重叠延伸C实验.doc
重叠延伸pcr
重叠延伸pcr重叠延伸PCR一、前言重叠延伸PCR（Overlap Extension PCR，又称OE-PCR）是一种基于PCR技术的DNA重组技术，它可以实现在DNA两端同时进行定向变异、插入、删除等操作。
重叠延伸PCR广泛应用于基因工程、遗传学、生物学等领域，成为分子生物学研究中的一项重要技术手段。
二、适用场景2.1 定向变异定向变异是指在已知序列中有目的地进行基因改造，如点突变、插入、缺失等。
这种改造方式在药物研发、基因治疗等方面有广泛应用。
重叠延伸PCR可以实现在DNA两端同时进行定向变异，从而避免在后期回溯过程中的麻烦。
2.2 DNA连接DNA连接是指将不同组织来源的DNA片段进行连接的技术。
重叠延伸PCR在连接过程中，可以通过PCR技术将两个片段的连接点相互重叠，从而实现快速、准确的连接。
三、操作流程3.1 设计引物首先，需要根据实验需要，设计出两对带有同义语突变位点的引物组合。
3.2 预扩增将目的片段引物体系与目的DNA模板进行PCR扩增，以获得适当浓度的DNA模板。
3.3 扩增突变位点将模板进行分开再扩增，由于引物不具有重复序列，可以杜绝非特异性放大的情况发生。
3.4 扩增合成将扩增突变位点与预扩增产物进行重叠延伸PCR反应，合成所需DNA 片段。
3.5 二次PCR利用扩增产物进行二次PCR反应，获得所需突变的DNA产物。
四、优点4.1 准确性高在重叠延伸PCR中，引物端使用了一些具有重叠序列的引物，可以减少模板串扰，从而大大提高了反应的准确性。
4.2 可控性强由于引物设计合理、重叠合成区域明确，重叠延伸PCR能够实现精确控制产物长度，避免了延伸过程中产生多余的DNA序列。
4.3 操作简便重叠延伸PCR是一种简单、快速、方便的重组技术，操作简便，前期准备工作少。
五、结论重叠延伸PCR是一种高频使用的分子生物学技术手段，具有诸多优点。
在实际应用中，重叠延伸PCR能够实现定向变异、DNA连接等操作，为生物学和基因工程的研究提供了强有力的支持。
重叠延伸pcr引物设计原理
重叠延伸pcr引物设计原理以重叠延伸PCR引物设计原理为标题，本文将详细介绍重叠延伸PCR（Overlap Extension PCR）的原理和引物设计方法。
重叠延伸PCR是一种常用的基因工程技术，用于在DNA分子水平上进行特定DNA片段的定向突变、插入、删减等操作。
其基本原理是通过两轮PCR反应，将两个具有重叠序列的引物引导下的DNA片段进行扩增，并在扩增过程中通过引物设计实现特定的基因改造。
在重叠延伸PCR中，引物设计是关键步骤之一。
首先，需要设计两对引物，分别命名为引物A和引物B。
引物A和引物B的设计原则是：引物A和引物B的5'端都包含所需改造的目标序列，而3'端则包含与目标序列互补的序列。
这样，在PCR反应中，引物A和引物B的3'端互补部分可以通过两轮PCR反应的重叠延伸步骤，实现目标序列的重组。
同时，引物A和引物B的5'端还可以通过两轮PCR 反应的扩增步骤，将目标序列扩增出来。
在第一轮PCR反应中，引物A和引物B分别与目标序列的两个相邻区域发生引物特异性结合，导致目标序列的扩增。
在第二轮PCR 反应中，引物A和引物B的3'端互补部分通过重叠延伸步骤，使得目标序列的两个相邻区域连接在一起，形成重组的目标序列。
最终，通过两轮PCR反应，可以得到重组的目标序列。
引物设计时，需要注意以下几点：首先，引物A和引物B的长度应适当，一般在18-30个碱基对之间，过短的引物可能导致扩增产物的不稳定，而过长的引物可能导致扩增效率降低。
其次，引物A和引物B的Tm值应接近，以确保二者在PCR反应中有相似的扩增效率。
此外，引物A和引物B的5'端应尽量避免包含重复序列或剪切位点，以避免意外的扩增产物。
除了引物设计，重叠延伸PCR还需要注意反应条件的优化。
例如，PCR反应体系的优化、引物浓度的优化、退火温度的优化等都会影响重叠延伸PCR的结果。
此外，为了提高扩增效率，还可以考虑添加DNA聚合酶的增稳剂、聚乙二醇等物质。
重叠延伸PCR技术及其在生物学中的应用
的抗逆能力 。其具 有的综合抗逆 能力是在 特殊生态 环 境下长期发育进化形成 的， 对其抗逆机理及其生物 特性
进行系统研究有助于揭开新 的生物抗逆机制。
