１年Ｃｈａｔａｍｒａ采用５０％ＣＣｌ。

、１０％乙醇为主的多因素综合法来诱导大鼠肝硬化模型，诱导时间约１２周，目前已成为一种标准的诱导方法。

乙醇能增强ＣＣｌ。

毒性作用，且能直接损伤肝细胞线粒体。

但也有作者认为该方法存在一定的缺陷，如动物模型形成周期长（１２周）、形成率低（低于８０％），部分大鼠还出现拒饮乙醇水导致脱水乃至死亡，因各种原因导致的死亡率甚至可超过３０％。

苯巴比妥可使细胞色素Ｐ－４５０活性增强，滑面内质网增生。

细胞色素Ｐ－４５０是肝微粒体最重要的药物代谢酶，故合用苯巴比妥可增加肝细胞对ＣＣＩ。

的敏感性。

在饮用水中加入苯巴比妥钠可促进大鼠产生持久的肝硬化。

复合法动物肝硬化门静脉高压模型是目前最常用方法，可节约时间，提高成模率与降低死亡率。

在此研究中，笔者先对实验大鼠进行苯巴比妥诱导，再对ＣＣｌ。

的用药浓度进行改进调整，即先］啊４０％ＣＣｌ。

诱导４周，使大鼠对诱导药物产生一个耐受过程，再提高ＣＣｌ。

的浓度至５０％，为了提高ＣＣＩ。

的吸收率同时并不增加急性中毒死亡率，以及不对后面的研究造成干扰，故采用皮下注射方法，共选择了８５只ＳＤ大鼠，到第１０周造模成功。

我们通过ＨＥ染色，Ｍａｓｓｏｎ三色染色证明，增生的纤维组织破坏了肝小叶正常结构，并将其分割成大小不一、圆形或类圆形的肝细胞团，形成假小叶和小结节性肝硬变，但肝细胞再生不明显。