研究 人员通 过 对 新疆 木 耳 蘑 菇 的化 学 成分 分 析 后， 发现该 菌子 实体 中含有 ｌ ８种氨基酸 ， 菌盖 、 菌柄氨 基酸含 量（ ｒ ／ｋ ｇ ） 分别 是 １ ９ ． ４ ６和 ｌ ３ ． １ ４ ； ８种必需 氨基 酸含量分 别是 ９ ． ２ ６和 ２ ． ４ １ ； 饱和脂 肪 酸有粗 脂肪 、 棕 榈酸 、 硬脂 酸、 棕 榈油酸、 花生四烯酸 ， 在 菌盖和 菌柄含
生 物 学教 学 ２ ０ １ ３ 年（ 第３ ８ 卷） 第４ 期
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重 叠 延伸 Ｐ Ｃ Ｒ技 术 及 其在 生物 学 中的应 用
李 守宇 （ 江 苏 省 宜 兴 第 一 中 学２ １ ４ ２ ０ ６ ）
摘 要 重叠延伸 Ｐ Ｃ Ｒ技术是一种通 过寡 聚核苷酸链之 间重叠 的部分 互相搭桥 、 互 为模板 ， 通 过多次 Ｐ Ｃ Ｒ扩增 ， 从而获 得 目的 重叠延伸 Ｐ Ｃ Ｒ技术 片段基因合成 融合基因构建 基 因定点诱变 Ｄ Ｎ Ａ基因片段的方法。该技术高效 、 快捷 、 经济 ， 在基因功能研究方面显示 良好 的应用前景 。 关键词
１ 重叠延伸 Ｐ Ｃ Ｒ技术简介 重叠延伸 Ｐ Ｃ Ｒ技术 （ Ｓ Ｏ Ｅ Ｐ Ｃ Ｒ） 是采 用具 有互 补 末 端 的引物 ， 使 Ｐ Ｃ Ｒ产 物形 成 了重 叠链 ， 从而 在 随后 的扩增反应 中通 过重 叠链 的延伸 ， 将 不 同来 源 的扩增 片段重叠拼接起来 的技术 。
重叠延伸PCR
基因突变技术是蛋白质工程中应用的重要技术之一，可以有目的改变 DNA 序 列中的碱基。 它不仅可以阐明基因表达的调控机理， 还可利用研究蛋白质结 构与功能间的关系，改造天然蛋白质，使之更符合应用需求。 基因突变包括单 个碱基或整段序列的替换、基因片段的插入与删除等类型。定点突变的方法很 多，而基于 PCR 的定点突变技术由于其突变效率高、操作简单、耗时短、成 本低廉等优点而倍受瞩目。SOE PCR 运用非常广泛、灵活，不受突变位置及突 变类型的限制，利用此技术不仅能实现基因点突变， 还能便利地实现大片段的 插入及删除。
M的序列为5’-ATGCATGCTAGCTAGAACGCTACGCTGACTACCCCCTGATC-3’
N的序列为5’-ATGCTAGTAGCTAGCCCCCCCCAGGGGATAATTTTTTAAAACG-3’
首先要设计引物，假设引物的序列为：
M1:5’-ATGCATGCTAGCTAGAACGCT-3’
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er缓冲液引物f上游引物位于整个被扩增的目的序列5端的引物同dna负链互补同正链序列相同引物r下游引物位于整个被扩增的目的序列3端的引物同dna正链互补同负链序列相同引物设计两个基因一个命名为m一个命名为n
重叠延伸PCR
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1
概念
重叠延伸PCR技术(SOE PCR)是指在PCR技术的基础上，采用具有互补末端的 引物，使PCR产物形成了重叠链，通过重叠链的延伸，将不同来源的片段重叠 拼接起来的一项新技术。该技术可以很快获得其他依靠限制性内切酶消化的方 法难以得到的产物，其成功的关键是重叠互补引物的设计。SOE PCR在基因的 定点突变、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有着独特 的应用。
重叠延伸PCR技术
反应机理
F2 引物 F1 引物
5’ 3’ 3’ 5’
基因B
5’ 3’
R2 引物
3’ 5’
基因A
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
R1引物
加入酶，buffer等反应液。PCR仪中解链， 退火——单链模板结合
5’ 3’ 5’ 3’
3’ 5’ 3’ 5’ 加入F1引物、R2引物
5’ 3’
5’
3’
无目标产物
5’ 3’
F1 引物
3’ 5’
R2 引物
重叠延伸PCR技术
（SOE PCR）
1. 重叠延伸PCR技术的概念
• 重叠延伸PCR技术(SOE PCR)是指在PCR技术的基础上，采 用具有互补末端的引物,使PCR产物形成了重叠链,通过重叠链的 延伸,将不同来源的片段重叠拼接起来的一项新技术。该技术可以 很快获得依靠其它限制性内切酶消化的方法难以得到的产物，其 成功的关键是重叠互补引物的设计。SOE PCR在基因的定点突变、 长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有着独 特的应用。
答案： （1）越高 （2）引物2和引物3中存在互补配对片段，置于同一反应系统时它们会发生结合而失 去作用 （3）3 （4）2 （5）目的基因与载体结合 将重组DNA导入受体细胞
解析：重叠延伸PCR技术在扩增较长片段的DNA、不同来源的DNA片段拼接、 基因的定点诱变等方面有广泛的应用。老师要予以关注，在讲评中可适当拓展。G 与C碱基对之间是三个氢键，引物中G—C含量越多，越稳定。由图可知，因为引物 2、3有互补片段，但引物1、4没有互补片段。利用引物1、2进行扩增，可产生 两种DNA片段，利用引物3、4进行扩增，可产生 ，其中a、c 分别是以引物1和引物4扩增产生的DNA片段，是相同的DNA片段，b、d分别是以引 物2和引物3扩增的DNA片段，碱基序列是不同的，共三种。因为新的核苷酸链必须 从5′端到3′端，在第二阶段，含引物1和引物4的脱氧核苷酸链因为有互补的碱基序 列，而部分互补，并能互为模板进行延伸，但含引物2和引物3的脱氧核苷酸链虽 能部分互补，但因方向问题，不能延伸。
3个片段重叠延伸pcr比例
3个片段重叠延伸PCR比例PCR（聚合酶链式反应）是一种基因工程中常用的技术，通过在体外复制DNA片段，可以迅速扩增目标DNA序列。
3个片段重叠延伸PCR是一种特殊的PCR方法，它可以在同一反应中同时扩增3个相邻的DNA片段，并在这些片段之间引入重叠序列。
本文将介绍3个片段重叠延伸PCR的原理、操作步骤以及相关应用。
原理3个片段重叠延伸PCR的原理基于PCR的基本原理，通过两个反向引物和一个重叠引物，同时扩增3个相邻的DNA片段。
在引物设计上，每个片段的两个端部分分别与相邻片段的重叠序列相匹配，确保扩增时各片段能够连接起来。
重叠引物的设计需要考虑到引物的长度、GC含量和熔解温度等因素，以确保扩增效率和特异性。
在反应过程中，PCR反应液中含有4种核苷酸和聚合酶酶链，以及模板DNA和引物。
反应的温度循环包括变性、退火和延伸三个阶段，使引物与目标DNA序列进行特异性结合，聚合酶依次合成新的DNA链。
重叠引物在扩增过程中连接不同片段的DNA 段，最终得到完整的DNA序列。
操作步骤1.引物设计：根据目标DNA序列，设计两端引物和一个重叠引物。
两端引物的设计需考虑到其与相邻片段的重叠序列的匹配，重叠引物的设计需确保与各引物的熔解温度相近。
2.PCR反应体系组成：将所需核酸、引物和聚合酶按照比例准确加入PCR反应管中，确保反应体系配比正确。
3.温度循环：根据引物的特性和扩增片段的长度，设置合适的温度循环参数。
常规的循环程序包括变性（94-98°C）、退火（50-70°C）和延伸（68-72°C）等步骤。
4.分析扩增产物：可以通过琼脂糖凝胶电泳或其他方法，检测扩增产物的大小和纯度。
应用3个片段重叠延伸PCR在分子生物学研究中具有广泛的应用。
它可以用于基因克隆、基因组测序、遗传变异分析等领域。
在基因克隆中，3个片段重叠延伸PCR可以用于连接两个DNA片段之间的缺失序列，扩增目标片段并进行拼接。
生动形象地说一下重叠延伸PCR（非常详细！0_o）
生动形象地说一下重叠延伸PCR（非常详细！0_o）重叠延伸PCR本质上也是基本的PCR，不过引物不太一样。
两片段可以互为引物，甚至可以将重叠延伸PCR的产物理解为“引物二聚体”。
第1步：PCR获得两个（图中AB和CB）或者多个片段，临近两个片段之间须有重叠区（图中红色区域）。
产物可以纯化，也可以吸取几μL作为重叠PCR的模板。
第2步：以两个片段为例（图中A和B），AB的正链（B,上方）和CD的正链（D,下方）刚好可以在红色区域内匹配，匹配部分是3'端，有游离的-OH基团，可以延伸。
AB的负链（B,下）和CD的负链（C,上）也可以在红色区域内匹配，但是末端是5’端，不能延伸。
（直接的退火很关键，所以有些protocol会建议重叠PCR分两个程序进行，重叠区的Tm很关键，尽量设计得高一点，比如66~73℃，退火温度在61~68℃）第3步：第2步产生的重叠产物，可用上下游引物进行PCR扩增过程。
实际操作注意点引物设计：重叠互补引物的设计是重叠延伸PCR技术成功的关键。
相连引物间的重叠区域以15-20个碱基为宜，重叠区域中应尽量避免富含AT(ATTTA，AATAA、AATTAA等) 的序列，因为在片段合成过程中，接头区富含AT的区域极易发生错配。
Taq酶选择：为了最大限度地避免碱基的错配，重叠延伸 PCR 反应应避免使用普通 Taq酶，因为 T aq酶会在 PCR 产物末端加 A，从而可能会使产物移码突变。
一般采用高保真 DNA 聚合酶。
Taq酶会在末端加A，高保真酶有3’—5’的外切活性，基于重叠PCR原理和酶的性质，第一步和重叠PCR步骤至少有一步使用高保真酶（或者如Taq Plus、Es Taq之类的，有3’—5’的外切活性），如果第一步和重叠PCR都使用普通Taq可能重叠PCR会失败。
热循环条件：对于重叠延伸 PCR 反应，循环不宜过多，变性的温度也不宜过高，时间不宜过长。
高温会使 DNA 受到损伤，造成 DNA 酶终止合成。
重叠延伸pcr原理
重叠延伸pcr原理重叠延伸PCR（Overlap Extension PCR）是一种用于DNA片段重组的特殊PCR技术。
它的原理是通过两轮PCR反应，将两个不同的DNA片段在它们的重叠部分进行延伸，最终得到一个重组的DNA片段。
这种技术在分子生物学研究中有着广泛的应用，特别是在基因工程领域。
首先，我们来看一下重叠延伸PCR的基本原理。
在第一轮PCR中，我们需要设计两对引物，每对引物包含一个与目标DNA片段的末端相互重叠的序列。
这样，当PCR反应进行时，引物会将两个目标DNA片段的重叠部分进行延伸，形成两个带有重叠序列的DNA片段。
然后，在第二轮PCR中，我们使用这两个DNA片段作为模板，再次进行PCR反应。
这样，重叠部分会在第二轮PCR中连接起来，最终得到一个重组的DNA片段。
重叠延伸PCR的关键在于引物的设计。
引物的选择需要考虑到两个目标DNA片段的重叠部分，以及引物之间的相互作用。
通常情况下，引物的长度在20-30个碱基对之间，GC含量在40-60%之间，Tm值在55-65°C之间。
此外，引物的末端需要与目标DNA片段的重叠部分完全匹配，以确保延伸的准确性。
在实际操作中，重叠延伸PCR需要进行两轮PCR反应。
在第一轮PCR中，我们需要对引物的浓度、反应条件等进行优化，以确保两个目标DNA片段的重叠部分能够被准确延伸。
在第二轮PCR中，我们需要对引物的浓度、反应条件等进行进一步的优化，以确保重叠部分能够被准确连接。
此外，我们还需要对PCR产物进行酶切、测序等验证，以确保重组的DNA片段的准确性和完整性。
总的来说，重叠延伸PCR是一种用于DNA片段重组的特殊PCR技术，它的原理是通过两轮PCR反应，将两个不同的DNA片段在它们的重叠部分进行延伸，最终得到一个重组的DNA片段。
在实际操作中，我们需要对引物的设计、反应条件的优化、PCR产物的验证等进行精细的操作，以确保重组的DNA片段的准确性和完整性。
重叠延伸pcr实验步骤
重叠延伸pcr实验步骤
重叠延伸PCR（gene splicing by overlap extension PCR，简称SOEPCR）是一种利用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来的实验技术。
以下是其基本步骤：
准备基因样品，并确保它们的质量和浓度适合进行PCR。
根据实验设计，选择适当的引物。
这些引物应该具有互补的末端，以便在随后的扩增反应中形成重叠链。
进行第一轮PCR扩增，使用选择的引物。
这一步通常会产生包含重叠序列的PCR 产物。
在进行下一轮PCR之前，回收和纯化PCR产物，以确保最佳的扩增效果。
进行第二轮PCR扩增，将回收的PCR产物作为模板。
在引物中引入需要的限制性位点。
在第二轮PCR扩增过程中，只有右边的引物可以延伸，这是因为左边的引物与模板的结合位点被限制性位点阻挡。
在完成第二轮PCR后，回收和纯化产物。
将两个PCR产物混合在一起，进行延伸反应。
只有右边的引物可以延伸，因为左边的引物与模板的结合位点被限制性位点阻挡。
在延伸反应完成后，将产物作为模板进行第三轮PCR扩增。
在引物中引入需要的限制性位点。
在完成第三轮PCR后，回收和纯化产物。
对最终产物进行电泳分析或其他必要的检测，以确认实验结果。
叠加定理实验报告
叠加定理实验报告一、实验目的哎呀，做这个叠加定理实验呢，就是想看看在一个电路里，当有多个电源的时候，每个电源对电路的影响到底是啥样的。
就像是一群小伙伴一起干活，想知道每个小伙伴单独能干多少活似的。
通过这个实验，能更好地理解电路里电压、电流是怎么被各个电源影响的，这对以后学更复杂的电路知识可重要啦。
二、实验器材做这个实验得有不少东西呢。
首先得有电源吧，这就像干活的动力源。
然后是电阻，各种不同阻值的电阻就像是不同的障碍物，电流得从它们中间穿过。
还有导线，这导线就像是连接各个小伙伴的绳子，把电源、电阻都连在一起。
当然啦，还有电流表和电压表，这两个表可重要啦，电流表就像一个小侦探，专门探测电流的大小；电压表呢，就是专门查看电压的小卫士。
三、实验原理这个叠加定理啊，简单说就是在一个线性电路里，如果有多个电源，那么每个电源单独作用时在某一支路产生的电流或者电压，和它们一起作用时在这个支路产生的结果是可以叠加的。
这就好比是把每个小伙伴单独做的工作加起来，就等于他们一起做的工作总量一样。
不过要注意哦，这个定理是针对线性电路的，要是电路不是线性的，这个定理可就不适用啦。
四、实验步骤1. 先把电路按照电路图连接好。
连接的时候可得小心啦，就像搭积木一样，一块搭错了，整个结构可能就不稳啦。
要确保每个元件都连接得稳稳当当的，导线的接头也要接好，不然可能会接触不良。
2. 然后呢，让其中一个电源单独工作，把其他电源都关掉或者等效成短路或者开路（这要看具体情况哦）。
这时候用电流表和电压表分别测量各个支路的电流和电压，把数据记下来。
这就像是先让一个小伙伴单独干活，看看他能完成多少任务，然后记录下来。
3. 接着，换另外一个电源单独工作，重复上面的步骤，再把数据记好。
就这样，把每个电源单独工作时的数据都收集起来。
4. 最后，让所有电源一起工作，再测量一次各个支路的电流和电压。
这就像让所有小伙伴一起干活，看看最终的成果是啥样的。
五、实验数据电源情况支路1电流（A）支路2电流（A）支路1电压（V）支路2电压（V）-- --- --- --- ---电源1单独工作 0.5 0.3 3 2电源2单独工作 0.4 0.2 2.5 1.5电源1和电源2共同工作 0.9 0.5 5.5 3.5六、实验结果分析从实验数据能看出来，支路1的电流在电源1单独工作时是0.5A，电源2单独工作时是0.4A，当它们一起工作时是0.9A，这就很符合叠加定理，0.5 + 0.4 = 0.9呢。
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重叠延伸PCR实验
重叠延伸PCR技术（gene splicing by overlap extension PCR，简称SOEPCR）由于采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成了重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。
实验方法原理:
此技术利用PCR技术能够在体外进行有效的基因重组，而且不需要内切酶消化和连接酶处理，可利用这一技术很快获得其它依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物。
重叠延伸PCR技术成功的关键是重叠互补引物的设计。
重叠延伸PCR在基因的定点突变、融合基因的构建、长片段基因的合成、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有其广泛而独特的应用。
实验材料:
基因样品
仪器、耗材:
PCR仪
实验步骤:
1. 以引物a/b进行pcr1。
2. 以引物c/d进行pcr2。
3. 引物b/c中引入了需要的限制性位点。
4. 混合二者pcr产物，混合以前最好回收一下。
5. 进行pcr延伸反应，只有右面这个可以延伸。
6. 以延伸反应的产物为模板，以a/d为引物进行pcr。
7. 产物即为所需最终产物。